Inhibición in vitro de la secreción renal de OCT2 y MATE1 por fármacos antieméticos
Mar 18, 2022
bendito george1, Xia Wen1, Édgar A. Jaimes2, Melanie S. Alegría3,4,5,†y Lauren M. Aleksunes
Resumen:El transportador de cationes orgánicos 2 (OCT2) y la proteína de extrusión de toxinas y múltiples fármacos 1 (MATE1) median la secreción renal de fármacos. Estudios recientes sugieren que el ondansetrón, un 5-fármaco antagonista de HT3 utilizado para prevenir las náuseas y los vómitos, puede inhibirOCT2- y transporte mediado por MATE1-. El propósito de este estudio fue probar la capacidad de cinco 5-fármacos antagonistas de HT3 para inhibir laOCT2y transportadores MATE1. El transporte del sustrato de la sonda OCT2/MATE1 ASP plus se evaluó utilizando dos modelos: (1) HEK293riñóncélulas que sobreexpresan humanosOCT2o MATE1, y (2) células MDCK transfectadas con humanoOCT2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >dolasetrón (IC50: 27,4 µM). El ondansetrón (0.5–20 µM) inhibió el transporte transcelular basolateral a apical de ASP plus hasta en un 64 por ciento. Concentraciones más altas (10 y 20 µM) de palonosetrón, tropisetrón y dolasetrón redujeron de manera similar el transporte transcelular de ASP plus. En células OCT2-MATE1 MDCK doblemente transfectadas, el ondansetrón en concentraciones de 0,5 y 2,5 µM causó una acumulación intracelular significativa de ASP plus. En conjunto, estos datos sugieren que los 5-fármacos antagonistas de HT3 pueden inhibir la secreción renal de fármacos catiónicos al interferir con la función de OCT2 y/o MATE1.
Palabras clave:OCT2; COMPAÑERO1; catiónico; 5-antagonista de HT3;riñón; secreción; transporte
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1. Introducción
La secreción renal se logra mediante la captación y salida coordinadas de fármacos a través del epitelio tubular. En el caso de fármacos y sustancias tóxicas que son cationes orgánicos, su transporte transepitelial hacia el filtrado se logra primero mediante el transportador de cationes orgánicos 2 (OCT2) en la superficie basolateral y, posteriormente, mediante el transportador de extrusión de múltiples fármacos y toxinas 1 (MATE1) en el borde en cepillo membrana. Antes de descubrir los genes OCT2/SLC22A1 y MATE1/SLC47A1, se sabía que la secreción de cationes orgánicos podía inhibirse farmacológicamente [1]. Usando una variedad de enfoques experimentales en diferentes especies preclínicas, se demostró que los cationes orgánicos se someten a transporte activo y secreción renal [2–4]. Desde estas primeras observaciones, la investigación ha avanzado para comprender no solo los mecanismos moleculares de la secreción de cationes orgánicos, sino también el potencial de interacciones farmacológicas clínicamente relevantes luego de la interrupción de OCT2 y MATE1 (revisado en [5]).
Los antagonistas del receptor de serotonina 5-HT3 se han convertido en fármacos fundamentales para el tratamiento de las náuseas y los vómitos. La serotonina es liberada por las células enterocromafines del intestino delgado. 5-Los antagonistas de HT3 inhiben el canal iónico activado por ligando ionotrópico en los nervios aferentes del nervio vago y evitan el reflejo del vómito [6]. El ondansetrón fue el primer 5-antagonista de HT3 aprobado para prevenir las náuseas y los vómitos inducidos por la quimioterapia [7,8]. Desde entonces, se han desarrollado fármacos adicionales de esta clase (incluidos tropisetrón, granisetrón, dolasetrón y palonosetrón) [9]. Si bien la principal indicación terapéutica de los 5-antagonistas de HT3 ha sido la prevención de la quimioterapia y la emesis inducida por la radiación, también están aprobados para el tratamiento de las náuseas y los vómitos posoperatorios y se usan de manera no autorizada para tratar las náuseas matutinas, la hiperémesis gravídica , delirio posoperatorio y prurito [10-14].
