Abstracto

La D-serina, presente solo en cantidades mínimas en humanos, ahora se considera un biomarcador de enfermedad renal crónica (ERC). la enfermedad renal primaria en la ERC es heterogénea y su diagnóstico requiere una biopsia renal. En este estudio, examinamos si la dinámica in vivo de la D-serina (como lo indican sus niveles en sangre y orina) refleja el origen de la enfermedad renal. Se realizaron biopsias renales a pacientes con seis enfermedades renales en el mismo centro. Los niveles de D-serina y L-serina se determinaron mediante cromatografía líquida bidimensional de alta resolución. La asociación entre el origen de la enfermedad renal y la dinámica in vivo de la d-serina se examinó mediante un análisis de conglomerados multivariado. A diferencia de los pacientes sin ERC, la dinámica de la D-serina se distribuyó ampliamente en los pacientes con ERC. Los niveles plasmáticos de D-serina juegan un papel clave en la detección de la enfermedad renal, mientras que la combinación de los niveles plasmáticos y urinarios de D-serina pueden distinguir el origen de la ERC, especialmente en la nefritis lúpica. la dinámica in vivo de la D-serina es importante para predecir el desarrollo de la enfermedad renal. La monitorización de la D-serina puede orientar el tratamiento específico del origen de la enfermedad renal.

Palabras clave:D-Serina; Biopsia renal; Diagnóstico ;Nefritis lúpica; enfermedad renal crónica; biomarcador;Cistanche tubulosa

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Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema global con más de 10 millones de pacientes en Japón y 850 millones en todo el mundo. La ERC a menudo se define como una anomalía crónica en la estructura o función renal, incluida la tasa de filtración glomerular (TFG), y es de origen heterogéneo. Los orígenes de la ERC incluyen inmunológica, diabética, relacionada con el envejecimiento, rara refractaria y de etiología desconocida. El pronóstico y el tratamiento de la ERC varían según el origen, y el examen anatomopatológico de las muestras de biopsia renal suele proporcionar información clave para el diagnóstico y la evaluación de la actividad de la enfermedad. Aunque la biopsia renal es un procedimiento importante, conlleva riesgos y solo se realiza cuando los beneficios superan los riesgos. Por lo tanto, se están investigando biomarcadores que puedan ayudar a diagnosticar la enfermedad renal.

La D-serina ahora está emergiendo como un biomarcador para la enfermedad renal. La d-serina es uno de los d-aminoácidos, el enantiómero espejo (quiral) de la serina que, a diferencia de la abundante l-serina, solo está presente en cantidades mínimas en la naturaleza. Para medir con precisión la cantidad de d-serina en muestras humanas, se utilizó un sistema bidimensional de cromatografía líquida de alta resolución (2D-HPLC). El sistema 2D-HPLC mejora la medición precisa de trazas de d-serina en sangre humana. El nivel de D-serina en la sangre brinda información clínica crítica porque se correlaciona con la TFG, una de las funciones renales, y también refleja el pronóstico renal de los pacientes con ERC. Además, la excreción urinaria de D-serina proporciona información adicional para la detección de enfermedad renal. Por lo tanto, la evaluación de la cinética in vivo de la D-serina mediante la medición del nivel de D-serina en la excreción en sangre y orina es útil para monitorear la función renal y la viabilidad de la enfermedad.

Estos hechos plantean la hipótesis de si las enfermedades renales pueden afectar a estas dinámicas de forma diferente según su origen. Si es así, el seguimiento de la dinámica de la D-serina in vivo puede ser útil para diagnosticar el origen de la ERC. El presente estudio evaluó la dinámica de la d-serina en pacientes con ERC sometidos a biopsia renal y examinó el potencial de la D-serina para determinar el origen de la enfermedad renal.

