La protección intestinal por proantocianidinas implica acciones antioxidantes y antiinfammatorias en asociación con una mejora de la sensibilidad a la insulina, la homeostasis de lípidos y glucosa Parte 2
Apr 28, 2022
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Expresión de Tein usando Western blot. La Figura 6 muestra que la adición de Fe/Asc a las células Caco-2/15 elevó el nivel de las dos enzimas importantes, pero los PAC contrarrestaron su regulación al alza inducida por Fe/Asc.
Dado que la señalización de la insulina modula los procesos de lipogénesis, FA β-oxidación y gluconeogénesis, fue importante investigar la influencia de Fe / Asc y PAC en MAPK y PI3K / Akt, las dos principales vías de señalización de insulina. Con este fin, las células Caco-2/15 fueron pre-incubadas con insulina antes que las otras células Caco-2/15
Figura 6.Efectos de los PAC sobre la glucogénesis en células Caco-2/15. Se añadieron proantocianidinas (PAC, 250 ug/ml) al compartimento celular apical durante 24 h antes del tratamiento con Fe/Asc (200μM/2 mM) durante 6h a 37 °C. La expresión proteica de(A) G6Pasa y (B)PEPCK fue evaluada por Western blot.cistanche en polvoLos resultados representan las medias±SEM de 3 experimentos independientes, cada uno por triplicado. Se muestra un Western blot representativo, que ilustra un experimento por triplicado en el mismo gel y a la misma exposición.<0.05 vs="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc="" treated="" cells.="">raíz de cistancheG6Pasa glucosa-6-fosfatasa, PEPCK fosfoenolpiruvato carboxiquinasa.
tratamientos para activar la vía de señalización. Mientras que Fe/Asc elevó la expresión de la proteína p38-MAPK y la relación fosfo p38-MAPK/p38-MAPK, los PAC impidieron estas acciones (Fig.7A-C). Por otro lado, mientras que Fe/Asc redujo la masa proteica de fosfo Akt (pAkt) y la relación Akt/Akt, los PAC mostraron una capacidad para mantener su nivel normal. Una tendencia similar se observó para PI3K (Fig. 7D-I. Por lo tanto, estas observaciones apoyan el papel favorable de los PAC en la señalización de la insulina.
Discusión
Los polifenoles son bien conocidos por sus efectos biológicos y medicinales pleiotrópicos, lo que explica la atracción de muchos científicos e industrias alimentarias a estos fascinantes productos naturales derivados de plantas. Los PAC destacan de la variedad y un elevado número de polifenoles por sus impactos farmacológicos y terapéuticos en los trastornos crónicos2021. A pesar de sus características loables, todavía hay mucho que se desconoce sobre su influencia en el tracto gastrointestinal, que despliega redes digestivas, inmunológicas, neuronales y metagenómicas extendidas2.sueño cistanchePor esta razón, se han dedicado esfuerzos en la presente investigación para aclarar el papel de los PAC en el OxS intestinal, la defensa antioxidante, la inflamación, la fa β-oxidación, la lipogénesis y la gluconeogénesis, mientras que al mismo tiempo se intenta dilucidar los mecanismos subyacentes como la señalización de la insulina y el estado de los factores de transcripción.