Dada la naturaleza catiónica de los 5-antagonistas de HT3 (Figura 1), han surgido como sustratos e inhibidores de los transportadores OCT y MATE. Estudios in vitro han revelado que ondansetrón y tropisetrón son sustratos e inhibidores de OCT1 y OCT2 [15-20]. Además, se ha demostrado que los individuos con variantes de pérdida de función en el gen OCT1/SLC22A1 tienen una farmacocinética de tropisetrón alterada y una eficacia clínica mejorada [16]. Del mismo modo, el ondansetrón puede inhibir los transportadores MATE, lo que lleva a la acumulación renal del fármaco antidiabético metformina, así como a un aumento de la nefrotoxicidad del fármaco anticanceroso cisplatino [19]. En los seres humanos, el ondansetrón reduce el aclaramiento renal de metformina, presumiblemente al inhibir la salida de MATE1 [21]. Juntos, estos datos apuntan al potencial de los 5-antagonistas de HT3 para inhibir la secreción transepitelial de fármacos a través de OCT2 y MATE1. Por lo tanto, buscamos comparar sistemáticamente cinco 5-antagonistas de HT3 por su capacidad para inhibir el transporte mediado por OCT2 y MATE1-humano de un sustrato catiónico de sonda utilizando transfectados simples y dobles.riñóncélulas. Cabe destacar que el estudio actual se centró principalmente en MATE1, ya que los niveles de proteína MATE2-K en el ser humanoriñónSe ha demostrado previamente que la corteza está por debajo del límite inferior de cuantificación mediante espectrometría de masas [22].
2. Resultados
2.1. Caracterización de ASP plus como sustrato fluorescente en células HEK293 que sobreexpresan OCT2 y MATE1
Los estudios iniciales caracterizaron la captación de ASP plus en células que sobreexpresan un vector vacío (EV), OCT2 o MATE1 (Figura 2). ASP plus mostró una captación dependiente del tiempo (Figura 2A) y dependiente de la concentración (Figura 2B) en células que expresan OCT2- y MATE1-y mostró una cinética saturable (OCT2: Vmax 8,1 nmol/mg/min , Km 2,9 uM, R2 0,95; MATE1: Vmax 3,4 nmol/mg/min, Km 8,2 uM, R2 0,96). Las células EV exhibieron una acumulación mínima de ASP plus (Vmax 1,9 nmol/mg/min, Km 37,3 uM, R2 0,92). En base a estos hallazgos, se cuantificó la captación de ASP plus después de 1 minuto (rango lineal para el transporte de OCT2 y MATE1) a una concentración de 10 uM, lo que proporcionó suficiente sensibilidad para la detección de fluorescencia y la detección de 5-antagonistas de HT3 como inhibidores.
Para garantizar que estas condiciones reflejen el transporte activo de cada transportador, se determinaron los valores de IC5{{10}} de cimetidina, un inhibidor bien establecido de OCT2 y MATE1 (Figura 3 y Tabla 1). El IC50 para cimetidina fue de 24,5 土 4,0 uM en células que expresan OCT2-y de 0,23 土 0,2 uM en células que expresan MATE1-, de acuerdo con los datos publicados que muestran la inhibición de MATE1 en concentraciones más bajas [18,20]. La cimetidina no influyó en la captación de ASP plus en las células EV.
2.2. Inhibición del transporte mediado por OCT2- y MATE1- por fármaco antiemético en células HEK293
Se evaluaron cinco antagonistas de 5-HT3 diferentes (ondansetrón, palonosetrón, granisetrón, tropisetrón y dolasetrón) para determinar su inhibición del transporte de OCT2 y MATE1 en células HEK293 usando ASP plus como sustrato (Figura 3). Se observó una disminución dependiente de la concentración en la captación de ASP plus en células que expresaban OCT2- y MATE1- en presencia de los cinco 5-antagonistas de HT3 probados en un rango de concentraciones. Los valores IC50 para la inhibición de ASP más la acumulación por parte de los antagonistas de 5-HT3 utilizando los rangos de concentración probados se muestran en la Tabla 1. Con la excepción del granisetrón, los otros antagonistas de 5-HT3 inhibieron MATE1 con más potencia que antes. OCT2. El transporte mediado por OCT2-se inhibió hasta ~90 por ciento, mientras que el transporte mediado por MATE1-se inhibió hasta ~70 por ciento en las concentraciones probadas.
