Las interacciones entre los antioxidantes polifenólicos quercetina y naringenina dictan el comportamiento químico y biológico distintivo relacionado con redox de sus mezclas, parte 2

Por favor contactaroscar.xiao@wecistanche.compara más información

Q a una concentración de 1 μM también tendió a disminuir la expresión de ALOX12 y MT3 (0.05<><0.09) as="" well="" as="" sod2="" and=""><><0.09).the latter="" gene="" codes="" for="" a="" protein="" that="" belongs="" to="" the="" family="" of="" thioredoxins="" and="" acts="" as="" an="" endogenous="" antioxidant="" facilitating="" the="" reduction="" of="" other="" proteins8.in="" contrast,="" to="" n-,o="" at="" 1="" um="" up-regulated="" gtf2i=""><0.05).the other="" genes="" whose="" expression="" was="" significantly="" elevated="" by="" q="" at="" l="" μm="" were="" gsr,="" hspa1a,="" ptgsi,="" and="" txnrd1;="" all="" play="" key="" roles="" in="" building="" cellular="" defenses="" against="" oxidants.="" up-regulation="" of="" gsr="" is="" crucial="" for="" maintaining="" redox="">homeostasisen las células porque la proteína codificada mantiene altos niveles de glutatión reducido en el citosol39. A su vez, la chaperona HSPAIA es necesaria para corregir cualquier mal plegamiento que se produzca, también los resultantes de la exposición aantioxidantes. Este último puede cambiar el equilibrio redox hacia un estado reducido, lo que lleva a la reducción más probable de los puentes disulfuro asulfhidrilo

y, por lo tanto, cambia la estructura de la proteína y, por lo tanto, funciona0. El gen PTGS1 codifica una proteína que es además de otro miembro de la familia de enzimas antioxidantes, a saber, la prostaglandina sintasa-241, el cuarto gen mencionado: TXNRD{{4 }}codifica la tiorredoxina reductasa que mantiene la tiorredoxina (TXN) en el estado reducido2.

Por favor haga clic aquí para saber más

De manera similar a 1 μM, Q a mayor concentración (10 μM) también disminuyó la expresión de TXN (p<0.05） and="" sod2=""><><0.09). furthermore,="" a="" drop="" in="" expression="" was="" observed="" for="" sod1=""><><0.09). the="" investigated="" flavonol="" at="" 10μm="" influenced="" the="" expression="" of="" also="" 4="" genes="" up-regulated="" by="" its="" lower="" concentration∶="" gsr,="" hspa1a,="" ptgs1,="" and="" txnrd2=""><0.05). the="" additional="" up-regulated="" genes="" by="" the="" higher="" q="" concentration="" included="" gstz1="" and="" stk25=""><0.05) as="" well="" as="" gpx4="" and="" sirt2=""><><0.09). the="" protein="" encoded="" by="" gstz1="" is="" a="" member="" of="" the="" glutathione="" s-transferase="" family="" that="" are="" key="" enzymes="" implicated="" in="" the="" detoxification="" of="" electrophilic="" molecules="" by="" conjugation="" with="" gsh4,="" while="" stk25="" codes="" for="" serine/threonine="" kinase="" 25,="" a="" protein="" activated="" by="" oxidative="" stress="" that="" induces="" apoptotic="" cell="" death.="" in="" turn,="" gpx4="" codes="" for="" glutathione="" peroxidase="" 4,="" which="" supports="" the="" antioxidant="" barrier="" of="" the="" cell="" by="" catalyzing="" the="" reduction="" of="" peroxides="" by="" glutathione="" the="" up-regulation="" of="" sirt2,="" encoding="" nad-dependent="" protein="">desacetilasa, que desacetila las lisinas internas presentes, por ejemplo, en histonas o factores de transcripción, juega un papel en la modulación de procesos biológicos clave, como el control del ciclo celular, la diferenciación celular o la integridad genómica46.

