La administración in vivo de consorcios bacterianos intestinales replica los metabotipos A y B de urolitina en un modelo de rata no productora de urolitinaⅠ
Dec 25, 2023
Durante décadas, el consumo de elagitaninos (ET) y ácido elágico (EA) se ha asociado con numerosos efectos biológicos, incluidas actividades antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatorias, antibacterianas y antirreplicación del VIH.1 Sin embargo, la absorción y biodisponibilidad de los ET y los AE son muy pobres. Estudios anteriores en humanos encontraron que la excreción urinaria de EA y un EA-O-glucurónido es menos del 1% de la ingesta.2,3 Sin embargo, si bien la absorción de ET y EA es baja, la microbiota del colon los metaboliza aún más a urolitinas. (Uros), que son responsables, al menos parcialmente, de los efectos beneficiosos de los alimentos ricos en ET y (o) EA.1,4
Primero, el EA se libera a través de la hidrólisis de los enlaces éster de ET por la enzima conocida como elagitanasa.5 El EA sufre una degradación adicional, produciendo derivados de 6H-dibenzo[b,d]piran-6-ona llamados Uros. Esta cascada de reacciones comienza con la escisión del anillo de lactona por una enzima lactonasa, lo que da como resultado ácido luteico, que luego se descarboxila a pentahidroxi-Uro (Uro-M5). La deshidroxilación consecutiva lo convierte en tetrahidroxi-Uros (Uro-D, Uro-E y Uro-M6) y trihidroxi-Uros (Uro-C, UroM7 y Uro-G), para finalmente producir dihidroxi-Uros (Uro-A andisoUro-A) y monohidroxi-Uro (Uro-B), siendo este último generalmente detectado cuando también se produce isoUro-A.1
La amplia variación de los perfiles metabólicos de Uro detectada en humanos después de consumir alimentos ricos en ET indica diferencias interindividuales en la microbiota colónica responsable de la degradación de ET.6–8 Las numerosas interacciones posibles entre las bacterias del colon y el organismo huésped podrían explicar los diferentes destinos metabólicos de la dieta (poli )fenoles.6,9 Esta interacción bidireccional entre la microbiota intestinal y los (poli)fenoles ha llevado a la comunidad científica a agrupar a la población en función de sufenotipo metabólico (tipo de metal) para explicar las diferencias en los efectos de los polifenoles.10,11 Más específicamente, según el metabolismo de ET y EA, los individuos pueden estratificarse en urometabotipos (UM) asociados con la composición y funcionalidad del microbioma intestinal.7,8,12
Se han descrito tres UM humanas (UM-A, UM-B y UM-0) relacionadas con tres perfiles diferentes de producción de Uro en poblaciones occidentales y orientales.13–15 En este sentido, los individuos con metabotipo A (UM-A) producen varios Uros intermedios pero sólo urolitina A (Uro-A), el principal Uro absorbido en este UM, al final de la vía catabólica microbiana. Los individuos del metabotipo B (UM-B) producen algunos Uros intermedios y tres Uros finales, es decir, urolitina B (Uro-B), urolitina A (IsoUro-A) y Uro-A, que son los principales uros absorbidos en UM-B. Por lo tanto, los Uros intermedios podrían actuar principalmente en el intestino, mientras que los finales podrían tener efectos locales y sistémicos.6 En cambio, los individuos con metal tipo 0 (UM-0) no pueden producir estos Uros finales (sólo los Hasta el momento se ha detectado el precursor Urolitina-M5, que no se absorbe en el intestino).