En general, la captación de ASP plus por las células EV no se vio alterada en gran medida por los 5-antagonistas de HT3. Sin embargo, se observó que palonosetrón y tropisetrón estimularon la captación adicional de ASP plus en las células EV y que la concentración más alta de granisetrón provocó una pequeña disminución en la acumulación de ASP plus.
2.3. Caracterización del transporte transcelular y la acumulación intracelular de ASP plus en OCT2/MATE1-que expresan células MDCK
Para investigar la contribución combinada de OCT2 y MATE1 en la secreción transepitelial, se realizaron experimentos posteriores en células MDCK que se polarizan con superficies basolaterales (OCT2) y apicales (MATE1). La expresión de la proteína OCT2 y MATE1 se confirmó en células MDCK doblemente transfectadas usando transferencia Western (Figura 4A). El transporte transcelular del sustrato de la sonda catiónica ASP plus (25 uM) se probó en estas células usando insertos Transwell. El transporte basolateral a apical (B-a-A) de ASP plus fue mucho mayor (hasta 2.8-veces a los 120 min) que el transporte apical a basolateral (A-a-B) en las células doblemente transfectadas con OCT2/MATE1 (Figura 4B). Se estimó que la proporción de eflujo B-a-A/A-a-B a los 120 min era de 2,7 para las células OCT2/MATE1 que soportan la secreción activa de ASP plus. Por el contrario, las células de control exhibieron ASP más transporte mucho más bajo en ambas direcciones en comparación con las células OCT2/MATE1. El transporte de B a A de ASP plus fue solo significativamente mayor en comparación con el transporte de A a B en las células de control a 90 (1,3-veces) y 120 min (1,7-veces). ). Todos los ensayos de inhibición adicionales se realizaron en la dirección B-a-A.
La capacidad de los productos químicos para inhibir ASP plus flux y acumularse en células doblemente transfectadas con OCT2/MATE1 en las condiciones de prueba especificadas se evaluó usando tres inhibidores de control positivo (cimetidina 5 y 50 uM, pirimetamina 1 uM y olanzapina 20 uM) (Figura 4C). La cimetidina es un inhibidor conocido de OCT2 y MATE1, con mayor potencia para MATE1 (Tabla 1) [18]. La pirimetamina es un inhibidor específico de MATE1 [23], mientras que se descubrió que la olanzapina inhibe OCT2 de manera más potente (Figura complementaria S1) [18,20]. Los tres productos químicos inhibieron el flujo transcelular de ASP plus (18 por ciento de cimetidina 5 uM, 40 por ciento de cimetidina 50 uM, 36 por ciento de pirimetamina 1 uM y 28 por ciento de olanzapina 20 uM a los 120 min).
La acumulación de ASP plus intracelularmente también se cuantificó en lisados a los 120 min. La cimetidina y la pirimetamina aumentaron la acumulación intracelular de ASP plus en 1.8- veces y 1.3- veces (principalmente debido a la inhibición de MATE1), respectivamente, mientras que la olanzapina disminuyó la acumulación intracelular de ASP plus en 51 por ciento (debido a la inhibición de OCT2). En las células de control, no se observó una inhibición significativa del transporte B-a-A de ASP plus en ninguno de los puntos de tiempo. En las células de control, tampoco hubo cambios significativos en la acumulación intracelular de ASP plus en comparación con las células de control del vehículo, excepto por una disminución modesta en la acumulación de ASP plus en presencia de olanzapina 20 uM.
