Efecto inhibitorio de las fracciones de Elaeagnus Umbellata sobre la melanogénesis en células de melanoma B16-F10 estimuladas por -MSH

Abstracto:

Cuando la piel se expone a la radiación UV, los melanocitos producen melanina. La producción excesiva de melanina conduce a la pigmentación de la piel, lo que provoca diversos problemas cosméticos y de salud. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de terapias naturales y seguras que inhiban la producción de melanina. Elaeagnus umbellata (UE) ha sido ampliamente utilizada durante mucho tiempo como planta medicinal popular debido a sus propiedades farmacológicas que incluyen propiedades antiulcerosas, antioxidantes y antiinflamatorias.

En este estudio, investigamos la actividad antioxidante y los efectos inhibidores de la melanogénesis de las fracciones de UE en células de melanoma B16-F10. Las fracciones de UE mostraron un aumento dependiente de la dosis en la actividad antioxidante en la actividad de eliminación de radicales. Además, evaluamos el efecto de las fracciones de UE sobre la actividad de tirosinasa y la melanogénesis en células de melanoma B16-F10 inducidas por hormona estimulante de melanocitos. La UE no fue citotóxica a 12,5–50 µg/mL. Las fracciones de EU inhibieron eficazmente la actividad de tirosinasa y la melanogénesis, suprimieron la fosforilación de CREB y ERK involucradas en la vía de la melanogénesis y regularon negativamente la expresión de proteínas relacionadas con la melanogénesis. Curiosamente, el efecto anti-melanogénesis fue más efectivo a una concentración de 50 µg/mL de UE, y los efectos de las fracciones fueron superiores a los del extracto. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que la UE tiene potencial como tratamiento seguro para la pigmentación excesiva o como ingrediente natural en cosméticos.

La tasa de crecimiento de la piel humana y las nuevas células en nuestro cuerpo se ralentiza, el metabolismo de la piel se ralentiza, las células envejecidas no se pueden metabolizar a tiempo y sin problemas, y es difícil que la melanina desaparezca. Junto con la pérdida gradual de los factores hidratantes naturales en la superficie de la piel, el estrato córneo se espesa y se acumula, aumenta la melanina y aparecen gradualmente manchas oscuras en la piel. No importa cuántos productos blanqueadores para el cuidado de la piel se apliquen, es difícil que la piel los absorba. Por lo tanto, durante nuestra investigación, descubrimos que los glucósidos totales de Cistanche deserticola, el ingrediente funcional de Cistanche tubulosa, pueden eliminar eficazmente varios radicales libres de oxígeno activo (O2·-, OH·, H2O2, 1O2) y proteger contra el daño del ADN causado por Los radicales libres OH· y los polisacáridos de Cistanche deserticola pueden retrasar la degeneración fisiológica de los órganos y la transformación morfológica de las células. Todos los ingredientes anteriores pueden tener un efecto antioxidante y antienvejecimiento. Al mismo tiempo, Cistanche deserticola también puede inhibir la actividad de la tirosinasa para lograr un efecto blanqueador.

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Palabras clave:

Elaeagnus umbellata; blanqueamiento de la piel; antioxidante; melanogénesis; -MSH.

1. Introducción

El color de la piel en los seres humanos depende de la cantidad de melanosomas genéticamente presentes y del grado en que estos melanosomas se dispersen en la piel y también se ve afectado por el grado de exposición a la luz solar y la contaminación ambiental [1]. La melanina es un compuesto de alto peso molecular que se encuentra en animales y plantas y es un pigmento importante que determina el color de los ojos, la piel y el cabello de los humanos. La melanogénesis se refiere al proceso de producción de melanina, una de las principales causas de pigmentación en la piel humana. La melanina puede proteger la piel de la radiación ultravioleta dañina, pero la producción excesiva de melanina puede provocar problemas estéticos, como melasma y pecas, así como problemas de salud, incluida la hiperpigmentación posinflamatoria [2].

La melanina juega un papel crucial en la protección de la piel de varios estímulos, como los rayos UV, las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la hormona estimulante de melanocitos (-MSH) [3]. Cuando la piel se expone a la radiación UV, se producen ROS y las células de la piel generan un exceso de melanina. Esta ROS generada destruye el ADN monocatenario y bicatenario y ataca las moléculas de proteínas y lípidos [4]. La melanina y las enzimas antioxidantes, como la peroxidasa, el glutatión y la catalasa, neutralizan las ROS generadas para mantener un nivel particular [5,6]. Sin embargo, la producción excesiva e incontrolable de ROS conduce a una variedad de problemas, como el cáncer [7]. Los melanocitos se encuentran en la capa basal de la epidermis y son modulados por la tirosinasa. Estas células producen melanina a través de la melanogénesis, y factores como el factor de transcripción asociado a la microftalmia (MITF) y la proteína relacionada con la tirosinasa (TRP-1) están involucrados en este proceso [8]. La tirosinasa participa en la vía por la cual la L-tirosina se convierte en 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA), que luego se convierte en dopaquinona a partir de la cual se sintetiza la melanina. Por lo tanto, la tirosinasa es un factor importante que regula la melanogénesis en las células de la piel.

