Inhibición de la proliferación de células renales felinas de Crandell-Rees por senescencia inducida por rayos X
Mar 29, 2022
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Manabu KOIKE1,2)*, Yasutomo YUTOKU1)y Aki KOIKE1)
RESUMEN.Se ha informado radiorresistencia y radiotoxicidad después de tratamientos contra el cáncer en felinos. La optimización de las dosis de radiación para inducir efectos citotóxicos solo en las células cancerosas y no en las células normales es fundamental para lograr una radioterapia eficaz; sin embargo, los mecanismos de resistencia a la radiación, radiotoxicidad y respuesta al daño del ADN (DDR) en células felinas aún no se han dilucidado. Una rotura de doble cadena de ADN (DSB) es el tipo más tóxico deADNdaños inducidos por rayos X y haces de iones pesados utilizados en el tratamiento del cáncer. Crandell-Rees FelinoRiñón(CRFK) son una de las células felinas más utilizadas en la investigación de las ciencias de la vida. Aquí informamos queDSBLa senescencia desencadenada inducida por rayos X es importante para inhibir la proliferación deCRFKcélulas. Demostramos a través del ensayo de proliferación celular que los rayos X en dosis de 2 Gy y 10 Gy son tóxicos paraCRFKcélulas que la irradiación de células CRFK inhibe su proliferación. En células CRFK irradiadas con rayos X, se detectó un aumento dependiente de la dosis en la senescencia desencadenada por DSB de acuerdo con los cambios morfológicos y usando un ensayo de tinción con galactosidasa asociada a la senescencia. Además, nuestros datos indicaron que enCRFKlas células, la principal vía DDR, que implica la fosforilación deH2AXen Ser139, normalmente se activaba por ATM quinasas. Nuestros hallazgos son útiles para comprender la senescencia celular inducida por rayos X y para dilucidar los efectos biológicos de la radiación, por ejemplo, la toxicidad, en las células felinas. Además, nuestros hallazgos sugieren que la línea celular CRFK es una matriz excelente para dilucidar la radiorresistencia y la radiotoxicidad en células de gato.
PALABRAS CLAVE:gato, animal de compañía, rotura de doble cadena de ADN, radiación, senescencia
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Los animales de compañía asumen un papel cada vez más importante en la sociedad humana. Debido a la extensión de la vida útil de los animales de compañía, el número de perros y gatos ancianos ha ido en aumento, y cada año se diagnostica cáncer a muchos perros y gatos [26, 27]. La radioterapia, que es uno de los tres principales tratamientos contra el cáncer, se utiliza cada vez más en los hospitales veterinarios como alternativa para el tratamiento del cáncer en perros y gatos [24, 26]. Para lograr la radioterapia más eficaz, es importante equilibrar la toxicidad entre las células normales y las cancerosas. Mientras tanto, aunque se observa radiorresistencia en gatos y tumores de gatos después de la radioterapia contra el cáncer, el mecanismo de dicha resistencia aún no se ha aclarado [24].
Se han realizado numerosos estudios sobre los efectos de la radiación en células derivadas de humanos y roedores [6, 10, 23, 28]. El ADN genómico es el principal objetivo biológico de las terapias que utilizan radiación, como los rayos X y los haces de iones pesados. La rotura de doble cadena (DSB) es el tipo más crítico de daño en el ADN inducido por radiación. Varias vías de respuesta al daño del ADN (DDR), incluida la detección de daños en el ADN, la señalización de DDR y la reparación del ADN, se activan cuando se produce un DSB. Como resultado, las células se recuperan de la lesión por radiación y el ADN afectado se repara de manera precisa y eficiente [8, 25]. En células de perros y gatos, los DSB pueden repararse principalmente mediante un mecanismo de reparación de unión de extremos no homólogos (NHEJ), que induce la unión de los extremos DSB del heterodímero Ku, que consta de Ku70 y Ku80 [14-17]; sin embargo, se necesitan más estudios para aclarar esto. Además, en la etapa temprana de reparación, se activan quinasas, como DNA-PK y ATM quinasas, y estas fosforilan Ser139 de la histona H2AX cerca de los sitios DSB [5, 6]. Es probable que los DSB activen los mecanismos de muerte celular programada, incluida la apoptosis y la senescencia, cuando las células no pueden repararse [9, 32]. Los mecanismos moleculares de varios DDR, como la reparación del ADN en células de gato, se han estudiado poco.