Se han observado diferencias en los perfiles de UM entre UM y a lo largo del intestino grueso, mostrando una producción de uro predominante en la región del colon distal.16–19 Sorprendentemente, el porcentaje de UM-0 en voluntarios sanos españoles y chinos es aproximadamente del 10% y podría ser incluso mayor en la población estadounidense.13–15 Se ha identificado que los géneros bacterianos Gordonibacter y Ellagibacter son capaces de metabolizar EA en algunos Uros.20–23Sin embargo, se encontró que algunos intermediarios (por ejemplo, Uro-D, Uro-E, Uro- M7, y Uro-G) y Uros finales (Uro-A y Uro-B) no se producen en cultivos puros de estas bacterias, lo que implica la necesidad de que otras bacterias completen el conjunto de Uros que configuran tanto la UM-A como la UM-B. . Recientemente, se han identificado los consorcios de bacterias intestinales implicados en el metabolismo de los AE para producir los metabotipos productores de uroproductos (UM-A y UM-B) in vitro.24
Los consorcios bacterianos que contienen los géneros Gordonibacter plus Enterocloster y Ellagibacter plus Enterocloster produjeron in vitro las urolitinas asociadas con UM-A y UM-B, respectivamente.25 Sin embargo, la capacidad de estos consorcios bacterianos para replicar perfiles de Uro humanos asociados con UM-A y UM-B in vivo aún se desconoce. Además, la seguridad del consumo de estas bacterias productoras de uro como nuevos probióticos aún es incierta, ya que no se ha probado previamente en animales ni en humanos. En el presente estudio, se evaluó la capacidad de los consorcios bacterianos anteriores para colonizar el intestino de ratas no productoras de uro (similares a UM-0-) y convertirlas en uroproductores que imitan a UM-A y UM-B, respectivamente. También se evaluó la seguridad de estos consorcios bacterianos. Además, se desarrollaron dos nuevos procedimientos basados en PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para detectar y cuantificar Ellagibacter y Enterocloster en muestras fecales.
Materiales y métodos
Químicos y reactivos.
Los uros fueron sintetizados y purificados químicamente por VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, España). EA se compró a Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.). La solución salina tampón fosfato (PBS) se obtuvo de FisherScientific (EE. UU.), mientras que el metanol, el etanol y el ácido fórmico se obtuvieron de Panreac Química (Barcelona, España). Los disolventes de calidad para cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) se adquirieron de JT Baker (Deventer, Países Bajos). Durante todo el estudio se utilizó agua Millipore ultrapura (Bedford, MA, EE. UU.). Todos los productos químicos y reactivos eran de calidad analítica.
Preparación de consorcios bacterianos.
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T y Enterocloster atornillado CEBASS4A9, todos ellos aislados e identificados en nuestro laboratorio (CEBAS-CSIC, España), se cultivaron anaeróbicamente en 5 mL de Wilkins. -Tubos de medio anaerobio Chalgren (WAM, Oxoid) a 37 grados durante 48 h en una cámara anaeróbica Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, Gales del Sur, Reino Unido) y resuspendidos en PBS suplementado con glicerol al 10 % y clorhidrato de L-cisteína al 0,05 % (PanReac Química, Barcelona, España). Después de la incubación anaeróbica, se prepararon consorcios.24,25 Brevemente, el "consorcio bacteriano A" contenía G. cepas de urolithinfaciens y E. bolteae; el "consorcio bacteriano B" contenía cultivos de E. isourolithinifaciens y E. bolteae; y el "cóctel de control" contenía PBS estéril con 10% de glicerol y 0,05% de clorhidrato de L-cisteína. Antes de la administración, todos los cócteles se distribuyeron en alícuotas de 3,5 ml y se mantuvieron a -80 grados.
Animales, dietas y diseño experimental.
El protocolo experimental (referencia 624/2020) fue aprobado por el gobierno local, el Comité de Bioética del Consejo Nacional de Investigación (Madrid, España) y el Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad de Murcia (España). Los experimentos siguieron las recomendaciones de la Unión Europea en materia de experimentación con animales (Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos). Se obtuvieron ratas Wistar (n=18; 9 hembras y 9 machos) que pesaban 240 ± 31 g de Envigo (Barcelona, España). Este modelo de rata fue seleccionado en base a su incapacidad para producir Uros observada en nuestros estudios preliminares en los que se probaron muestras fecales de diferentes modelos de rata. Se formaron tres grupos (A, B y C) asignando aleatoriamente 6 animales cada uno (3 ratas hembras y 3 machos). ) por grupo (Fig. 1).