Recientemente, para resolver los problemas estéticos causados ​​por la pigmentación y el trastorno pigmentario causado por el exceso de melanogénesis, muchas industrias médicas y cosméticas se han centrado en los inhibidores de la actividad de la tirosinasa [9]. Varios productos químicos como la arbutina, el ácido kójico, la hidroquinona y el ácido ascórbico, que son inhibidores de la síntesis de melanina, se utilizan como agentes blanqueadores de la piel [10]. Sin embargo, estas sustancias no penetran bien en la piel y durante un período prolongado de uso pueden tener efectos secundarios como irritación de la piel, inflamación, picazón y pigmentación [11]. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar agentes blanqueadores efectivos que puedan tratar y prevenir con seguridad la hiperpigmentación de la piel humana sin irritación.

Elaeagnus umbellata (UE) es una planta que está ampliamente distribuida en Asia y se ha utilizado durante mucho tiempo como planta medicinal popular debido a sus efectos farmacológicos asociados. Tradicionalmente, las flores y semillas de EU se han utilizado para el tratamiento de enfermedades respiratorias, incluidas las que afectan al corazón y los pulmones, mientras que las hojas se han utilizado como tónico y para el tratamiento de enfermedades intestinales [12,13]. Además, la UE se utiliza como relajante muscular, analgésico, antiulceroso, antidiabético y antipirético [14]. Los ingredientes de la UE tienen efectos anticancerígenos [15], antioxidantes y antiinflamatorios [16], y el extracto de la UE afecta el blanqueamiento de la piel y la mejora de las arrugas [17]. Sin embargo, aún no se han realizado estudios sobre el efecto del blanqueamiento de la piel por ramas y hojas en las fracciones de la UE. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue observar la actividad antioxidante in vitro y la inhibición de la melanogénesis de las fracciones de UE derivadas de hojas y ramas en células de melanoma murino B16-F10 productoras de melanina y confirmar el potencial de derivado de la UE como agente cosmético para blanquear la piel.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales y Reactivos

2.2. Preparación del extracto de UE y fracciones, así como preparación de muestras

Las ramas y hojas (1: 1) de la UE fueron proporcionadas por el Instituto Jeonbuk para la Bioindustria Alimentaria (Jeonju, Jeonbuk, Corea). La UE (50 g) se molió usando una licuadora y los polvos de la UE se extrajeron con etanol al 70 por ciento durante 24 horas a temperatura ambiente. El disolvente se filtró de forma estéril a través de un tamiz estándar (Advantec MFS, Taipei, Taiwán) y se evaporó a presión reducida utilizando un evaporador rotatorio (EYELA, N-1110, Tokio, Japón). El extracto se liofilizó utilizando un liofilizador (OPERON, FDU-8606, Gimpo, Corea) para eliminar el etanol residual y obtener 2,4 g (rendimiento, 4,8 por ciento) de polvo de extracto de etanol al 70 por ciento de la UE (EUEE). Se suspendió EUEE (2,4 g) en agua destilada y se repartió con fracciones de acetato de etilo (EUEA, 0,19 g) o butanol (EUBu, 0,91 g). Todos los extractos y fracciones se almacenaron a 4 ◦C hasta su uso.

2.3. Análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando un sistema Elite Lachrom HPLC-DAD equipado con un detector UV (Hitachi HighTechnologies Co., Tokio, Japón). El detector UV a 260 nm y la columna analítica YMC ODS-AM (5 mM, 4,6 × 250 mM) (Kyoto, Japón) se utilizaron para la cuantificación según el método del estándar interno. La temperatura de la columna fue de 35 ◦C y el caudal de la fase móvil fue de 1 mL/min. El eluyente fue un gradiente de disolvente (A)=0, 1 por ciento de ácido acético en agua y disolvente (B)=0, 1 por ciento de ácido acético en acetonitrilo. El tiempo de ejecución fue de 35 min y el gradiente fue el siguiente: (A)/(B)=88/12 (0 min) → (A)/(B)=78/22 (0– 18 min) → (A)/(B)=72/28 (18–28 min) → (A)/(B)=62/38 (28–35 min). El análisis de HPLC se muestra en la Figura 1.

2.4. Cultivo de células

La línea celular de melanoma murino B16-F10 (CRL-6475) se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, VA, EE. UU.). Las células se cultivaron en DMEM complementado con FBS activado por calor al 10 por ciento y estreptomicina al 1 por ciento (100 µg/ml)/penicilina (100 unidades/ml). Las células B16-F10 se incubaron en CO2 al 5 por ciento humidificado a 37 ◦C.