2.4. Inhibición del transporte transcelular de ASP plus por 5-antagonistas de HT3 en OCT2/MATE1-que expresan células MDCK
Se evaluó la capacidad de los cinco 5-antagonistas de HT3 (ondansetrón, palonosetrón, granisetrón, tropisetrón y dolasetrón) para afectar el transporte transcelular y la acumulación intracelular de ASP plus en células doblemente transfectadas con OCT2/MATE1 (Figuras 5 y 6). Se incluyó cimetidina (50 uM) con cada experimento en un conjunto paralelo de Transwells como control positivo. Curiosamente, los cinco 5-antagonistas de HT3 exhibieron diversos grados de inhibición en el transporte transcelular B-a-A de ASP plus (Figura 5). En comparación con las células tratadas con vehículo, el ondansetrón inhibió el transporte de B a A de ASP plus de forma dependiente de la concentración, con una inhibición del 36 % a los 120 min en la concentración más alta probada (20 uM). El palonosetrón y el tropisetrón también mostraron una inhibición dependiente de la concentración de la secreción de ASP plus, que fue significativa a 10 y 20 uM para todos los puntos de tiempo. Se observó inhibición de la secreción de ASP plus con palonosetrón y tropisetrón a 20 uM. El dolasetrón a 10 y 20 uM inhibió la ASP más el transporte a los 120 min solamente. Por último, el granisetrón no alteró el transporte B-a-A de ASP plus en ninguna de las concentraciones probadas. Las células de control no mostraron inhibición significativa en el transporte B-a-A de ASP plus con ninguno de los 5-antagonistas de HT3 (datos no mostrados).
2.5. ASP más acumulación intracelular en OCT2/MATE1-que expresan células MDCK siguientes
Tratamiento con 5-antagonistas de HT3
Las bajas concentraciones (0.5 y 2.5 uM) de ondansetrón dieron como resultado un aumento de 1.3-veces en ASP intracelular más la acumulación en células que expresan OCT2/MATE1-, mientras que no hubo diferencia en comparación con vehículos a concentraciones más altas (10 y 20 uM) (Figura 6). Sin embargo, en las células de control, hubo una disminución (40 por ciento) en la acumulación de ASP plus a altas concentraciones de ondansetrón. En células OCT2/MATE1, tropisetrón y granisetrón aumentaron la acumulación de ASP plus (1,5 y 1,3-veces, respectivamente) a la concentración más alta (20 uM). No se observaron cambios significativos en ASP más acumulación con palonosetrón o dolasetrón.
3. Discusión
OCT2 y MATE1 son transportadores clave que coordinan la secreción renal de cationes orgánicos. Comparten una serie de sustratos superpuestos, como metformina, cisplatino, lamivudina y entecavir, así como 5-fármacos antagonistas de HT3 seleccionados [15–20,24]. Estudios anteriores han sugerido que los 5-antagonistas de HT3 también pueden inhibir el transporte por OCT2 y MATE1. En particular, se ha demostrado que ondansetrón reduce el transporte de cisplatino y metformina por MATE1 [19]. El estudio actual tuvo como objetivo ampliar este trabajo previo para comparar cinco 5-antagonistas de HT3 por su capacidad para inhibir OCT2 y MATE1 individualmente cuando se sobreexpresan en células HEK293 y cuando se coexpresan en células MDCK y se cultivan en insertos Transwell. El ondansetrón y el palonosetrón pudieron inhibir la captación de un químico catiónico de sonda, ASP plus, en células HEK293 que expresan OCT2 o MATE1, más notablemente, en concentraciones tan bajas como 0.1–0.5 uM . De manera similar, granisetrón, tropisetrón y dolasetrón también pudieron inhibir cada transportador (sin embargo, en concentraciones más altas). Utilizando células MDCK doblemente transfectadas con OCT2/MATE1, el ondansetrón inhibió la secreción de ASP plus basolateral a apical en todas las concentraciones probadas (0,5–20 uM), lo que solo se observó en concentraciones más altas para palonosetrón, tropisetrón y dolasetrón. Estos datos obtenidos utilizando un sustrato fluorescente de sonda sugieren el potencial de interacciones farmacológicas mediadas por OCT2- y MATE1-con antagonistas de 5-HT3.