Cada grupo de ratas se alojó en dos jaulas diferentes, divididas por sexo, en una habitación con un ambiente de temperatura controlada (22 ± 2 grados) con 55 ± 10% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad controlado (12 h). Las ratas recibieron una dieta estándar (Teklad, Barcelona, España) que contenía (%/100 g de peso fresco) 14,3% de proteínas (harina de gluten de maíz), 48% de carbohidratos (trigo molido, trigo molido, maíz molido) y 4% de grasa (aceite de soja). ), 2,9 kcal g−1 de densidad energética y 4,1% de fibra cruda, suplementado con AE en polvo mayor o igual al 95% de pureza (3,6 mg por 100 g de alimento). El EA se mezcló homogéneamente con pienso estándar molido, se volvió a granular y se liofilizó. La dieta enriquecida con EA se almacenó lejos de la humedad y la luz. La dosis de EA administrada alLa dieta de ratas en la dieta fue de aproximadamente 0.72 mg por rata por día (dieta EA 1×), una dosis equivalente humana de 41 mg día-1.26 Todos los grupos fueron alimentados con la dieta EA 1× y agua del grifo ad libitum durante todo el experimento ( 5 semanas). Dado que el AE detectado en las muestras fecales fue bajo durante la primera semana, se añadió algo de AE adicional en los días siguientes. En la semana 3, se administró por vía oral mediante sonda forzada a los animales una dosis adicional de 1,5 mg de EA por rata y día disueltos en agua (= EA total 3x dieta), que se administró solo durante 1 semana. Finalmente, en la semana 4, se agregaron ≈5 g de nueces por rata por día (otra fuente de EA) a la dieta EA 1× y se mantuvieron hasta el final del estudio para evaluar el impacto de la matriz alimenticia que contiene EA en la capacidad de las bacterias. para producir uros. Se midieron el peso, la ingesta de alimentos y agua todos los días. Los consorcios de bacterias intestinales se administraron por vía oral mediante sonda. El grupo A recibió 500 µl de cóctel bacteriano A, el grupo B recibió 500 µl de cóctel bacteriano B y el grupo C (control) recibió 500 µl de PBS. La sonda oral se realizó cada 2 días durante las dos primeras semanas y cada día durante las 2 semanas siguientes. En la última semana (días 28 al 32), los animales continuaron con la misma dieta suplementada con AE y nueces pero sin administración de bacterias orales. Al final del estudio, los animales fueron sacrificados utilizando una cámara de CO2.
Procedimientos de muestreo
Se recolectaron muestras fecales durante el estudio para el análisis de uro mediante UPLC-ESI-QTOF-MS/MS y microbiota intestinal mediante secuenciación del gen 16S rRNA y qPCR. La sangre se extrajo en diferentes momentos (línea de base, día 28 y final del estudio) para análisis hematológicos y bioquímicos séricos. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola (≈500 µL) y se recogieron en tubos que contenían heparina al inicio y en los días 28 y 32 (Fig. 1). La separación del plasma se realizó inmediatamente mediante centrifugación a 3000 g durante 10 minutos a 4 grados y se congeló a - 80 grados hasta mayor determinación de variables serobioquímicas. Se recogieron, pesaron y examinaron el hígado, los riñones y el bazo para detectar cualquier diferencia morfológica en el momento del sacrificio.
Diseño y optimización de los cebadores y sonda para la cuantificación de Ellagibacter y Enterocloster mediante qPCR.
Las secuencias de los genes 16S rRNA de Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T y E. Bolted CEBAS S4A9 se obtuvieron de la base de datos GenBank (base de datos EMBL). Las secuencias se alinearon con los géneros bacterianos filogenéticamente cercanos utilizando el software de Análisis de Genética Evolutiva Molecular (MEGA 11) y se inspeccionaron en busca de regiones de secuencias conservadas y variables para diseñar los cebadores y la sonda para detectar y cuantificar Ellagibacter y Enterocloster (Tabla 1). Los cebadores y la sonda se diseñaron y validaron con las herramientas Primer Quest y Oligo Analyzer, respectivamente (Integrated DNATechnologies, Inc., Bélgica). La sonda TaqMan se marcó en los extremos 5′ y 3′ con un grupo 6-carboxi-fluoresceína. (6FAM) y un extintor de moras(BBQ), respectivamente. La qPCR se realizó utilizando un sistema de detección de secuencias ABI 7500. Las concentraciones finales de cada cebador y sonda fueron 300 y 375 nM para Ellagibacter y 200 y 500 nM para Enterocloster. Se llevó a cabo un protocolo qPCR convencional para la amplificación del ADN de Ellagibacter yEnterocloster, respectivamente. El perfil de rampa para la amplificación de Ellagibacter fue 1 ciclo a 95 grados durante 5 min, seguido de 45 ciclos de 95 grados durante 15 s, 50 grados durante 40 s y 72 grados durante 31 s. Finalmente, se agregó 1 ciclo a 72 grados durante 5 min. . El perfil de rampa para la amplificación de Enterocloster fue de 1 ciclo a 95 grados durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 grados durante 15 s, 65 grados durante 40 s y 72 grados durante 31 s. Finalmente, se añadió 1 ciclo a 72 grados durante 5 min.