El felino Crandell-Rees inmortalizadoRiñón(CRFK) es una de las líneas celulares de gatos más utilizadas. La línea celular CRFK se estableció por primera vez en 1964 a partir de lariñóncorteza de una gatita de 12-semanas [3]. Crandell et al. [3] describieron que la línea celular CRFK es útil en la investigación de virus felinos y en medicina diagnóstica y se ha vuelto de particular interés en la investigación del cáncer. Actualmente, la línea de células CRFK es indispensable en la investigación de las ciencias de la vida, incluida la investigación del cáncer y los virus. Por lo tanto, es importante comprender la radiosensibilidad de las células CRFK, cuyas diversas vías moleculares se han analizado, para obtener información de investigación primaria para dilucidar los mecanismos moleculares de los efectos biológicos de la radiación en los gatos. Sin embargo, actualmente no hay informes sobre los efectos y mecanismos de la radiación sobre la proliferación de células CRFK.
En este estudio, investigamos los efectos biológicos de los rayos X en la proliferación de células CRFK. Nuestros hallazgos indican que los rayos X suprimieron notablemente la proliferación de células CRFK. Además, nuestros resultados sugirieron que la supresión de la proliferación se debió a una mayor senescencia celular provocada por los DSB. Además, confirmamos en las células CRFK que la ruta principal de DDR se activa normalmente por las quinasas ATM.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivos celulares, productos químicos y rayos X.
Se cultivaron células CRFK (HSRRB, Osaka, Japón) en medio Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento como se describió previamente [17]. Las células adherentes se irradiaron con rayos X a 1, 2 o 10 Gy y a una tasa de dosis de 0,71–0,77 Gy/min (200 kV/20 mA con filtros de 0,5-mm Al y 0,5-mm Cu) usando Pantak HF320S (Shimadzu, Kyoto, Japón) a temperatura ambiente, como se describe en estudios previos [17]. KU-55933, un inhibidor de la quinasa ATM, se adquirió de Wako Pure Chemical (Osaka, Japón). El KU-55933 se diluyó en DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) y se diluyó en un medio de cultivo inmediatamente antes de su uso.
Determinación del número de células viables
Se usó la prueba de exclusión con azul de tripano para determinar el número de células viables. Las células se sembraron a una densidad de 2,2 × 104 células por plato en platos de 60-mm. Al día siguiente, las células se irradiaron con rayos X y se incubaron durante 5 días después de la irradiación. Posteriormente, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se suspendieron en solución de tripsina-EDTA (T3924, Sigma-Aldrich), se recogieron, se centrifugaron y se tiñeron con 0, 4% p/v de solución de azul tripán ( Wako Pure Chemical) o 0,4 por ciento de Trypan Blue (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.), y se contó con el contador de células automatizado TC10™ (Bio-Rad). Todas las irradiaciones se realizaron por triplicado.
inmunotransferencia
La extracción de proteína total y el análisis de transferencia Western se realizaron de acuerdo con nuestros métodos descritos anteriormente [11, 17] con las siguientes modificaciones. Las proteínas totales se sometieron a electroforesis en Extra PAGE One Precast Gel 5–20 por ciento (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) o Super Sep ACE Gel 5–20 por ciento (Wako Pure Chemical). Los productos fraccionados se transfirieron electroforéticamente a membranas Hybond-P (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, EE. UU.). Luego, las membranas se bloquearon en Blocking One (Nacalai Tesque) durante 60 min a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-H2AX de ratón (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc., Charlottesville, VA, EE. UU.) o anticuerpo monoclonal de actina de ratón ( Sigma-Aldrich). Después del lavado, las membranas se incubaron con el Ab completo ligado a HRP de IgG anti-ratón (de oveja) (NA931) (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) durante 60 min a temperatura ambiente. La inmunotransferencia se realizó utilizando el sistema de detección Select Western Blotting (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Las bandas de proteínas se visualizaron usando el sistema ChemiDoc XRS (Bio-Rad).
Inmunocitoquímica
La inmunotinción se realizó como se describió anteriormente [12, 17] con las siguientes modificaciones. Brevemente, las células cultivadas se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 30 min, se permeabilizaron con 0,5 % Triton X-100 en PBS durante 5 min, se bloquearon con una solución de bloqueo y se incubaron. con anticuerpo monoclonal anti-H2AX de ratón (JBW301) (Upstate Biotechnology Inc.) durante 60 min a temperatura ambiente. Después de lavar las células con PBS, la detección se realizó usando un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 568- (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.) o un anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Cappel Laboratories, Durham, NC, EE. UU. ). Luego, los núcleos se tiñeron con 0,025 µg/ml de colorante fluorescente 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). Las imágenes de las células se obtuvieron utilizando el microscopio de fluorescencia Olympus BX51 (Olympus, Tokio, Japón) equipado con una cámara digital (Olympus DP50, Olympus).