Cistanche puede mejorar la inmunidad

La mezcla de agliconas a 1 μM disminuyó la expresión de APOE, CCL5, MT3 y MSRA al grado de alcanzar significancia estadística (p<0.05). the="" apolipoprotein="" encoded="" by="" apoe="" is="" a="" core="" component="" of="" plasma="" lipoproteins="" and="" is="" involved="" in="" their="" production,="" conversion,="" and="" clearance47.="" the="" protein="" encoded="" by="" msra="" carries="" out="" the="">enzimáticoreducción de sulfóxido de metionina a metionina, por lo que esta proteína funciona en la reparación de proteínas dañadas oxidativamente para restaurar la actividad biológica8. La mezcla QN a 10 μM, de manera similar a la dosis más baja, disminuyó la expresión de APOE, MT3 y MSRA (p<0.05). however="" at="" a="" higher="" concentration.="" the="" set="" of="" down-regulated="" genes="" was="" extended="" to="" incorporate="" cygb="" and=""><0.05). the="" latter="" gene="" sepp1="" encodes="" selenoprotein="" p="" the="" extracellular="">glicoproteínaque tiene un papel antioxidante y parece estar asociado con las células endoteliales49. La mezcla QN-solo potenció levemente la expresión del gen PRDX5 que codifica un miembro de la familia de enzimas antioxidantes peroxirredoxina, cuyo papel es reducir el peróxido de hidrógeno y el alquilo.hidroperóxidos50.

Discusión

La base científica de las observaciones epidemiológicas que indican que las frutas y verduras enteras son más eficaces para prevenir enfermedades crónicas no infecciosas que los compuestos bioactivos aislados de ellas es poco conocida. El concepto de sinergia alimentaria, que asume la influencia aditiva o incluso sinérgica de diferentes ingredientes alimentarios sobre la salud humana, se ha propuesto como una posible explicación. Sin embargo, tal razonamiento fue socavado en cierta medida por nuestra investigación anterior en la que comparamos la bioactividad de vegetales de diferente pigmentación (brásicas), así como frutas de baya, blancas y que contienen antocianinas, y no encontramos un patrón de actividad que pudiera atribuirse a variedades de color, con a excepción de una mayor actividad antioxidante en pruebas químicas51. Tampoco se compararon los efectos biológicos con los de la cianidina -3-O-glucósido aislada investigada en la concentración que se presenta en el material vegetal estudiado12. Otras investigaciones mecánicas sobre la reconstitución del cacao tampoco mostraron efectos biológicos aditivos/sinérgicos de las mezclas de componentes como predice el concepto de sinergia alimentaria, sino una bioactividad totalmente alterada3. Las mezclas posteriores de polifenoles de cacao parecían comportarse como nuevas sustancias. Planteamos la hipótesis de que las interacciones entre los componentes individuales de la mezcla podrían crear una nueva entidad que mostrara propiedades fisicoquímicas modificadas que dieran como resultado actividades biológicas novedosas. De hecho, se demostró que la variedad de posibles interacciones entre polifenoles (hidrógeno, n, hidrofóbico, quelante, covalente y electrostático), descubiertas durante las investigaciones sobre su aplicación como estabilizadores de nanopartículas autoensambladas, produce una variedad de estructuras que difieren en su funcionalidad. También se observó que estos fitoquímicos suelen ejercer más de un tipo de fuerzas de atracción estabilizadoras. En la investigación actual, investigamos cómo la interacción de competir a menudo por interacciones en una mezcla de solo dos antioxidantes polifenólicos impactó sus actividades relacionadas con redox en comparación con los componentes individuales.

La primera serie de experimentos se concentró en determinaciones químicas y electroquímicas de parámetros que caracterizan la oxidación de flavonoides individuales y mixtos 1:1 (representantes del grupo flavonol y flavanona), por separado en forma de aglicona (Q N-) y glucósido (R, N plus). . Las correlaciones entre los resultados de estas mediciones se dan en la Fig. 8. Las evaluaciones iniciales realizadas por la prueba por lotes DPPH más popular mostraron que, aunque ambas flavanonas (N-, N plus) parecían antioxidantes muy débiles, aumentaban la actividad antioxidante de las mezclas, tanto QN como RN plus, de manera sinérgica (Fig. 2A). El análisis DPV proporcionó una explicación más profunda de este efecto y señaló el impacto decisivo de la cinética de la reacción. Resultó que las flavanonas estudiadas liberan fácilmente electrones de acuerdo con el alto valor del parámetro termodinámico E (Fig. 2C). Aún así, la cinética de este proceso fue demasiado lenta para ser observable mediante pruebas de DPPH y PT. Los flavanoles, fuertes antioxidantes en la prueba DPPH y PT, exhibieron en DPV las propiedades opuestas: termodinámica desfavorable de liberación de electrones, pero una alta tasa del proceso de oxidación. La comparación de las estructuras de los radicales intermedios sugiere que el radical semiquinona flavonol es más estable que el radical fenoxilo flavanona debido a varios mecanismos estabilizadores (Fig. 1). De ello se deduce que la estabilización del radical intermedio es de crucial importancia para la cinética de la reacción de oxidación y, en consecuencia, para la actividad reductora de los compuestos investigados.