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Materiales y métodos

Población de estudio

Reclutamos prospectivamente a pacientes consecutivos que se sometieron a su primera biopsia renal con fines diagnósticos y/o terapéuticos en el Departamento de Enfermedades Renales e Hipertensión del Centro Médico General de Osaka del 2006 al 2016. Las muestras de biopsia se analizaron de forma rutinaria con luz, procedimientos de inmunofluorescencia y microscopía electrónica. Los diagnósticos clínicos y patológicos se establecieron por consenso entre nefrólogos y patólogos experimentados. Extrajimos las causas comunes de la enfermedad renal haciendo referencia al esquema de clasificación histológica de las enfermedades glomerulares publicado por la Organización Mundial de la Salud en 1995. Los orígenes de las enfermedades renales incluyen la nefritis por IgA (IgAN), la enfermedad por cambios microscópicos (MCD), la nefropatía membranosa (MN) , nefropatía diabética (ND), nefropatía hipertensiva (HT) y nefritis lúpica (NL). Diez pacientes de la cohorte del estudio se incluyeron en este estudio para cada origen de la enfermedad renal. Los criterios de inclusión para cada enfermedad fueron los siguientes: IgAN, rango de proteína urinaria 0,5 - 1,5 g/gCre y eGFR >60 mL/min/1,73 m2; MCD, MN, cumple criterios de síndrome nefrótico; ND, antecedente de diabetes mellitus, cociente albúmina/creatinina en orina 30 mg/gCre, FGe 30ml/min/1,73 m2; HN, antecedentes de hipertensión, eGFR > 30 ml/min/1,73 m2. FGe > 60; LN, cumple con los criterios de clasificación de LES de la Sociedad Internacional de Nefrología (ISN)/Sociedad de Patología Renal (RPS) de 2003. Los criterios de exclusión incluyeron (i) casos en los que se había iniciado prednisolona y/o fármacos inmunosupresores, (ii) casos en los que la biopsia renal mostró menos de 10 glomérulos, (iii) casos de lesión renal aguda (IRA) y (iv) casos de MN secundaria. Se recogieron datos demográficos clínicos, datos de laboratorio, índice de actividad de la enfermedad de LES en el momento de la NL (SLE-dai) y muestras de plasma y orina en el momento de la biopsia renal. Los niveles de d-serina en plasma y orina se midieron antes de la biopsia renal. Los datos de referencia para la no ERC se obtuvieron de un informe anterior. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Centro Médico General de Osaka (#29- S0606) y NIBIOHN (#236). El estudio se realizó de acuerdo con los principios éticos de la Declaración de Helsinki, y todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito.

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Ecuaciones de TFG y cálculo del aclaramiento renal

La TFG estimada (eGFR) se calculó utilizando la ecuación japonesa de TFG basada en la creatinina sérica (eGFRcreat):

eGFRcreat(mL∕min∕1.73 m2)= 194 × Cr−1.094× age−0.287× 0.739 (si es mujer)

La creatinina en suero y orina se determinó enzimáticamente. Los niveles de punto fijo urinario de aminoácidos quirales se ajustaron por creatinina. La fracción de excreción (FE, porcentaje) se calculó dividiendo el aclaramiento de sustrato por el aclaramiento de creatinina, de la siguiente manera:

Donde Us y Ps representan los niveles de sustrato en orina y plasma, respectivamente. FE es la proporción de sustrato excretado en la orina después de la filtración glomerular. FE bajo y alto indican reabsorción tubular y excreción, respectivamente.

preparación de la muestra

La preparación de muestras a partir de plasma y orina humanos se realizó y modificó como se describió anteriormente. Se añadió veinte veces el volumen de metanol a la muestra y se colocó (10 μL del sobrenadante obtenido del homogeneizado de metanol) en un tubo marrón sombreado para derivatización NBD (1,0 μL de se usó plasma para la reacción). Después de secar a presión reducida, 20 μL de tampón de borato de sodio 200 mM (pH 8,0) y 5 μL de reactivo marcador fluorescente [40 mM 4-fuoro-7-nitro-2 ,1,3-benzoxadiazol (nnd -f) en MeCN anhidro] y se calentaron a 60 grados durante 2 min. Se tomaron 2 μL de la mezcla de reacción agregando solución acuosa de TFA al 0,1 por ciento (v/v) (75 μL) para 2D-HPLC.