2.5. Ensayo de viabilidad celular

La citotoxicidad de las muestras se evaluó utilizando el ensayo MTT. Se cultivaron células de melanoma B16-F10 (1 × 104 células/pocillo) en una placa de 96-pocillos y se incubaron con varias concentraciones de extracto y fracciones (12,5, 25, 50 y 100 µg/ml) o arbutina (100 µg/mL) durante 24 h a 37 ◦C. Después de la incubación, se añadieron 500 µg/ml de solución de MTT a los pocillos y la placa se incubó durante 4 ha 37 ◦C. Luego, se retiró el medio de cada pocillo y se añadieron 200 µl de sulfóxido de dimetilo (DMSO) para solubilizar los cristales de formazán. La absorbancia de la placa se detectó a 570 nm en un lector de microplacas (Synergy HTX Multi-Mode Reader, BioTek, Winooski, VT, EE. UU.).

2.6. Actividad de eliminación de radicales DPPH

La actividad eliminadora de radicales DPPH del extracto y las fracciones de la UE se confirmó midiendo el poder reductor de los radicales DPPH en cada muestra. Se agregaron varias concentraciones (12,5, 25 y 50 µg/ml) de extracto y fracciones de UE o 20 µg/ml de ácido ascórbico (control positivo) a 500 µl a 2 ml de solución de DPPH 0,15 mM. La solución se agitó durante 10 s para asegurar una mezcla completa y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego se midió la absorbancia de la mezcla a 517 nm utilizando un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.).

2.7. Ensayo de eliminación de radicales ABTS

La solución eliminadora de radicales ABTS se preparó mezclando 7,4 mM de solución ABTS y 2,6 mM de persulfato de potasio en una proporción de 1:1 (pH 7,4) y haciendo reaccionar la solución a temperatura ambiente durante 24 h. A continuación, la solución ABTS se ajustó a una absorbancia de 0,70 ± 0,03 a 732 nm. Cada muestra de 10 µL se hizo reaccionar con 190 µL de solución ABTS durante 10 min a temperatura ambiente y se midió la absorbancia a 732 nm utilizando un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.).

2.8. Actividad de inhibición de la tirosinasa de hongos

Para analizar la actividad inhibitoria de la tirosinasa, que juega un papel crucial en la melanogénesis, se utilizaron tirosinasa de hongo y sustrato L-DOPA. En primer lugar, se añadieron secuencialmente 150 µL de tampón de fosfato 0,1 M (pH 6,8), 20 µL de solución de L-DOPA 5 mM y 20 µL de las diversas concentraciones de extracto y fracciones de EU, y 100 µL de 250 Se añadió tirosinasa de hongo U/mL para iniciar la reacción. Las mezclas se incubaron a 37 ◦C durante 10 min y se midió la absorbancia a 475 nm con un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). La actividad de inhibición de la tirosinasa se calculó utilizando la siguiente fórmula:

2.9. Determinación de la actividad de tirosinasa celular

Se sembraron células de melanoma B16-F10 a una densidad de 1 × 105 células/pocillo en placas de seis pocillos que contenían 2 ml de DMEM. Se establecieron seis grupos: grupo control, no tratado; -grupo MSH, 100 nM -solo MSH; grupo arbutina, -MSH y arbutina (10 mM); grupo EUEE, -MSH y extracto de EUEE (12,5, 25 y 50 µg/mL); grupo EUEA, -MSH y fracciones EUEA (12,5, 25 y 50 µg/mL); y grupo EUBu, fracciones -MSH y EUBu (12,5, 25 y 50 µg/mL). Las placas de seis pocillos se incubaron durante la noche a 37 ◦C en una incubadora con CO2 al 5 %. Luego, las células se expusieron a -MSH (100 nM) durante 48 h y se trataron con varias concentraciones de EUEE, EUEA y EUBu o arbutina (10 mM) durante 24 h. Las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron. El lisado se centrifugó a 16,000x g durante 20 min.

A continuación, se determinó el contenido de proteínas de cada lisado utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, Vantaa, Finlandia). Luego se ajustaron los niveles de proteína a 20 µg en todas las muestras. Los lisados ​​(100 µl) que contenían 2,5 mM de L-DOPA en tampón de fosfato 0,1 M se transfirieron a pocillos en una placa de 96-pocillos y se incubaron durante 1 ha 37 ◦C. La absorbancia de los lisados ​​se midió a 475 nm utilizando un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). La actividad tirosinasa intercelular se calculó mediante la siguiente fórmula:

OD representa la absorbancia de la muestra y ODb representa la absorbancia del control. Se usó arbutina como estándar.

2.10. Medición del contenido de melanina

Para determinar la cantidad de melanina en las células B16-F10, se sembraron en una placa de 24-pocillos a una densidad de 2 × 104 células/pocillo y se incubaron durante 24 h en DMEM con FBS al 10 %. Se pretrataron células B16-F10 con varias concentraciones de EUEE, EUEA y EUBu (12,5, 25 y 50 µg/mL) y arbutina de control positivo (10 mM) durante 1 h, luego se hicieron reaccionar con 100 nM de - MSH por 72 h adicionales. Posteriormente, las células se recolectaron después de lavarlas con PBS. El sedimento obtenido por centrifugación (12,000x g, 10 min) se lisó en NaOH 1 N que contenía DMSO al 10 por ciento a 90 ◦C durante 30 min. El contenido de melanina de cada pocillo se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas (Biotek, Winooski, VT, EE. UU.). Para determinar la cantidad de melanina, las cantidades totales producidas durante el experimento se consideraron como estándar (100 por ciento), y la tasa de inhibición de cada grupo de tratamiento de extracto y fracción se determinó en proporción a este estándar.