La actividad antioxidante final de las mezclas estudiadas se magnifica a través de los factores termodinámicos, impactando favorablemente en el proceso de oxidación, lo que posteriormente mejoró la cinética de reacción (Fig. 2B-F). Un mecanismo más detallado de esta mejora permanece actualmente sin explicación, lo más probable es que involucre interacciones específicas de flavonol/flavanona. Esta mejora se observó no solo en un tubo de ensayo, sino también en circunstancias celulares, como lo demuestra el ensayo CAA en el que la actividad antioxidante de ambas mezclas, ON y RN plus, desplazó la actividad antioxidante por encima de la de los componentes individuales (Fig. 4). La parte química de nuestras investigaciones reveló la discrepancia en la actividad antioxidante entre los compuestos individuales y sus mezclas. Uno puede

señalan la importancia de la cinética de la reacción de oxidación para la actividad antioxidante general y sugieren que las interacciones entre los componentes individuales influyen en las propiedades redox de la mezcla. Debe ser correcto al menos en este caso cuando la presencia de flavonoles (Q, R) en la mezcla aumentó la capacidad de las flavanonas (N-, N plus) para donar electrones.

La parte posterior de la investigación se concentró en la comparación de las propiedades biológicas relacionadas con redox exhibidas por flavonoides individuales (O, R, N-, N plus) y sus mezclas (ON- y RN plus). Las células de cáncer de colon humano HT29 sirvieron como modelo recomendado para estudios nutricionales del tracto alimentario humano3, sin embargo, en este estudio, algunas interpretaciones de datos también se refieren a la naturaleza neoplásica de esta línea celular. Se ha aceptado generalmente hoy en día que el equilibrio redox es vital para la supervivencia y función celular; por lo tanto, la exposición a antioxidantes exógenos así como a ROS puede modular muchos procesos celulares. Tras el estrés reductor, la abundancia insuficiente de ROS puede alterar la señalización celular a través de vías dependientes de redox6. El exceso de ROS, por otro lado, conduce al estrés oxidativo y aumenta el riesgo de daño oxidativo a los componentes celulares. El punto de partida biológico de este semental fue la evaluación del impacto de los antioxidantes, individuales y en la mezcla, sobre el crecimiento celular; la actividad que depende de la homeostasis redox celular, ya que la concentración adecuada de ROS es clave para la activación de la señalización que desencadena la proliferación celular. Los resultados de la prueba de viabilidad celular MTT revelaron diferencias sustanciales entre los tratamientos. Los compuestos puros no afectaron significativamente la proliferación celular en comparación con las células de control no tratadas; el crecimiento celular alcanzó un nivel constante en la amplia gama de concentraciones. Por el contrario, ambas mezclas (QN-, RN plus) estimularon significativamente la proliferación celular. Este último efecto puede no estar necesariamente relacionado únicamente con las propiedades antioxidantes de las mezclas, porque los resultados del ensayo CAA para O fueron similares a los de la mezcla ON. No obstante, las mezclas, pero no los componentes individuales, aparentemente ayudaron mejor a las células HT29 a lidiar con el estrés oxidativo residual, por ejemplo, restaurando el estado redox óptimo; el efecto observado previamente para antioxidantes tan fuertes como las catequinas55. Aunque el aumento sinérgico de la actividad antioxidante observado para las mezclas puede percibirse como un efecto beneficioso, el hecho de que tales combinaciones de antioxidantes estimulen el crecimiento de células cancerosas no es deseable. Los pros y los contras de los antioxidantes y las ERO en el cáncer han sido tema de debate durante algún tiempo y llevaron a la conclusión de que los antioxidantes pueden promover el cáncer a través de mecanismos complejos56, lo cual también se ve aquí.