Los datos generados en las células doblemente transfectadas con OCT2/MATE1 concuerdan en gran medida con los datos de HEK293, con la excepción del granisetrón. Ondansetron, palonosetron y tropisetron exhibieron una inhibición dependiente de la concentración del transporte B-a-A de ASP plus con el orden de potencias que refleja el observado con la inhibición de MATE1 observada en las células HEK293. Sorprendentemente, el granisetrón no mostró ninguna inhibición significativa en las células OCT2/MATE1 MDCK, incluso en concentraciones cinco veces superiores a la concentración IC50 observada en las células HEK293 que expresan OCT2 o MATE1. Debido a que las células MDCK se asemejan a las células tubulares nativas en mayor medida que las células HEK293, existe la posibilidad de que la disposición de granisetrón se altere debido a la expresión de transportadores ortólogos endógenos de OCT2 o MATE1, o potencialmente de otros transportadores. Por ejemplo, las células MDCK expresan en gran medida el transportador de glicoproteína P canina [25], lo que podría conducir a la salida de granisetrón. Apoyando esta especulación está el hecho de que un polimorfismo de un solo nucleótido en el transportador humano MDR1/ABCB1 mejoró la eficacia clínica del granisetrón para tratar la emesis [26]. Estos datos sugieren que el granisetrón puede ser un sustrato para la glicoproteína P canina, causando una alteración en la concentración intracelular expuesta al transportador MATE1.
Si bien hay mucha superposición entre los sustratos y los inhibidores de los transportadores OCT y MATE, existen distinciones. Las interacciones fármaco-fármaco basadas en el transportador a menudo pueden depender de la identidad del sustrato de la víctima que se evalúa, como se ha demostrado para OCT2 [27-29]. Para OCT2, la selección del sustrato catiónico tiene un impacto tanto cuantitativo como cualitativo en el grado y tipo de inhibición [27,28]. Por el contrario, la constante de Michaelis aparente del sustrato transportado y los valores de IC50 para la inhibición de MATE1 en cuatro sustratos diferentes fueron similares [30]. Estos datos sugerirían que existe un sitio de unión compartido para la interacción de sustratos e inhibidores en la superficie externa de hMATE1. Como resultado, las interacciones de los fármacos antagonistas de 5-HT3 con OCT2 y MATE1 pueden ocurrir a través de diferentes mecanismos, a pesar de su naturaleza catiónica compartida. Se necesitan estudios futuros para avanzar en el estudio actual utilizando un sustrato de sonda y evaluando las interacciones con sustratos de fármacos específicos como cimetidina, metformina y cisplatino.
Clases adicionales de medicamentos más allá de los 5-antagonistas de HT3 también se usan para prevenir las náuseas y los vómitos. En estudios preliminares, evaluamos la capacidad de otros fármacos antieméticos para inhibir el transporte de ASP plus mediado por OCT2 y MATE1-en células HEK293. Curiosamente, la olanzapina, la proclorperazina y la metoclopramida inhibieron la actividad de OCT2 en un rango de concentraciones (Figura complementaria S1). Ninguno de estos fármacos inhibió la actividad de MATE1 a una concentración de 10 uM (datos no mostrados). Otros antieméticos, incluidos aprepitant y dexametasona, no tuvieron impacto en la captación de ASP plus en células HEK293 que expresan OCT2- o MATE1- (datos no mostrados). Como resultado, puede existir la posibilidad de que otros fármacos antieméticos (olanzapina, proclorperazina y metoclopramida) coadministrados con 5-antagonistas de HT3 también afecten la secreción renal de cationes, sobre todo a través de su capacidad para inhibir la captación de OCT2.