2.11. Análisis de Western Blot

Las células de melanoma murino B{{0}}F10 (1 × 106 células/pocillo) se cultivaron en placas de 6 cm y se incubaron durante la noche a 37 ◦C, y las células se pretrataron con -MSH (10 µM) durante 24 H. Luego, las células se trataron con varias concentraciones (12,5, 25 y 50 µg/mL) de extracto y fracciones de UE o 100 µg/mL de arbutina durante 24 h. Las células se recolectaron con PBS y luego se centrifugaron a 12,000x g durante 15 min a 4 ◦C. Después de eliminar el sobrenadante, las células se lisaron usando tampón de lisis de proteínas Pro-prep enfriado con hielo con la adición de inhibidores de proteasa y fosfatasa al 1 por ciento y se mantuvieron en hielo durante 40 min. Las proteínas fraccionadas se cuantificaron utilizando el ensayo de proteínas de Bradford. Se cargaron cantidades iguales de proteínas (25 µg) y se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico al 8 por ciento o al 10 por ciento y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas de PVDF se bloquearon con leche descremada al 5 % en solución salina tamponada con Tris (TBS) con tampón Tween 20 al 0,1 % (TBS-T) durante 1 h a temperatura ambiente, y se incubaron con anticuerpos primarios específicos contra p-CREB, CREB, p -ERK, ERK, MITF, TRP-1, TRP-2, tirosinasa y -actina durante la noche a 4 ◦C.

Posteriormente, las membranas se enjuagaron con tampón TBS-T tres veces durante 10 min y se hicieron reaccionar durante 2 h con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a temperatura ambiente. Las membranas se enjuagaron con tampón TBS-T cinco veces y las proteínas se detectaron con una solución de quimioluminiscencia mejorada. Las imágenes de la banda se obtuvieron utilizando un sistema de imágenes Davinch-In vivo y western (Davinch-K, Seúl, Corea).

2.12. Análisis estadístico

Todos los valores se presentan como medias ± SEM (error estándar de la media) de al menos tres experimentos independientes y se utilizó el software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.) para el análisis estadístico. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional seguido de un análisis post hoc de Bonferroni para comparar las diferencias estadísticas entre los grupos. Un valor de p inferior a 0.05 (p < 0,05) se consideró estadísticamente significativo.

3. Resultados

3.1. Análisis HPLC de la UE

Los rendimientos finales (porcentaje) de EUEE, EUEA y EUBu fueron 4,8 por ciento, 0,18 por ciento y 1,82 por ciento, respectivamente, en base al peso fresco. Se utilizó HPLC para analizar el contenido de luteolina, un compuesto indicador de extracto y fracciones de UE. En comparación con el pico del componente estándar, se confirmó el pico de luteolina en el extracto y las fracciones de la UE. La concentración de luteolina en EUEE, EUEA y EUBu fue de 499,03, 1948,05 y 994,00 mg/ml, respectivamente (Figura 1).

3.2. El efecto de la UE sobre la actividad antioxidante y la actividad inhibidora de la tirosinasa

Las actividades antioxidantes de las diversas concentraciones de EUEE, EUEA y EUBu se midieron mediante el ensayo DPPH/ABTS. Las actividades de eliminación de radicales DPPH y ABTS de EUEE, EUEA y EUBu aumentaron de manera dependiente de la dosis (Figura 2A, B), con ácido ascórbico como control positivo. Las actividades de captación de radicales DPPH y ABTS a 50 ug/mL del extracto y las fracciones de UE fueron más altas, mostrando resultados similares al control positivo, ácido ascórbico. Para medir el efecto inhibidor de las enzimas mediadas por la melanogénesis en el extracto y las fracciones de la UE, se realizó un ensayo de inhibición de la tirosinasa de hongos (Figura 2C) con L-DOPA como sustrato en condiciones libres de células. Los resultados mostraron que la actividad de la tirosinasa fue inhibida por el extracto y las fracciones de UE de manera dependiente de la dosis. En particular, la actividad inhibidora de tirosinasa de 50 ug/mL de extracto de UE y fracciones mostró resultados similares a la arbutina,

Por lo tanto, el efecto inhibidor de tirosinasa de EU está relacionado con la oxidación de L-DOPA a DOPA quinona en la melanogénesis. En general, las fracciones de EU tuvieron un mayor efecto antioxidante e inhibidor de tirosinasa que el del extracto. Además, las fracciones de UE, especialmente EUBu, comenzaron a mostrar efectos similares al grupo de control positivo a una dosis de 25 ug/mL.