Otro hallazgo interesante fue que los efectos indeseables de los tratamientos, como la actividad prooxidativa de N-revelada por el ensayo CAA, así como la genotoxicidad de Q observada en el ensayo Comet, se suavizaron para las mezclas. El último ensayo reveló que el daño en el ADN causado por la concentración más alta estudiada (100 uM) de O puro disminuyó al nivel de control para la concentración equimolar de la mezcla QN- (Fig. 5) que puede estar relacionado con la actividad antioxidante mejorada de ON -observado en pruebas electroquímicas. En el caso de la evaluación de la actividad antioxidante celular, las agliconas exhibieron propiedades antioxidantes (O) o prooxidantes (N-) más claras que los glucósidos correspondientes (Fig. 4). N- en concentraciones fisiológicas no anuló la capacidad de amortiguación redox de las células HT29 normóxicas, mientras que en concentraciones más altas que las encontradas en el plasma humano exhibió un efecto prooxidativo dependiente de la concentración que disminuyó con el tiempo de exposición. En general, las agliconas disminuyeron su impacto inicial en el estado redox celular a lo largo del tiempo (Fig. 4). Ambas mezclas mostraron una actividad antioxidante mejorada, aparentemente no influenciada por el efecto prooxidativo observado para los compuestos individuales.

El impacto diferenciado de las mezclas en comparación con los componentes individuales también se observó en la versión epigenética del ensayo del cometa empleado para controlar los cambios en la metilación del ADN. Los flavonoides individuales mostraron la tendencia a disminuir la metilación global del ADN de una manera dependiente de la concentración, con la excepción de R, que no influyó en esta modificación epigenética (Fig. 6). Ambas mezclas también redujeron el nivel global de metilación del ADN, pero no se notó ninguna correlación con la concentración. Cabe señalar que no solo el estado redox puede desempeñar un papel en la combinación de polifenoles, ya que, en el caso de la metilación del ADN, el impacto de los flavonoides estudiados tampoco parece estar asociado con sus propiedades reductoras. Se sabe que la desmetilación activa implica la oxidación iterativa del grupo metilo en la 5-metilcitosina a la forma carboxi5758, por lo que se espera que los antioxidantes bloqueen este proceso. En nuestros experimentos, observamos el impacto opuesto. Por lo tanto, aquí lo más probable es que interviniera otro mecanismo, que es la inhibición de la ADN metiltransferasa (DNMT1), la enzima que cataliza la transferencia de grupos metilo a estructuras CpG de dinucleótidos en el ADN. El bloqueo del mantenimiento del patrón de metilación conduce a la desmetilación pasiva durante rondas consecutivas de replicación del ADN. Nuestros resultados están en línea con otros estudios que demostraron la inhibición de DNMT1 por quercetina9. También se demostró que algunas flavanonas, incluida la N-, inhiben la actividad de DNMT1 en extractos nucleares de células KYSE-510 de carcinoma de células escamosas de esófago humano. Nuestro estudio también mostró que mezclar Q con N-causó una caída notable en el nivel de metilación del ADN en todas las concentraciones probadas de esta mezcla. Se observó un resultado similar para RN plus; sin embargo, la hipometilación del ADN ocurrió en menor medida. Todas estas observaciones pueden ser de interés desde un punto de vista terapéutico. El patrón de metilación del ADN en el cáncer se caracteriza, por un lado, por la pérdida global de metilación en los cuerpos génicos y las regiones intergénicas, ¡lo que lleva a la atenuación de la estabilidad del genoma!, por otro lado, por ¡hipermetilación de regiones ricas en CpG en promotores y silenciamiento transcripcional de la expresión de genes supresores de tumores (TSG)! Por lo tanto, la hipometilación del ADN inducida por los polifenoles puede restaurar la expresión de los genes TSG silenciados y también aumentar gradualmente la inestabilidad del genoma del cáncer hasta el punto de provocar la muerte celular.