Es importante considerar qué tan bien los modelos in vitro recapitulan las características del transporte endógeno en humanos.riñones. Los niveles de proteína humana OCT2 y MATE1 se han cuantificado previamente en células MDCK doblemente transfectadas mediante LC-MS/MS (hOCT2 y hMATE1 fueron 28,6 y 6,9 fmol/ug de proteína de membrana, respectivamente) [31]. En comparación, los estudios que determinan la expresión de proteínas en la corteza renal humana y las membranas renales humanas revelan una diferencia más modesta en la expresión entre los dos transportadores o incluso una mayor expresión de MATE1 (OCT2 7.4 pmol/mg, MATE{{14 }}.1 pmol/mg) [22] y (OCT2 5 fmol/ug, MATE1 10 fmol/ug) [32]. Estas diferencias entre los modelos in vitro y la expresión humana endógena de OCT2 y MATE1 deben tenerse en cuenta y tenerse en cuenta en el desarrollo de modelos farmacocinéticos de base fisiológica para las posibles interacciones farmacológicas catiónicas en los riñones.
El estudio actual se centró en gran medida en la secreción renal de fármacos catiónicos. Sin embargo, es importante reconocer que el hígado también expresa OCT1 y MATE1, que permiten la eliminación biliar de sustancias químicas catiónicas. Esto es importante porque los 5-antagonistas de HT3 difieren en su estructura, metabolismo, unión a proteínas y vías de eliminación. Estructuralmente, los antagonistas de los receptores 5-HT3 contienen una amina básica, un sistema de anillo aromático o heteroaromático y un carbonilo (o una estructura similar) que es coplanar a la región aromática (Figura 1) [33]. En particular, la estructura del resto de amina difiere para el ondansetrón e incluye un imidazol, mientras que los anillos de miembros 6- se incorporan en los otros antagonistas de HT3 5-. La relevancia de estas diferencias estructurales en la interacción con OCT2 y/o MATE1 requiere más investigación, pero podría explicar los efectos más significativos del ondansetrón en concentraciones más bajas. Además, algunos 5-antagonistas de HT3 son eliminados ampliamente por elriñonescomo padres o metabolitos (como palonosetrón y tropisetrón). Muchos de los 5-antagonistas de HT3 (incluidos ondansetrón, tropisetrón, palonosetrón y granisetrón) son altamente metabolizados (48 a 95 por ciento) por las enzimas del citocromo P450 en el hígado. Recientemente, los estudios han demostrado que los metabolitos pueden desempeñar un papel más importante de lo que se pensaba en las interacciones farmacológicas [34]. Se justifican más pruebas del transporte de OCT2 y MATE1 con los principales metabolitos de 5-antagonistas de HT3 que superen el 25 % de la exposición sistémica original. Asimismo, dentro de la clase química, existen fármacos con vidas medias cortas (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
Según la 2020 FDA Guidance for In Vitro Metabolism and Transporter-Mediad Drug-Drug Interaction Studies [35], un fármaco tiene el potencial de inhibir el transportador in vivo si: el valor Cmax (no unido)/IC50 es mayor o igual a 0,1. Según estas pautas, los valores MATE1 Cmax/IC50 para ondansetrón indican posibles interacciones farmacológicas in vivo utilizando ASP plus como sustrato de sonda. La comparación de los valores de IC50 para los otros 5-antagonistas de HT3 con sus valores de Cmax (rango de nanomolar alto a micromolar bajo) no sugeriría un riesgo de interacción farmacológica, al menos con ASP plus como sustrato víctima. Del mismo modo, actualmente no conocemos las concentraciones intrarrenales de 5-antagonistas de HT3, lo que sería importante para evaluar las posibles interacciones farmacológicas de MATE1. Hay datos clínicos limitados que evalúan las interacciones farmacológicas relacionadas con ondansetrón con sustratos OCT/MATE. Por ejemplo, el ondansetrón aumenta los niveles de creatinina y metformina en sujetos sanos debido a la inhibición del transportador renal [21,36]. Curiosamente, el ondansetrón no solo redujo la eliminación renal de metformina, sino que también mejoró las medidas de tolerancia a la glucosa [21]. En otros estudios clínicos, se informó que el ondansetrón aumenta la nefrotoxicidad de un fármaco sustrato al alterar potencialmente la secreción mediada por transportadores dentro delriñón[37–39]. Juntos, estos datos justifican una mayor investigación de las interacciones farmacológicas de ondansetrón a través de la inhibición de los transportadores OCT y MATE.