Determinación de enantiómeros de serina por 2D‑HPLC

Los enantiómeros de la serina se cuantificaron utilizando una plataforma 2D-HPLC. Brevemente, los derivados NBD de aminoácidos se sometieron a cromatografía de fase inversa (columna Singularity RP, 1.0 mm id × 50 mm; KAGAMI Inc., Osaka, Japón) utilizando una fase móvil acuosa que contenía MeCN y ácido fórmico. ácido para gradiente de elución. Para la determinación separada de d-serina y l-serina, la fracción de serina se recogió automáticamente usando una válvula de circuito múltiple y se transfirió a una columna p-antiselectiva (Singularity CSP-001S, 1,5 mm id × 75 mm; KAGAMI Inc.). A continuación, la D-serina y la L-serina se separaron sobre una base bidimensional utilizando una columna enantioselectiva. La fase móvil fue una mezcla de MeOH-MeCN que contenía ácido fórmico, y los aminoácidos NBD se detectaron con fluorescencia con dos tubos fotomultiplicadores bajo excitación de 530 nm. El pico objetivo se cuantificó escalando la forma del pico estándar.

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Procesamiento de datos y análisis multivariado

Los datos se centraron en la mediana y se transformaron logarítmicamente para el análisis multivariado. Se utilizó el análisis de componentes principales no supervisado (PCA) o el análisis de mínimos cuadrados parciales ortogonales supervisados ​​(OPLS) para analizar la relación entre los aminoácidos quirales y los parámetros clínicos. El análisis de componentes principales proyecta geométricamente datos complejos de alta dimensión en datos de baja dimensión llamados componentes principales. Los gráficos de carga visualizan el grado de influencia de cada variable sobre el componente principal, así como la correlación entre cada variable. El valor de puntuación de cada observación se traza en el gráfico de puntuación para demostrar la agrupación de observaciones. Se aplicó el método OPLS-DA para probar la distribución discriminable de las variables en función de las variables predictoras. La optimización de ft de los modelos OPLS se evaluó utilizando R²y y q²valores Y. R²Y indica el porcentaje de varianza en las variables examinadas explicadas por el modelo, mientras que Q²Y indica el rendimiento predictivo del modelo. R²y y q²Y superior a 0.5 indica una buena optimización de pies, y se realizaron más de 20 pruebas de reemplazo para cada modelo OPLS para validar el modelo internamente. En el desarrollo del modelo LN, seleccionamos un factor inmutable, el género, y lo eliminamos del análisis de correlación.

Discusión

En este estudio demostramos la utilidad de la monitorización de d-serina en el diagnóstico del origen de la enfermedad renal. La dinámica de la d-serina in vivo depende de los diversos orígenes de la enfermedad renal y tiene el potencial de diferenciar el origen de la enfermedad renal. Los resultados de este estudio contribuyen al diagnóstico certero del origen de la enfermedad renal y al correcto diagnóstico de los casos que requieren biopsia renal. La expresión diferencial de d-serina en diferentes enfermedades renales tiene implicaciones importantes porque puede contribuir al descubrimiento de una nueva fisiopatología de la enfermedad renal.

El estudio actual tiene varias limitaciones que deben reconocerse para interpretar los resultados. El número limitado de pacientes con cada enfermedad no ha estudiado el pronóstico de estos pacientes y estas características pueden oscurecer otras relaciones entre la d-serina y la enfermedad renal. Debido al número limitado de participantes, el análisis de subgrupos es necesario para enfermedades con un amplio espectro de enfermedades, como IgAN y DN. Incluso con estas limitaciones, este estudio identifica claramente el origen de la enfermedad renal y los pacientes se beneficiarían del control de la d-serina para el diagnóstico.

En resumen, evaluar la dinámica in vivo de la d-serina es útil para el diagnóstico de enfermedad renal primaria. La monitorización de la d-serina puede orientar el tratamiento específico de la enfermedad renal, en particular de origen NL. Este estudio abre una nueva dirección para la medicina de precisión utilizando mediciones de d-serina.

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