Figura 2. Actividades antioxidantes y actividad inhibidora de tirosinasa de hongo de EU. Actividad de eliminación de radicales de DPPH (A) y ABTS (B) del extracto y las fracciones de la UE. Se utilizó ácido ascórbico (20 µg/mL) como control positivo. El efecto inhibidor de la tirosinasa usando L-DOPA del extracto y fracciones de EU (C). Se usó arbutina (10 mM) como control positivo. Todos los gráficos muestran porcentajes de control y los datos se expresan como medias ± SEM (n=3). La significación estadística se fijó en * p < 0.05, ** p < 0.01 y *** p < 0.001 en comparación con el grupo de ácido ascórbico o arbutina.

3.3. El efecto de la UE en la viabilidad de las células B16-F10

Para evaluar la citotoxicidad celular de la UE, se trataron células de melanoma B16-F10 con varias concentraciones (12,5, 25, 50 y 100 ug/mL) de extracto de UE y fracciones durante 24 h, y se analizó la viabilidad celular mediante ensayo MTT. Los resultados se muestran como el porcentaje de viabilidad celular en relación con el control. El extracto y las fracciones de UE no fueron citotóxicos en el rango de concentración probado de 12,5 50 ug/mL para células B16-F10. Sin embargo, se confirmó la citotoxicidad en células B16-F10 a una concentración de 100 ug/mL de las fracciones de UE (EUEA y EUBu) (Figura 3). Por lo tanto, se realizaron experimentos posteriores utilizando concentraciones de 12,5, 25 y 50 ug/ml de extracto y fracciones de UE.

3.4. El efecto de la UE en la síntesis de melanina

Para determinar el efecto antimelanogénico de la UE, se examinó el efecto inhibitorio del extracto y las fracciones de la UE sobre la síntesis de melanina en células B16-F10. Las células B16-F10 se trataron con extracto de UE y fracciones a 12,5, 25 y 50 µg/mL o con arbutina a 10 mM durante 1 h y luego se estimularon con -MSH (100 mM) durante 72 h . El contenido de melanina aumentó en un 305,44 por ciento cuando se estimuló con -MSH en comparación con el control (Figura 4A). Sin embargo, los grupos tratados con EU a una concentración de 50 µg/mL tenían un contenido de melanina significativamente reducido en comparación con el grupo estimulado solo con -MSH, y los resultados fueron similares a los del grupo de control. Además, en comparación con el control positivo de arbutina, las fracciones de UE a una concentración de 50 µg/mL exhibieron un nivel más bajo de producción de melanina. De acuerdo con estos resultados, a medida que aumentaban las concentraciones de extracto y fracciones de UE, aumentaba la tasa de inhibición de la síntesis de melanina en las células B16-F10 (Figura 4B).

En particular, la tasa de inhibición de la síntesis de melanina en las fracciones de UE a una concentración de 50 µg/mL fue significativamente mayor que la de la arbutina. Por lo tanto, las fracciones de UE tuvieron un efecto inhibidor dependiente de la dosis significativo sobre la síntesis de melanina en células de melanoma B16-F10.

3.5. El efecto de la UE sobre la síntesis de melanina y la actividad de la tirosinasa celular

Confirmamos el efecto del extracto y las fracciones de EU sobre la actividad de tirosinasa intracelular involucrada en el mecanismo de melanogénesis en células de melanoma B16-F10. Todos los grupos, excepto el control, fueron estimulados con a-MSH (100 nM) durante 48 h y luego tratados con varias concentraciones de extracto y fracciones de UE (12,5, 25 y 50 ug/mL) o arbutina ( 10 mM) durante 24 h. Como resultado, el extracto y las fracciones de EU inhibieron significativamente la actividad de tirosinasa inducida por MSH en células B16-F10 de manera dependiente de la dosis (Figura 4C). La actividad de tirosinasa intracelular aumentó en un 251,00 por ciento cuando se estimuló con a-MSH en comparación con la del control. Sin embargo, los grupos tratados con UE a una concentración de 50 ug/mL redujeron significativamente la actividad de tirosinasa en comparación con la del grupo estimulado solo con a-MSH.

Por lo tanto, la actividad de la tirosinasa fue inhibida de manera dependiente de la dosis por el tratamiento con UE en células B16-F10, y el efecto fue particularmente fuerte en una estafa. concentración de 50 ug/mL. La inhibición de la actividad tirosinasa por EUEE a una concentración de 50 ug/mL fue menor que la de la arbutina (85,13 por ciento), mientras que la inhibición de la actividad tirosinasa de las fracciones de la UE (EUEA y EUBu) fue mayor que la de la arbutina (121,99 y 128,11 por ciento). , respectivamente). De acuerdo con estos resultados, a medida que aumentaban las concentraciones de extracto y fracciones de UE, aumentaba la tasa de inhibición de la actividad de la tirosinasa intracelular en las células B16-F10 (Figura 4D).