En resumen, estos datos in vitro indican que muchos de los 5-antagonistas de HT3 tienen una mayor potencia hacia la inhibición de MATE1, lo que aumenta el potencial de una mayor concentración tubular de fármacos catiónicos. Además, el ondansetrón fue lo suficientemente potente como para aumentar la concentración intracelular de un sustrato de sonda, ASP plus, en concentraciones cercanas a la Cmax clínicamente relevante. Estos datos concuerdan con estudios previos in vivo en ratones en los que se observó un aumento de la nefrotoxicidad mediada por cisplatino con la administración concomitante de ondansetrón [19]. Con base en los criterios actuales para evaluar el potencial de interacción clínica entre medicamentos, los otros 5-antagonistas de HT3, así como los medicamentos antieméticos probados en nuestro estudio, probablemente presenten menos riesgo de una interacción farmacológica clínicamente relevante debido a una eficacia terapéutica mucho menor. concentraciones plasmáticas y constantes de inhibición más altas.
4. Materiales y Métodos
4.1. quimicos
El yoduro de 4-(4-(dimetilamino)estiril)-N-metilpiridinio (ASP plus) se adquirió de Life Technologies (Grand Island, NY, EE. UU.). El tropisetrón se adquirió de Abcam (Cambridge, MA, EE. UU.). Todos los demás productos químicos son de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
4.2. Líneas celulares y cultivo celular
La Dra. Kathy Giacomini de la Universidad de California, San Francisco. Las células HEK293 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 ug/ml y higromicina 200 ug/ml B. Vector (pcDNA3. 1 plus y pcDNA3.1/Hygro( plus )) y las líneas celulares de riñón canino (MDCK) Madin-Darby transfectadas doblemente con OCT2/MATE humano fueron generosamente proporcionadas por la Dra. Joanne Wang de la Universidad de Washington, Seattle, WA. Las células MDCK se mantuvieron en medio mínimo esencial (MEM) complementado con suero fetal bovino al 10 %, 500 ug/ml de G418 y 200 ug/ml de higromicina B. Todas las líneas celulares se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C con 5 % de CO2.
4.3. Ensayos de inhibición de captación y eflux en células HEK293
Se sembraron células HEK293 con sobreexpresión de OCT2- y MATE1-en placas de pocillos 24-recubiertas con poli-D-lisina transparente (Fisher Scientific, Hanover Park, IL, EE. UU.) y se cultivaron durante 24 h hasta aproximadamente un 90 por ciento de confluencia. Después de lavar una vez con solución salina tamponada de Hank (HBSS) precalentada, las células se preincubaron durante 30 minutos a 37 °C con varios 5-antagonistas de HT3 para células OCT2 o en una solución de NH4Cl 30 mM en HBSS a pH 6,5 para células MATE1 para células intracelulares. acidificación. La captación en las células OCT2 se inició mediante la exposición a 10 uM de sustrato fluorescente ASP más directamente en los medios de incubación. La absorción en las células MATE1 se inició mediante la aplicación de HBSS a pH 7,4 que contenía 5-antagonistas de HT3 y 10 uM de sustrato fluorescente ASP plus. Después de incubar durante 1 min a 37 °C en un agitador, se detuvo la absorción del sustrato añadiendo HBSS enfriado con hielo que contenía 500 uM de cimetidina. Se retiraron los medios y se lavaron cuatro veces con HBSS enfriado con hielo. Las células se lisaron con Triton X al 1 por ciento-100. La fluorescencia se detectó utilizando un lector de microplacas Spectramax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) en las siguientes longitudes de onda (Excitación 485 nm/Emisión 495 nm). La fluorescencia intracelular se normalizó a la concentración de proteína total de los lisados celulares de cada pocillo utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE. UU.). Los experimentos se repitieron tres veces por separado, con tres o cuatro repeticiones en cada experimento.