Para sondear los efectos de la PAC, utilizamos la línea celular Caco-2/15, un modelo intestinal popular predominantemente apreciado por la comunidad científica2, y reconocido por la Administración de Alimentos y Medicamentos para los procesos de captación y transporte4. Las células Caco-2/15 no solo se diferencian espontáneamente en enterocitos humanos funcional y morfológicamente similares3,25, sino que también sirven para la exploración eficiente de la absorción e interacciones intestinales, la nutrición, la toxicología, la microbiología de los alimentos, las pruebas de biodisponibilidad y la detección de la permeabilidad a los medicamentos en el programa de descubrimiento2²627. Al igual que en nuestros informes anteriores sobre diversos temas28-3】, la línea celular Caco-2/15 ha sido fundamental en el estudio actual para desentrañar el potencial de los PAC para regular diversas vías metabólicas. Es importante destacar que, en este estudio, las células se sembraron en filtros porosos, permitiendo el acceso a ambos lados del epitelio intestinal bipolar: compartimentos apical y basolateral correspondientes a la luz intestinal o circulación serosal, respectivamente Adicionalmente, preincubamos células Caco-2/15 con Fe/Asc, ya que este sistema fue altamente relevante en nuestro laboratorio para inducir OxS fuertes e inflamación, que a su vez fueron desafiados por un amplio espectro de efectores17,1932-3 Cabe destacar que Fe/Asc como un fuerte sistema generador de radicales de oxígeno causa daño oxidativo a macromoléculas biológicas, altera el ambiente redox intracelular y está involucrado en numerosos estados patológicos2.35,56.Nuestros hallazgos muestran una elevación significativa de la peroxidación lipídica (altos niveles de MDA) junto con una defensa antioxidante vulnerable (bajas expresiones de proteínas GPx y SOD2).beneficios de cistanche tubulosaAdemás, en virtud de su capacidad para generar peróxidos lipídicos, el complejo Fe/Asc promueve la inflamación como lo demuestra el aumento de la expresión de TNFa, COX2 y NF-is. En conjunto, los resultados actuales validan la generación radical e inflamatoria en respuesta a Fe/Asc
La presencia de PAC contrarrestó la peroxidación lipídica mediada por Fe/Asc. Como el fracaso de la defensa antioxidante podría explicar la inducción de OCS, examinamos su acción sobre las enzimas antioxidantes endógenas. De hecho, los PAC fueron capaces de restaurar la disminución de SOD2 y GPx mediada por Fe / Asc. Para delinear el mecanismo de exacerbación de OxS por Fe/Asc y alivio por PACs, evaluamos la vía de señalización keap1-NRF2-antioxidant response element (ARE), que se considera el regulador antioxidante endógeno más potente37.té cistancheNRF2 es un sensor OCS celular cuya función es mantener la homeostasis redox. En condiciones normales. NRF2 está continuamente ubiquitinado y dirigido a la degradación proteasómica por su regulador de enlace negativo Keap18. En presencia de efectores endógenos y exógenos, Keapl se inactiva y regula a la baja, interrumpiendo así la interacción Keapl-NRF2 y liberando NRF2, que se transloca al núcleo celular, se une a los promotores que contienen
Figura 7. Efectos de los PAC sobre la sensibilidad a la insulina en la línea celular Caco-2/15. Se añadieron proantocianidinas (PAC, 250 ug/ml) al compartimento celular apical durante 24 h antes del tratamiento con Fe/Asc (200 μM/2 mM) durante 6 h a 37 °C. Dos horas antes del final de la incubación de 6h con mezcla de Fe/Asc, se agregó insulina (100 nM) para evaluar la sensibilidad a la insulina. La expresión proteica de(A) p38-MAPK,(B) fósforo p38-MAPK,(D)Akt,(E)fosfo Akt,(G) PI3k, y (H) fosfo PI3k fue evaluada por Western blot. A continuación, se calcularon las proporciones (C) fosfo p38-MAPK/p38-MAPK,(F)fosfo Akt/Akt, y (Dphospho PI3k/PI3k. Los resultados representan las medias±EM de 3 experimentos independientes cada uno por duplicado. Se muestra un Western blot representativo, que ilustra un experimento por triplicado en el mismo gel y con la misma exposición.*P<0.05 vs+/-insulin="" untreated=""><0.05 vs="" fe/asc+/-insulin-treated="" cells.p38-mapkp38-mitogen-activated="" protein="" kinase,="" pi3k="" phosphoinositide="" 3-kinase,="" akt="" protein="" kinase="">
ARE, y acelera la transcripción de enzimas antioxidantes39. Según nuestros datos, el tratamiento de células Caco-2/15 con PAC reprimió Keapl y probablemente permitió que NRF2 se translocara al núcleo permitiendo la unión a ARE (secuencia central: 5'TGACnnnGC3') en la región promotora de genes antioxidantes (SOD2 y GPx), lo que resultó en la estimulación de su transcripción y la regulación ascendente coordinada. En línea con estos datos, el compuesto fenólico de resveratrol previno OxS en los sinoviocitos similares a fibroblastos de artritis reumatoide tratados con H, O, al promover la expresión de NRF2 y disminuir la expresión de Keap12. Además, según Kanzaki et al, la activación de enzimas antioxidantes y citoprotectoras puede asociarse con la relación NRF2/Keapl1.