Figura 4. Síntesis de melanina y actividades de tirosinasa celular de EU. Contenido de melanina del extracto de UE y fracciones en células de melanoma B16-F10 (A). Tasa de inhibición de la síntesis de melanina del extracto de UE y fracciones en células de melanoma B16-F10 (B). Actividad de tirosinasa intracelular del extracto de UE y fracciones en células de melanoma B16-F10 (C). Tasa de inhibición de la actividad de tirosinasa intracelular del extracto de UE y fracciones en células de melanoma B16-F10 (D). Los resultados (A, C) se presentan como porcentajes basados ​​en el grupo -MSH. Los resultados (B, D) se presentan como porcentajes basados ​​en el grupo de control. Los datos se expresan como la media ± SEM (n=3). La significación estadística se fijó en *** p < 0,001 en comparación con las células B16-F10 estimuladas con -MSH, y #p < 0,05, ## p < 0,01 y ### p < 0,001 en comparación con las grupo de arbutina

3.6. El efecto de la UE en la expresión de proteínas CREB y ERK relacionadas con la melanogénesis

La melanogénesis protege la piel humana de diversos estímulos externos y en este proceso intervienen varios mecanismos. -MSH, una hormona involucrada en la primera etapa de la melanogénesis, estimula a los melanocitos a fosforilar CREB y ERK, induciendo la síntesis de proteínas de señal descendente asociadas con la melanogénesis [18]. En este estudio, investigamos las proteínas reguladas por la melanogénesis, incluidas CREB y ERK, para determinar el mecanismo inhibidor de la melanogénesis de la UE en la síntesis de melanina inducida por -MSH en células de melanoma B16-F10. Como resultado, confirmamos que la fosforilación de CREB y ERK aumentó significativamente cuando las células B16-F10 se estimularon con -MSH. Sin embargo, cuando las células se trataron con extracto y fracciones de UE, la fosforilación inducida por -MSH se suprimió de manera dependiente de la dosis. En particular, se puede ver que el extracto de UE y las fracciones de concentración de 50 µg/mL son las más efectivas entre varias concentraciones de tratamiento (Figura 5A–D).

3.7. El efecto de la UE en la expresión de las proteínas MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa relacionadas con la melanogénesis

Para investigar si el extracto y las fracciones de la UE afectan la expresión de las proteínas relacionadas con la melanogénesis inducidas por -MSH, se realizó transferencia Western para evaluar la expresión de las proteínas MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa. Los niveles de todas las proteínas relacionadas con la melanogénesis aumentaron significativamente con la estimulación de -MSH, pero el extracto y las fracciones de EU suprimieron de manera eficaz la expresión de proteínas MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa en las proteínas estimuladas con -MSH. Células B16-F10 (Figura 6). De acuerdo con los resultados anteriores, especialmente con la mayoría de los extractos y fracciones de UE a 50 µg/mL, la expresión de estas proteínas fue más inhibida que la encontrada después del tratamiento con arbutina de control positivo. Además, el tratamiento con fracciones de UE indujo un mayor efecto a la misma concentración en comparación con el extracto de UE.

Figura 6. Efecto inhibidor de la UE sobre la expresión de las proteínas MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa relacionadas con la melanogénesis. Imagen de banda de transferencia Western representativa de MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa de EUEE (A), EUEA (B) y EUBu (C). Usando el programa GelQuantNET, la intensidad relativa de la banda de transferencia Western se muestra como el siguiente gráfico de barras; MITF/ -actina, TRP-1/ -actina, TRP-2/ -actina y tirosinasa/ -actina. -actina se usó como control interno del Western Blot. Los datos se expresan como la media ± SEM (n=3). La significancia estadística se estableció en * p < 0.05, **p < 0.01 y *** p < 0.001 en comparación con el B{ estimulado por -MSH {22}}celdas F10.

4. Discusión

Los melanocitos se encuentran en la capa base de la piel, y el grado de síntesis de melanina en los melanocitos determina el color de la piel humana [19]. La melanina es un pigmento de la piel que protege la piel al reducir la cantidad de ROS generada por los dañinos rayos ultravioleta. Cuando la piel se expone a la radiación UV, se activa la a-MSH, que estimula los melanocitos, y los melanocitos producen melanina (20), sin embargo, la producción excesiva de melanina puede causar pigmentación en la piel y causar problemas estéticos.

La unión de a-MSH al receptor de melanocito específico de melanocortina -1 (MC1R) activa la proteína de señalización adenilato ciclasa y aumenta los niveles intracelulares de cAMP 121]. A medida que aumenta el nivel de cAMP en los melanocitos, se activan las vías de señalización CREB y ERK que promueven la producción de proteínas involucradas en la melanogénesis. 18,22]. Esta vía de señalización CREB y ERK activada aumenta la expresión de MITF y posteriormente promueve la expresión de TRP-1, TRP-2 y tirosinasa (23MITF es un factor de transcripción para la regulación de la tirosinasa y juega un papel central en la regulación de la síntesis de melanina, incluida la regulación de la proliferación, diferenciación y supervivencia de los melanocitos (24). Esta proteína no solo regula la melanogénesis mediante la regulación de subproteínas, incluidas TRP-1, TRP-2 y tirosinasa, pero también participa en la regulación de la progresión del ciclo celular (25). En conjunto, la unión de a-MSH-MC1R causada por estimulación externa, como la radiación UV, activa principalmente las vías de señalización de CREB y ERK en los melanocitos, lo que aumenta la expresión de MITF, TRP -1, TRP-2 y proteínas tirosinasa para inducir la producción de melanina. Por lo tanto, la inhibición de este proceso puede resultar en la inhibición de la síntesis de melanina en los melanocitos.