Extracción de ADN fecal y análisis microbiano intestinal.
La extracción de ADN de muestras fecales se realizó con el kit de purificación de ADN tisular NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Alemania), según las instrucciones del fabricante con algunas modificaciones. El ADN se cuantificó mediante fluorimetría (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, Reino Unido) y la pureza se midió a partir de la relación de absorbancia a una longitud de onda de 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, Reino Unido). ). La composición de la microbiota intestinal se determinó secuenciando las regiones variables V3 y V4 del gen 16S rRNA siguiendo los protocolos de Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EE. UU.) con una longitud de lectura de 2 × 300 pb de ejecución de extremos emparejados (MiSeqReagent Kit v3 Illumina Inc.). La secuenciación metagenómica se realizó en una plataforma MiSeq-Illumina (servicio de secuenciación FISABIO, España). El procesamiento de datos, la eliminación de secuencias quiméricas, la alineación de secuencias y la agrupación de secuencias del gen 16S rRNA se realizaron como se describe en otra parte para obtener la clasificación taxonómica.8,27 La amplificación del ADN de Gordonibacter se logró en un sistema qPCR ABI 7500 como se describió anteriormente.19,28 Se utilizaron cebadores y sondas específicos diseñados en el presente estudio siguiendo el protocolo qPCR descrito anteriormente. Para la cuantificación se utilizaron curvas estándar de ADN genómico de Gordonibacter, Enterocloster y Ellagibacter. Todas las muestras fecales se analizaron por triplicado.
Extracción, detección y cuantificación de urolitinas en muestras fecales.
Se extrajeron muestras fecales ({{0}}.2–0.5 g), en una proporción de 1:10, con una solución de MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), acidificado con 0.1 % HCl y homogeneizado mediante agitación vortex durante 2 min y agitación a 1500 rpm a temperatura ambiente durante 10 min en un calentador de bloque. La suspensión se centrifugó a 14 000g a 4 grados durante 10 minutos y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de membrana de PVDF de 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) y se diluyó 3 veces con MeOH (ácido fórmico al 0,1%). ) antes de la inyección en un sistema UPLC-ESI-QTOF-MS. Se utilizó un sistema UPLC (Agilent 1290 Infinity) acoplado a un sistema LC/MS de tiempo de vuelo (QTOF) cuadrupolo (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) para analizar los metabolitos fecales utilizando un método de elución en gradiente como se describió anteriormente. .29,30 Brevemente, la separación se llevó a cabo en una columna de fase inversa Poroshell 120 EC-C18, utilizando agua y acetonitrilo, ambos acidificados con ácido fórmico al 0,1%, como fases móviles. El caudal fue de 0,4 ml min-1 y el volumen de inyección fue de 5 µl. Para el procesamiento de datos se utilizó el software MassHunter Qualitative Analysis (versión B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania). Todos los metabolitos se identificaron mediante comparación directa con estándares y se confirmaron por su masa molecular. Se obtuvieron curvas de calibración para EA y los diferentes Uros con buena linealidad (R2 > 0,99).
Hematología y química clínica.
Las variables hematológicas se determinaron en sangre heparinizada mediante un analizador hematológico automatizado con software específico para muestras de sangre de ratas (AVDIA 120, Siemens, Munich, Alemania). Las variables analizadas fueron volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), concentración de hemoglobina corpuscular media (MCHC), distribución de eritrocitos (RDW), volumen medio de plaquetas (MPV), índice de plaquetas (PCT), ancho de distribución de plaquetas (PDW). , componente plaquetario medio (MPC), masa plaquetaria media (MPM), recuento de plaquetas (PLT), contenido de hemoglobina de reticulocitos (CHr) y volumen corpuscular medio de reticulocitos (MCVr). Las variables bioquímicas del plasma, el calcio (Ca) y el fósforo (P) se analizaron utilizando un analizador de química y toxicología Olympus AU400 (Beckman Coulter, California, EE. UU.). Las variables bioquímicas fueron proteínas totales (PROT), albúmina (ALBU), globulina (GLOB), creatinina (CREA), glucosa (GLUC), colesterol (CHOL), triglicéridos (TRIGL), fosfatasa alcalina (ALP), gamma-glutamil transpeptidasa ( GGT), aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT). Finalmente, los niveles de tiroxina (T4) se analizaron mediante un sistema de inmunoensayo IMMULITE® 1000 (Siemens).
análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). El análisis estadístico se realizó con el software SPSS versión 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE. UU.), y las diferencias conp < 0.05 se consideraron estadísticamente significativos. La normalidad de los datos se evaluó con la prueba de Shapiro-Wilk. Las comparaciones entre diferentes grupos de tratamiento se llevaron a cabo utilizando análisis de varianza medidos repetidos (RM ANOVA) con la prueba post hoc T3 de Tukey o Dunnett, dependiendo de si los datos siguieron una distribución normal o no normal, respectivamente. Las diferencias entre hombres y mujeres se exploraron utilizando la prueba t de Student pareada o la prueba de rangos con signos de Wilcoxon cuando los datos tenían una distribución normal o no normal, respectivamente. Se utilizó el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal de chi-cuadrado (LEfSe) para detectar características bacterianas diferenciales entre grupos. La correlación de Pearson se utilizó para analizar posibles asociaciones entre variables en datos con distribución normal, mientras que la correlación de Spearman se aplicó en datos con distribución no normal. Los gráficos de datos se realizaron utilizando Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San José, CA, EE. UU.).
Medicina herbaria natural para aliviar el estreñimiento-Cistanche
Cistanche es un género de plantas parásitas que pertenece a la familia Orobanchaceae. Estas plantas son conocidas por sus propiedades medicinales y se han utilizado en la Medicina Tradicional China (MTC) durante siglos. Las especies de Cistanche se encuentran predominantemente en regiones áridas y desérticas de China, Mongolia y otras partes de Asia Central. Las plantas de cistanche se caracterizan por sus tallos carnosos y amarillentos y son muy valoradas por sus potenciales beneficios para la salud. En la medicina tradicional china, se cree que Cistanche tiene propiedades tónicas y se usa comúnmente para nutrir los riñones, mejorar la vitalidad y apoyar la función sexual. También se utiliza para abordar problemas de envejecimiento, fatiga y bienestar general. Si bien Cistanche tiene una larga historia de uso en la medicina tradicional, la investigación científica sobre su eficacia y seguridad está en curso y es limitada. Sin embargo, contiene varios compuestos bioactivos como glucósidos feniletanoides, iridoides, lignanos y polisacáridos, que pueden contribuir a sus efectos medicinales.
Wecistanche'scistanche en polvo, tabletas de cistanche, cápsulas de cistanche,y otros productos se desarrollan utilizandodesiertocistancheComo materias primas, todos los cuales tienen un buen efecto para aliviar el estreñimiento. El mecanismo específico es el siguiente: Se cree que Cistanche tiene beneficios potenciales para aliviar el estreñimiento según su uso tradicional y ciertos compuestos que contiene. Si bien la investigación científica específicamente sobre el efecto de Cistanche sobre el estreñimiento es limitada, se cree que tiene múltiples mecanismos que pueden contribuir a su potencial para aliviar el estreñimiento. Efecto laxante:cistancheSe ha utilizado durante mucho tiempo en la Medicina Tradicional China como remedio para el estreñimiento. Se cree que tiene un efecto laxante suave, que puede ayudar a promover las deposiciones e inducir el estreñimiento. Este efecto puede atribuirse a varios compuestos que se encuentran en Cistanche, como los glucósidos y polisacáridos de feniletanoide. Humedecer los intestinos: según el uso tradicional, se considera que Cistanche tiene propiedades humectantes, dirigidas específicamente a los intestinos. Promover la hidratación y lubricación de los intestinos puede ayudar a ablandar las herramientas y facilitar el paso, aliviando así el estreñimiento. Efecto antiinflamatorio: el estreñimiento a veces puede estar asociado con inflamación en el tracto digestivo. Cistanche contiene ciertos compuestos, incluidos glucósidos feniletanoides y lignanos, que se cree que tienen propiedades antiinflamatorias. Al reducir la inflamación en los intestinos, puede ayudar a mejorar la regularidad de las deposiciones y aliviar el estreñimiento.