Como se esperaba de la mejora de OCS, los PAC redujeron significativamente la inflamación, como lo demuestra la regulación a la baja de TNFa y COX2. Debido a que NF-KB es un regulador clave de las citoquinas proinflamatorias, examinamos su respuesta a los PAC. En línea con la tendencia de los agentes inflamatorios, los PAC abrogaron la inducción NF-KB mediada por Fe/Asc y redujeron la relación NF-KB/IikB. Por lo tanto, podemos suponer razonablemente que los PAC ayudan a protegerse contra la inflamación que pone en peligro las funciones de las células intestinales a través del control de NF-kB, el regulador maestro de la respuesta inflamatoria. Vale la pena mencionar que los PAC pueden proteger de la inflamación mediante la estimulación de los mecanismos defensivos antioxidantes celulares, ya que existe una estrecha relación entre los biomarcadores de desequilibrio redox y la inflamación2.
El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos de Pac sobre la homeostasis lipídica intestinal. Nuestros interesantes hallazgos mostraron que los PAC regularon al alza la CPTla, por un lado, y los FAS regulados a la baja, que representan los biomarcadores de la FA β-oxidación y lipogénesis, respectivamente. Por lo tanto, estas enzimas son objetivos potenciales de los PAC, lo que indica el potencial polifenólico para prevenir la acumulación de lípidos, considerada una manifestación patológica de la inflamación de OxSand en muchos tejidos*3. Los mecanismos moleculares están probablemente relacionados con la regulación ascendente de PPARa y la regulación a la baja de SREBPlc, dos factores de transcripción que regulan el metabolismo de los lípidos. FAS es la enzima central en la lipogénesis, responsable de catalizar la conversión de malonil-CoA a FAs45.Por su parte, ACC cataliza la formación de malonil-CoA, un sustrato esencial para FAS. En línea con nuestros hallazgos, también se encontró que los polifenoles solanum nigrum disminuyen el SAF y los SSREBP, al tiempo que aumentan la CPTla y la PPARa en los hepatocitos tratados con ácido oleico"6.
Los mecanismos de acción de los polifenoles se asocian generalmente con la activación de la fosforilación de AMPKa7. Es importante destacar que el AMPKa fosforilado en nuestro estudio fue reducido por Fe / Asc, pero estimulado por los PAC, lo que explica la regulación a la baja del fosfo ACC, lo que resulta en una lipogénesis inhibida y un aumento del metabolismo energético. Sin embargo, la expresión proteica de AMPKa fue aumentada por OxS inducido por Fe/Asc en células Caco2/15. En consecuencia, ROS y OxS pueden inducir AMPKa a través de diferentes quinasas aguas arriba8.