Ensayo de tinción de galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -gal)
Para este ensayo, las células (5 × 103) se sembraron en placas de 35- mm y se tiñeron con el kit de tinción Senescence -Galactosidasa (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, EE. UU.) 5 días después irradiación según las instrucciones del fabricante con las siguientes modificaciones. Los núcleos se tiñeron con 0,025 µg/ml de colorante fluorescente DAPI. Las imágenes de las células teñidas después de 18 horas se obtuvieron usando el microscopio Olympus CKX41 equipado con una cámara digital (Olympus DP12, Olympus) o usando el microscopio de fluorescencia Olympus BX51 equipado con una cámara digital (Olympus DP50). El porcentaje de células teñidas positivamente se determinó analizando tres campos aleatorios de al menos 100 células cada uno utilizando el software Image J. El tamaño del núcleo celular se determinó analizando tres campos aleatorios de 10 células cada uno utilizando el software Image J. Todas las irradiaciones se realizaron por triplicado.
Ensayo de apoptosis de anexina V/yoduro de propidio (PI)
Las células (2,2 × 104) se sembraron en placas de 60- mm y se irradiaron con rayos X al día siguiente. Cinco días después de la irradiación, las células se recogieron y se tiñeron con solución de anexina V Alexa Fluor 488-PI (Tali™ Apoptosis Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una dilución 200-veces de la solución de tinción de PI para la tinción. Además, las células apoptóticas marcadas con anexina V se detectaron utilizando el citómetro basado en imágenes Tali (Invitrogen). Todas las irradiaciones se realizaron por triplicado.
análisis estadístico
Los resultados estadísticos se presentan como medias ± desviaciones estándar (n{{0}}). El análisis estadístico excluyendo el tamaño nuclear se realizó mediante ANOVA y las pruebas de comparación múltiple de Ryan (ANOVA4 en la WEB, https://www.hju.ac.jp/~kiriki/anova4/). El tamaño nuclear se evaluó mediante la prueba t de Student. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
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RESULTADOS
Inhibición de la proliferación de células CRFK por rayos X
Para investigar el efecto de los rayos X sobre la proliferación de células CRFK, se realizó irradiación a 2 y 10 Gy. Como se muestra en la Fig. 1, la proliferación celular se inhibió significativamente de manera dependiente de la dosis (P<0.05). these="" findings="" indicate="" that="" the="" proliferation="" was="" inhibited="" by="" x-rays="" at="" both="">
Inducción de DSB en células CRFK por rayos X
La fosforilación de H2AX en Ser139 es uno de los principales y primeros DDR celulares a DSB [8, 20, 28]. H2AX es un biomarcador estándar de oro para DSB [8, 20, 28]. Previamente, usando Western Blot, determinamos el cambio en la expresión de H2AX en células CRFK entre 1 hora y 24 horas después de la irradiación con rayos X en una dosis única de 10 Gy [17]. Como resultado, el nivel de expresión de H2AX fue el más alto después de 1 hora [17]. Para examinar si la fosforilación de H2AX se indujo de forma dependiente de la dosis en los extractos totales de células CRFK 1 hora después de la irradiación, se realizó un análisis de transferencia Western con el anticuerpo anti-H2AX. Como se muestra en la Fig. 2A, el análisis de transferencia Western indicó que la expresión de H2AX aumentó según la dosis de rayos X. A continuación, examinamos si el foco H2AX se detectó en las células irradiadas mediante un ensayo de inmunotinción con el anticuerpo anti-H2AX. Nuestros resultados indicaron que se formaron focos H2AX en los núcleos de las células CRFK 1 hora después de la irradiación (Fig. 2B).
Fosforilación dependiente de ATMquinasa de H2AXat Ser139 en células CRFK por rayos
Una de las funciones importantes de la ATGM quinasa o DNA-PK en DDR desencadenada por rayos X es fosforilar H2AX que rodea los sitios DSB en varias células humanas y de roedores [18, 29]; sin embargo, tal papel aún no se ha investigado en células felinas, incluidas las células CRFK. Para confirmar si la ATM quinasa es responsable de la fosforilación de H2AX inducida por rayos X en Ser139 en células CRFK, las células se incubaron en un medio que contenía el inhibidor de la quinasa ATM KU-55933 (10 µM) o solvente (DMSO) durante 1 hr antes de la irradiación (10 Gy). Como se muestra en la Fig. 3, la formación de focos H2AX se inhibió en células irradiadas en presencia de KU- 55933. Estos resultados sugieren que ATM es la principal quinasa para la fosforilación de H2AX en Ser139 inducida por irradiación en células CRFK.