4.4. Estudios de Transwell en células MDCK-OCT2/MATE1
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o*cm2 usando un voltímetro epitelial, EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL). La formación adecuada de uniones estrechas también se verificó mediante la medición de la permeabilidad pasiva del amarillo lucifer en la dirección basolateral a apical (B a A). Se aplicó amarillo Lucifer (20 uM) a la cámara basolateral durante 1 hy se recogieron los medios de la cámara apical. Se leyó la fluorescencia amarilla de Lucifer a una longitud de onda de excitación de 430 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm. Los valores promedio de permeabilidad pasiva (Papp) fueron 7 × 10-7 cm/s, lo cual está en línea con los valores de la literatura [40].
Después de lavar las células una vez con solución salina tamponada de Hank (HBSS) pH 7,4, se iniciaron los estudios de transporte después de aspirar el tampón de lavado de las cámaras apical y basal. Las células se incubaron con 5-antagonistas de HT3 en la cámara apical en HBSS pH 6.0 y 5-antagonistas de HT3 con ASP plus (25 uM) en la cámara basolateral en HBSS pH 7,4 y se incubaron a 37 oC durante 120 min. Para medir el transporte transcelular dependiente del tiempo, se recogió una alícuota del medio de incubación (100 uL) de la cámara apical (cámara receptora) a los 40, 60, 90 y 120 min y se reemplazó con un volumen igual de tampón fresco que contenía {{ 19}}Antagónico de HT3 o el químico de control positivo en la concentración original. Después de 120 min, se retiraron los medios de tratamiento y los Transwell se lavaron tres veces con HBSS enfriado con hielo. Las células se lisaron con Triton X al 1 por ciento-100. La fluorescencia se detectó utilizando el lector de microplacas Spectramax en las siguientes longitudes de onda (Excitación 485 nm/Emisión 495 nm). La fluorescencia intracelular se normalizó a la concentración total de proteínas de los lisados celulares de cada transpocillo utilizando el ensayo BCA. Los experimentos se realizaron en tres insertos Transwell individuales.
4.5. Análisis estadístico
Se utilizó GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.) para el análisis estadístico. Km y Vmax se calcularon usando regresión no lineal (ecuación de cinética enzimática de Michaelis-Menten, (Y=Vmax × X/(Km más X), ajuste para mínimos cuadrados). Los datos con dos variables se analizaron usando un ANOVA de una vía seguido de ANOVA de una vía y/o prueba posthoc de Dunnett para comparaciones múltiples.Los valores de IC50 se calcularon mediante una regresión no lineal para ajustar mínimos cuadrados.Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas en p <>
Materiales complementarios:Los siguientes están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22126439/s1.
Contribuciones de autor:Conceptualización, BG, MSJ, LMA; metodología, BG, XW; análisis formal, BG, LMA; recursos, LMA; redacción—preparación del borrador original, BG, LMA; redacción: revisión y edición, MSJ, LMA; administración de proyectos, LMA; adquisición de fondos, MSJ, EAJ, LMA Todos los autores han leído y están de acuerdo con la versión publicada del manuscrito.
Fondos:Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (Subvención GM123330) y el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental (subvenciones ES005022, ES007148), el Instituto Nacional del Cáncer (Subvenciones CA072720, CA046934, CA008748) y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (Grant DK093903), componentes de los Institutos Nacionales de Salud.
Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No corresponde.
Declaración de consentimiento informado:No aplica.
Declaración de disponibilidad de datos:No aplica.
Expresiones de gratitud:Agradecemos enormemente las generosas líneas de células transportadoras HEK293 de Kathy Giacomini y las líneas de células MDCK transfectadas de Joanne Wang.
Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
Referencias
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