Los efectos celulares descritos de los polifenoles estudiados mostraron que no solo el contenido, la composición o la biodisponibilidad, sino también las interacciones entre los componentes modulan las propiedades electroquímicas y biológicas de las mezclas. Esta conclusión también fue vívidamente respaldada por la última actividad analizada en este estudio, es decir, la modulación de la expresión de un amplio espectro de genes asociados con la defensa antioxidante y la respuesta al estrés oxidativo. El diagrama de Venn (Fig. 7C) resume el impacto de las agliconas flavonoides investigadas en la modulación de la expresión génica. En el caso de los compuestos puros (O, N-) a 1 uM, solo un gen (GTFZI) resultó afectado por ambos flavonoides. Sin embargo, N-causó una regulación a la baja de este gen, mientras que Q aumentó su expresión. Este impacto no se mantuvo a concentraciones más altas de compuestos puros ni se observó para su mezcla en ninguna dosis. N y la mezcla QN-regularon a la baja también otros dos genes, CCL5 y MT3, a 1 μM y tres genes que abarcan CYGB, MT3 y MSRA a 10 μM. Lo más sorprendente es que no se encontraron similitudes en la regulación de la expresión de genes entre Q y QN, ni entre Q, N y QN, en ninguna de las concentraciones investigadas. Además, la mezcla QN cambió significativamente la expresión de otros tres genes (regulación negativa de APOE y SEPPI, regulación positiva de PRDX5) cuya actividad transcripcional no se vio afectada por ninguno de los componentes individuales. En conclusión, nuestro estudio demuestra que las propiedades biológicas de las mezclas de polifenoles no son solo la combinación de actividades mejoradas o debilitadas exhibidas por componentes individuales. Estas observaciones indican que la bioactividad de los fitoquímicos en las mezclas debe ser el resultado de interacciones entre los componentes que conducen a la aparición de una nueva sustancia con propiedades químicas y biológicas novedosas que son difíciles de predecir. Los resultados de las determinaciones realizadas en nuestro estudio no solo respaldan , sino que en realidad amplían la idea del concepto de sinergia alimentaria enfatizando el hecho de que incluso modificaciones menores en la composición de una mezcla de fitoquímicos transmitidos por los alimentos (probablemente también ingredientes alimentarios de otros orígenes) crean una nueva entidad cuyo impacto en la salud humana puede no necesariamente parecerse a ese de componentes individuales. Esta noción socava la forma actual en que se diseñan los suplementos dietéticos, que se basan en declaraciones de propiedades saludables establecidas a partir de la investigación de compuestos aislados. Desde una perspectiva de quimioprevención dietética, el estudio presentado explica por qué el enfoque actual que enfatiza el uso de componentes alimentarios bioactivos aislados no pudo igualar las observaciones epidemiológicas realizadas para los alimentos enteros que la gente ingiere. Para que los complementos alimenticios ofrezcan verdaderos beneficios para la salud a largo plazo de las personas, es vital que las combinaciones de supuestos agentes se estudien juntas y dentro de un contexto biológico.

materiales y métodos

Productos químicos, reactivos. Los siguientes compuestos bioactivos se utilizaron para el estudio: quercetina (Q), rutina (R), naringina (N plus) y naringina (N-) de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Se utilizaron metanol de grado analítico y metanol de POCH (Polonia) así como DMSO de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Se utilizó el sistema QPLUS185 de Millipore (EE. UU.) para purificar el agua. Para las evaluaciones de la actividad antioxidante mediante prueba espectrofotométrica, se aplicó 1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) de Sigma-Aldrich (EE. UU.).0. Tampón de fosfato de sodio 1 M preparado disolviendo Na, HPO12H , O y NaH, PO2H, O (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en agua desionizada se utilizó en estudios electroquímicos. El electrodo de trabajo y la celda electroquímica se limpiaron con una solución de permanganato de potasio 10 mM (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en 95 por ciento H, SO, (y/y) (POCH, Polonia). El electrodo de referencia se almacenó en KCl 3 M (Sigma-Aldrich, EE. UU.) disuelto en agua desionizada. Todos los reactivos utilizados en el cultivo celular (PBS, medio 5A de McCoy, tripsina, suero bovino fetal, antibióticos) se adquirieron de Sigma-Aldrich (EE. UU.). La solución de PBS se preparó disolviendo una tableta en 200 ml de agua purificada, bromuro de tetrazolio azul de tiazolilo (MTT) de Sigma-Aldrich (EE. UU.) en la prueba MTT. El ensayo de antioxidantes celulares OxiSelect

El kit se adquirió de Cell Biolabs, Inc. (EE. UU.). Se utilizaron los siguientes reactivos para el ensayo cometa: ácido clorhídrico (HCl), agarosa de bajo punto de fusión (agarosa LMP), cloruro de sodio (NaCl, hidróxido de sodio (NaOH), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA),2-amino{{1 }}(hidroximetil)-1,3-propanodiol (Trizma-Base), tinción de gel de ácido nucleico Sybr Green I y Triton X-100 de Sigma-Aldrich (EE. UU.), así como fusión normal agarosa puntual (agarosa NMP) de Bioline (Reino Unido). Además, en el ensayo cometa sensible a la metilación, se aplicaron proteinasa K (Merck, EE. UU.), enzimas de restricción (HpalI/MspI) y tampón Tango (Promega, Reino Unido). , RNeasy Mini Kit, RNase-Free DNase set, RT² First Strand Kit, RT²SybrGreen qPCR Mastermix, RT2Profiler PCR Arrays for Oxidative Stress (PAHS 0065) de Qiagen (Alemania) se utilizaron en estudios genómicos.

Este artículo está extraído dewww.nature.com/scientificreports