Inducción de senescencia en células CRFK por rayos X
Para investigar si la inhibición de la proliferación de células CRFK en respuesta a la irradiación está relacionada con la senescencia y la apoptosis, las células se irradiaron con rayos X a 2 y 10 Gy. En primer lugar, 5 días después de la irradiación, las células se analizaron mediante tinción con SA- -gal, un ensayo estándar de oro para la senescencia. Observamos morfologías específicas de la senescencia, como una forma celular grande y plana (Fig. 4A) y núcleos anormales, incluidos núcleos agrandados o multinucleados (Fig. 4B), en células irradiadas. Además, en células CRFK irradiadas, las células positivas para SA- -gal aumentaron notablemente de manera dependiente de la dosis (Fig. 4A-C). También analizamos cuantitativamente la ampliación del tamaño del núcleo celular, que es otro marcador de células senescentes. Como se muestra en la Fig. 4D, el tamaño del núcleo celular fue significativamente mayor en las células CRFK irradiadas (P<0.05). altogether,="" these="" findings="" indicate="" that="" x-rays="" highly="" induce="" senescence="" in="" crfk="" cells.="" next,="" to="" examine="" whether="" x-rays="" induced="" apoptosis="" in="" the="" irradiated="" crfk="" cells,="" apoptosis="" was="" quantified="" using="" tali™="" image-based="" cytometer.="" dual="" staining="" with="" fluorescent="" annexin="" v="" and="" pi="" was="" performed="" to="" detect="" apoptotic="" cells.="" cells="" stained="" positive="" for="" annexin="" v="" are="" considered="" apoptotic="" cells.="" as="" shown="" in="" fig.="" 5,="" the="" proportion="" of="" apoptotic="" cells="" was="" significantly="" higher="" in="" the="" 10-gy="" group="" than="" in="" the="" non-irradiated="" group="" and="" the="" 2-gy="" group="" but="" was="" lower="" (approximately="" 6%)="" in="" the="" 10-gy="" group.="" in="" addition,="" no="" significant="" increase="" in="" apoptosis="" was="" observed="" in="" the="" 2-gy="" group="" compared="" with="" the="" non-irradiated="">
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DISCUSIÓN
Comprender el efecto biológico de la radiación en las células de gato es importante para dilucidar la radiotoxicidad y desarrollar nuevos protocolos terapéuticos para el tratamiento del cáncer. En el presente estudio, encontramos que la proliferación del gatoriñónla línea celular CRFK fue significativamente suprimida por rayos X a dosis de 2 y 10 Gy. Estos hallazgos revelan que los rayos X son tóxicos para el crecimiento de las células CRFK en las condiciones utilizadas en este estudio. Además, las células senescentes aumentaron notablemente en las células CRFK irradiadas. Mientras tanto, nuestros hallazgos revelaron en las células CRFK que la ATM quinasa induce la fosforilación de H2AX en Ser139, que es uno de los principales DDR a DSB producidos por rayos X. Según se informa, los DSB inducidos por radiación pueden inducir la senescencia y la apoptosis en células humanas y de roedores [4, 22]. Nuestros hallazgos sugieren que el mecanismo de senescencia activado por DSB contribuyó a suprimir la proliferación de células CRFK por rayos X.
El mecanismo que subyace a la diferencia de radiosensibilidad entre humanos, perros y gatos y el mecanismo de reparación de las células de gato aún no se han dilucidado. Como se mencionó anteriormente, nuestros datos indicaron que la DDR dependiente de la quinasa ATM se activa mediante rayos X en las células CRFK. Además, este estudio y estudios previos demuestran que los DSB inducidos por rayos X en células CRFK pueden detectarse mediante análisis de transferencia Western e inmunocitoquímica utilizando el anticuerpo anti-H2AX disponible comercialmente [17]. Estos hallazgos sugieren que las células CRFK son útiles para aclarar los mecanismos moleculares de DDR en células de gato. Moor [24] describió que la radioterapia para gatos es diferente de la de perros en términos de respuestas tumorales y toxicidad del tejido normal. Fujii et al. [7] demostraron que los fibroblastos de los gatos son más radiorresistentes que los de los seres humanos en un análisis de formación de colonias y que los focos H2AX inducidos por la radiación pueden repararse más rápida y eficazmente en los fibroblastos felinos. Además, sugirieron la posibilidad de que el daño en el ADN y los cromosomas inducido por los rayos X se repare con mayor eficacia en los linfocitos felinos que en los linfocitos humanos o caninos. Estos hallazgos sugieren que las diferencias en la radiorresistencia entre humanos, perros y gatos pueden estar relacionadas con la diferencia en la capacidad de reparación del ADN. Recientemente, demostramos utilizando células CRFK que las proteínas de reparación NHEJ centrales, es decir, cat Ku70, Ku80 y XLF, se acumulan en los sitios DSB inducidos por el microláser 405-nm [17]. También hemos revelado que el reclutamiento de XLF de gato, XLF humano o XLF de perro depende de la presencia de Ku [13, 14, 17]; estos hallazgos respaldan firmemente que la regulación espaciotemporal de los factores centrales de NHEJ, incluidos Ku70, Ku80 y XLF, es importante en la regulación de la reparación de NHE [10, 19]. Colectivamente, las células CRFK pueden ser útiles para descubrir los mecanismos moleculares subyacentes no solo a las diferencias de radiorresistencia entre las células de gatos, perros y humanos, sino también a los DDR, incluida la reparación de NHEJ dependiente de Ku conservada en ellos.
La transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) es un mecanismo importante para la transformación maligna, por ejemplo, cambiando la resistencia de las células cancerosas a la radiación y los medicamentos contra el cáncer. Recientemente, se ha informado que las células CRFK tienen las características de los fibroblastos, en particular con respecto a la morfología, la bioquímica y la biología molecular, aunque las células CRFK se han establecido como una línea celular epitelial [21]. Además, van Beusekom et al. [31] informó que TGF- 1 cambió la morfología de las células CRFK de un fenotipo epitelial a un fenotipo fibroblástico y que indujo significativamente la expresión de algunos genes marcadores de EMT en las células CRFK, lo que sugiere que las células CRFK pueden sufrir EMT. En el presente estudio, la senescencia parecía más importante que la apoptosis para la supresión del crecimiento en células CRFK irradiadas. En conjunto, la línea celular CRFK puede ser una modalidad excelente no solo para dilucidar la interrelación entre la senescencia inducida por rayos X, la radiorresistencia y/o la radiotoxicidad en gatosriñóncélulas epiteliales, sino también para dilucidar los efectos de la EMT contra la radiación y la quimioterapia.
La terapia pro-senescencia es una nueva estrategia anticancerígena basada en la inducción de la senescencia de las células cancerosas. Para aplicar esta estrategia al tratamiento de gatos, es necesario dilucidar el mecanismo molecular de inducción de la senescencia en células felinas. Por otro lado, Li et al. [22] han descrito que los agentes senolíticos, una clase de moléculas pequeñas que pueden matar selectivamente las células senescentes, tienen un gran potencial para reducir sustancialmente los efectos secundarios causados por la radioterapia mientras evitan razonablemente la carcinogénesis. Recientemente, se demostró que un agente senolítico ABT-737 elimina las células senescentes inducidas por radiación ionizante de los pulmones de ratones irradiados [35]. Como se mencionó anteriormente, nuestros datos mostraron que las células senescentes aumentaron notablemente en las células CRFK irradiadas. Nuestros hallazgos y estudios adicionales que utilizan células CRFK pueden estar disponibles para la investigación básica para el desarrollo no solo de la terapia de prosenescencia felina, sino también de agentes senolíticos para reducir los efectos secundarios causados por la radioterapia.
CRFKes una de las líneas celulares de mamíferos más importantes y se usa ampliamente en experimentos, incluidos los de virus, como el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) o el SARS-CoV-2; reparación del ADN e investigación del cáncer en gatos;crónicoriñón enfermedad; y la producción de vacunas [1, 2, 17, 30, 33, 34]. Las células CRFK pueden infectarse con varios virus, incluidos los oncovirus [1–3, 34]. En base a esto, especulamos que la línea celular CRFK puede ser adecuada para la investigación básica sobre los cambios en la radiosensibilidad inducida por una infección viral y sobre el efecto de la radioterapia en los tumores inducidos por una infección viral.CRFKLas células se pueden utilizar para dilucidar los mecanismos subyacentes a la radiorresistencia y la radiotoxicidad en las células epiteliales de riñón de gato y el efecto de la infección viral en la radiosensibilidad. En conclusión, las células CRFK pueden ser excelentes líneas celulares para realizar investigaciones sobre radiotoxicidad en gatos e investigaciones básicas para desarrollar nuevos métodos de tratamiento del cáncer.
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CONFLICTO DE INTERESES.Los autores declaran no tener conflicto de intereses.
EXPRESIONES DE GRATITUD.Este trabajo se llevó a cabo con el apoyo de los Institutos Nacionales de Ciencia y Tecnología Cuántica y Radiológica, y el Departamento de Biología Reguladora de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Saitama.
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