En la actualidad, los diversos agentes blanqueadores de la piel que se usan, incluidas la hidroquinona y la hidrocortisona, son en su mayoría productos químicos nocivos, y el uso a largo plazo puede causar efectos secundarios, como irritación de la piel y picazón [1,26–28]. Por lo tanto, es necesario centrarse en el desarrollo de agentes blanqueadores de la piel naturales seguros y efectivos con efectos secundarios mínimos como EU [29].

En este estudio, investigamos cómo las fracciones de UE inhiben los procesos de síntesis de melanina y reducen la producción de melanina, lo que da como resultado un efecto de blanqueamiento de la piel en las células de melanoma B16-F10.

Dado que el estrés oxidativo causado por la radiación UV induce la deposición de pigmentos de melanina, la actividad de eliminación de radicales y la inhibición de la actividad de ROS son eficaces para suprimir la melanogénesis, y los productos naturales con tal actividad antioxidante pueden tener excelentes efectos blanqueadores [30,31]. Por lo tanto, primero investigamos la actividad antioxidante del extracto y las fracciones de EU en células de melanoma B16/F10 utilizando ensayos DPPH y ABTS, que son métodos comunes y simples para analizar la actividad antioxidante de las plantas in vitro. El DPPH es un radical libre estable y se utiliza para analizar la actividad de captación de radicales de los compuestos hidrofóbicos utilizando agentes reductores, como el ácido ascórbico y el tocoferol. El ensayo ABTS puede medir la actividad de captación de radicales para compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos, antioxidantes que rompen cadenas y antioxidantes donantes de hidrógeno [24]. Confirmamos las altas actividades de eliminación de radicales DPPH y ABTS de los extractos y fracciones de la UE. En particular, los efectos fueron más fuertes a una concentración de 50 µg/ml, y las fracciones de UE tuvieron una actividad antioxidante superior en comparación con la del extracto.

La tirosinasa es una enzima importante involucrada en la melanogénesis, y muchos agentes blanqueadores de la piel son principalmente inhibidores de la tirosinasa. Por lo tanto, examinamos el efecto de las fracciones de la UE sobre la actividad de la tirosinasa, que promueve la melanogénesis. Confirmamos el efecto inhibidor de la L-DOPA sobre la actividad de la tirosinasa celular para determinar si el extracto y las fracciones de UE inhiben directamente la actividad de la tirosinasa. Como resultado, el extracto y las fracciones de UE experimentaron un aumento en el efecto inhibidor de la tirosinasa de forma dependiente de la dosis. Además, de acuerdo con los resultados anteriores, la UE fue más efectiva a una concentración de 50 µg/mL, y las fracciones de la UE tuvieron un efecto mayor que el del extracto. En particular, la concentración de EUBu (50 µg/mL) tuvo más efecto que la de arbutina, un control positivo.

A continuación, investigamos el efecto blanqueador de la piel del extracto y las fracciones de UE sobre la melanogénesis en células de melanoma B16-F10 inducidas por -MSH. Primero usamos el ensayo MTT para establecer un rango de concentración en el que el extracto y las fracciones de la UE no fueran citotóxicos para las células B16-F10. Nuestros resultados confirmaron que no hubo citotoxicidad en el rango de concentración de 12,5 a 50 µg/mL.

Después de estimular las células B16-F10 con -MSH para inducir la síntesis de melanina, se identificó el efecto blanqueador de la piel del extracto y las fracciones de UE sobre el contenido de melanina y la actividad de la tirosinasa intracelular. Los patrones del extracto y las fracciones de UE sobre el contenido de melanina y la actividad de tirosinasa intracelular mostraron resultados similares. El tratamiento con todos los extractos y fracciones de EU mostró que el contenido de melanina y la actividad de tirosinasa intracelular se suprimieron de forma dependiente de la dosis. En particular, a una concentración de 50 µg/mL de fracciones de UE, se observó una pérdida de contenido de melanina y de actividad de tirosinasa intracelular de más del 50 % en comparación con el grupo estimulado solo con MSH (Figura 4A, C).

Las vías de señalización CREB y ERK son las principales vías de señalización que se activan mediante la estimulación de -MSH en la melanogénesis. Por lo tanto, CREB y ERK, que están involucrados en varios mecanismos, juegan un papel clave en el proceso de síntesis de melanina. La estimulación de -MSH en células de melanoma B16-F10 aumentó la expresión de MITF y la familia de genes de tirosinasa relacionada con la melanogénesis (TRP-1, TRP-2 y tirosinasa) a través de la activación de CREB y ERK. En este estudio, proporcionamos evidencia de que el extracto y las fracciones de EU inhiben la síntesis de melanina, así como las vías de señalización aguas arriba involucradas, CREB y ERK.