El OCS y la inflamación inducen fuertemente resistencia a la insulina y trastornos metabólicos adicionales9,50, lo que nos llevó a evaluar la capacidad de Pac para regular algunas proteínas clave en relación con la vía de señalización de la insulina. Primero nos centramos en p38-MAPK, cuya expresión se encontró regulada al alza por OxS mientras interfería con la cascada de señalización del receptor de insulina. El análisis bothe de la p38-MAPKfosforilación y el cálculo de la relación fosfo p38-MAPK/p38-MAPK revelaron un aumento significativo en la respuesta a Fe/Asc, que es compatible con IS deteriorado en células Caco-2/15. La validación se obtuvo por la disminución de pAkt y PI3K. En contraste, los PAC invirtieron la tendencia ya que mostraron la capacidad de disminuir la fosforilación p38-MAPK y la relación fosfo p38-MAPK / p38-MAPK al tiempo que mejoraron la vía de señalización PI3K / Akt, que se sabe que media las principales acciones biológicas de la insulina al regular el transporte de glucosa, la síntesis de proteínas, la proliferación celular, la supervivencia celular y la gluconeogénesis. El deterioro en el IS debido a OxS y la inflamación crónica también puede afectar el proceso de gluconeogénesis3,54. El análisis de las dos enzimas principales involucradas en la síntesis de glucosa de novo (PEPCK, G6Pasa) reveló un aumento significativo en la respuesta a Fe/Asc, mientras que la administración de PAC las devolvió a niveles normales en las células Caco2/15.
En conclusión, numerosos estudios en la literatura científica demuestran efectos significativos en la salud de los compuestos fenólicos, ya sea como una molécula fenólica específica o una mezcla de varios polifenoles por evidencia indirecta. El presente trabajo señala el efecto crucial de los PAC (flavanoles complejos) en la homeostasis intestinal mediante la prevención de OxS, inflamación y trastornos metabólicos relacionados. Dado que los PAC pueden no ser totalmente absorbidos por el intestino medio, se necesitan más estudios para investigar los mecanismos involucrados en sus efectos beneficiosos para la salud en el intestino delgado.
Material y métodos
Cultivo y tratamiento celular intestinal de Caco-2/15. Para todos los experimentos, utilizamos la línea celular de adenocarcinoma colorrectal epitelial humano Caco-2/15, un clon estable de las células madre Caco-2 (American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA), que se obtuvo del Dr. J.F. Beaulieu (Departamento de Biología Celular, Facultad de Medicina, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canadá). La línea celular Caco-2/15 tiene la propiedad única de diferenciar in vitro en enterocitos maduros polarizados y formar un mon-over impermeable. Las células Caco-2/15 fueron cultivadas como se describió anteriormente323455 y utilizadas para el estudio de la integridad celular, OCS e inflamación17,19 e IS56.
Análisis de la expresión proteica por immunoblotting. Después de la incubación con varios tratamientos, las células caco-2/15 se lisaron en tampón helado que contenía 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM Na2E-DTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40,1% desoxicolato, 2.5 mM pirofosfato de sodio, 1 mM Na2VO4, 1 ug / mL leupeptina y 1 mM PMSF. La concentración de proteínas de cada muestra se determinó utilizando el método de Bradford (Bio-Rad). Las proteínas se desnaturalizaron durante 5 minutos en un tampón de muestra que contenía SDS y ß-mercaptoetanol. Los homogeneizados que contenían 15 proteínas totales ug se separaron en un gel de poliacrilamida SDS al 10% de acuerdo con el peso molecular de la proteína y se electrobloquearon en membranas de nitrocelulosa. Se utilizó leche libre de grasa para bloquear sitios inespecíficos de las membranas antes de agregar anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. La dilución de anticuerpos se informa en Información complementaria y en nuestra reciente publicación. Las bandas reactivas se capturaron utilizando un sistema de imágenes ChemiDoc MP (Bio-Rad). Todos los datos se expresan como la relación entre la proteína objetivo y la β-actina en la misma muestra.
Análisis estadístico. Todos los valores se expresan como la media±EM de al menos tres experimentos diferentes realizados por triplicado. Los datos fueron analizados por ANOVA unidireccional seguido de las pruebas de comparaciones múltiples de Tukey utilizando PRISM 7.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). Las diferencias se consideraron significativas en P<>
Este artículo está extraído de Scientifc Reports | (2021) 11:3878 | https://doi.org/10.1038/s41598-020-80587-5