Cuando los niveles de TRP-1 y TRP-2 aumentaron por la expresión regulada al alza de MITF, se promovió la expresión de tirosinasa y las enzimas relacionadas con la melanogénesis produjeron melanina [18,32]. La expresión de proteínas mediadas por la melanogénesis se observó mediante transferencia de Western para determinar el efecto antimelanogénico del extracto y las fracciones de UE en células de melanoma B16-F10. Nuestros resultados confirmaron que la expresión de proteínas MITF, TRP-1, TRP-2 y tirosinasa aumentó significativamente en el grupo estimulado con -MSH.

Sin embargo, el tratamiento con extracto y fracciones de UE reguló negativamente la expresión de estas proteínas relacionadas con la melanogénesis de una manera dependiente de la dosis. En particular, se observó una disminución significativa en la expresión a una concentración de 50 µg/mL de fracciones de UE. Nuestros resultados muestran que 50 µg/mL de fracciones de UE inhibieron la expresión de MITF, un importante factor de transcripción, inhibiendo significativamente la expresión de tirosinasa y, por lo tanto, inhibiendo la producción de melanina.

Con base en estos resultados, encontramos que 50 µg/mL de fracciones de UE inhibían la producción de melanina estimulada por -MSH en células de melanoma B16-F10 al regular a la baja la señalización relacionada con la melanogénesis basada en el excelente efecto antioxidante. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la fracción UE puede ser un candidato potencial para un tratamiento de blanqueamiento que controle de manera efectiva la melanogénesis.5. Conclusiones

En este estudio, evaluamos los efectos antioxidantes y antimelanogénicos sobre la melanogénesis inducida por -MSH en células de melanoma B16-F10 para confirmar la función de las fracciones de UE como agentes blanqueadores de la piel. En conclusión, descubrimos que las fracciones de UE tienen fuertes efectos antioxidantes e inhibieron las proteínas relacionadas con la melanogénesis, como TRP-1, TRP-2 y tirosinasa, al regular MITF y, por lo tanto, son valiosos inhibidores naturales de la melanogénesis.

En particular, se requirió una concentración (50 µg/mL) de extracto y fracciones de EU para inhibir la síntesis de melanina en células B16F10 estimuladas con -MSH. Además, confirmamos que las fracciones de la UE tienen efectos antioxidantes e inhibidores superiores en la producción de melanina. En consecuencia, la UE podría ser útil para los agentes terapéuticos de origen natural para el tratamiento de enfermedades de la piel y como agentes blanqueadores de la piel en la industria cosmética.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, J.-HL y D.-KK; Curación de datos, BL; Análisis formal, J.-HL; Adquisición de fondos, Y.-ML; Investigación, J.-HL e Y.-DJ; Metodología, BL, H.-WS y B.-JS; Administración de proyectos, Y.-ML y D.-KK; Software, D.-KK; Supervisión, Y.-ML y D.-KK; Visualización, J.-HL; Redacción: borrador original, J.-HL; Redacción: revisión y edición, J.-HL e Y.-DJ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Esta investigación fue apoyada por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía (MOTIE), Instituto de Corea para el Avance de la Tecnología (KIAT) a través del Programa de Fomento para las Industrias de la Región de Cooperación Económica (P0004749).

Conflictos de interés:

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Disponibilidad de muestras:

Las muestras de los compuestos no están disponibles de los autores.

abreviaturas

-MSH -hormona estimulante de melanocitos

CREB cAMP proteína de unión al elemento de respuesta

DOPA 3,4-dihidroxifenilalanina

UE Elaeagnus umbellata

EUEE UE 70 por ciento de extracto de etanol

Fracción de acetato de etilo de la UE de la UE

EUBu Fracción de butanol de la UE

Receptor de melanocortina -1 específico de melanocitos MC1R

MITF Factor de transcripción asociado a microftalmía

ROS Especies reactivas de oxígeno

Proteína relacionada con tirosinasa TRP

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Ji-Hyun Lee 1,†, Bori Lee 2,†, Yong-Deok Jeon 3, Hyun-Woo Song 2, Young-Mi Lee 2, Bong-Joon Song 4 y Dae-Ki Kim 1,*

1 Department of Immunology and Institute of Medical Science, Jeonbuk National University Medical School, 20, Geonji-ro, Deokjin-gu, Jeonju-si 54907, Jeollabuk-do, Korea; jihyunsh1211@naver.com

2 Departamento de Farmacia Oriental, Facultad de Farmacia e Instituto de Investigación de Medicamentos Orientales de Wonkwang, Universidad de Wonkwang, Iksan 54538, Jeonbuk, Corea; leebori1004@naver.com (BL); cristblack@naver.com (H.-WS); ymlee@wku.ac.kr (Y.-ML)

3 Departamento de Farmacia de Corea, Universidad de Woosuk, 443 Samnye-ro, Samnye-up, Wanju-Gun 55338, Jeollabuk-do, Corea; ydjeon1211jh@woosuk.ac.kr

4 Department of Food Science and Biotechnology, Wonkwang University, Iksan 54538, Jeonbuk, Korea; twinf1@hanmail.net

Correspondencia: daekim@jbnu.ac.kr; Tel.: más 82-63-2703080

Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

For more information:1950477648nn@gmail.com