La investigación de la toxicidad de la ifosfamida induce un regulador corriente arriba común en el hígado y el riñón

Contacto: emily.li@wecistanche.com

Hyoung-Yun Han, et al.

Resumen:

La ifosfamida es un agente alquilante, un análogo sintético de la ciclofosfamida, que se usa para tratar varios cánceres sólidos. En este estudio, se evaluó la toxicidad de la ifosfamida mediante la administración intraperitoneal de dosis única y múltiple en ratas según las pautas de Buenas Prácticas de Laboratorio, y se siguió un experimento de micromatriz adicional para respaldar los hallazgos toxicológicos. Una dosis única de ifosfamida (50 mg/kg) no indujo ningún cambio patológico. Mientras tanto, se observó toxicidad renal severa en los grupos de 7 y 28 días administrados consecutivamente, con aumentos significativos en los niveles de creatinina y nitrógeno ureico en sangre. En el análisis de la lista toxicológica, los genes relacionados con la síntesis de colesterol se vieron afectados principalmente en el hígado y los genes relacionados con la insuficiencia renal se vieron afectados en el hígado.riñóndespués de la administración de ifosfamida. Además, el factor regulador de interferón 7 fue seleccionado como el principal regulador aguas arriba que cambió tanto en elhígadoyriñón, y se descubrió que interactuaba con otros genes diana, como la peptidasa 18 específica de ubiquitina, el dominio radical S-adenosil metionina que contiene 2 y el gen 15 estimulado por interferón, que se confirmó aún más mediante el análisis de RT-PCR en tiempo real. En conclusión, reconfirmó la toxicidad orgánica de ifosfamida con sesgo renal e identificó genes alterados de manera idéntica tanto en elhígadoyriñón. Se requieren más estudios toxicogenómicos completos para revelar la relación exacta entre los genes inducidos por ifosfamida y la toxicidad de los órganos.

Palabras clave:ifosfamida; hepatotoxicidad; nefrotoxicidad; toxicidad intraperitoneal

La cistanche es buena para el hígado y los riñones.

1. Introducción

La ifosfamida es un agente alquilante, un análogo sintético de la ciclofosfamida, que se usa para tratar varios cánceres sólidos, incluidos los sarcomas y los linfomas. La ifosfamida es un fármaco anticancerígeno no específico del ciclo celular que interfiere con la replicación del ADN y la producción de ARN [1]. Aunque la ifosfamida se tolera relativamente bien en comparación con otros agentes alquilantes tóxicos, se sabe que está asociada con numerosos efectos adversos potencialmente mortales que limitan su uso clínico [2]. Los principales efectos secundarios de la ifosfamida incluyen lesión renal grave resultante de las especies tóxicas reactivas de la ifosfamida, incluida la insuficiencia renal aguda.riñón lesión, nefritis intersticial, cistitis hemorrágica y síndrome de Fanconi [3]. En las clínicas, se informó toxicidad orgánica múltiple grave en pacientes que experimentaron toxicidad renal temprana y falla repetida de un órgano inducida por dosis altas de ifosfamida que condujo a una falla orgánica posterior [4,5].

El metabolito tóxico de la ifosfamida, la acroleína y el cloroacetaldehído, es uno de los principales factores responsables de la toxicidad orgánica de la ifosfamida. Estudios anteriores se han centrado principalmente en los factores que afectan la conversión de ifosfamida en metabolitos tóxicos, en particular el citocromo P450 (CYP) [6]. CYP3A4 y CYP3A5 relativamente abundantes en el riñón provocan cambios tóxicos en la ifosfamida e inducen nefrotoxicidad [7]. La acroleína es un aldehído altamente reactivo que puede activar la vía de los genes oxidativos reactivos intracelulares y dañar el orgánulo celular. El cloroacetaldehído informó la supresión de la activación del complejo I en la cadena respiratoria mitocondrial que podría conducir al agotamiento del glutatión intracelular (GSH) y la muerte celular [8].

Un estudio toxicológico de múltiples órganos es más útil para comprender los efectos sistémicos de los fármacos que centrarse en órganos específicos para los estudios de toxicidad. El hígado y los riñones son los órganos principales que participan en el metabolismo y la excreción de fármacos, y estos órganos principales están predispuestos a las reacciones adversas a los fármacos; a menudo sigue la toxicidad de los órganos. Además, la evaluación toxicológica integradora puede presentar varios hallazgos patológicos que pueden ayudar a comprender y predecir la toxicidad inducida por fármacos en el sistema.

Muchos estudios han utilizado perfiles de expresión génica para predecir los posibles efectos negativos de las sustancias químicas. Sin embargo, la mayoría de los estudios anteriores se centraron en evaluar la toxicidad de un solo órgano diana, con síntomas patológicos limitados [9]. Además, combinado con el perfil genético basado en micromatrices, producirá una comprensión integral de la toxicidad a nivel del sistema que puede prevenir la toxicidad potencial relacionada con los medicamentos [10]. En este sentido, los enfoques toxicológicos integradores de múltiples órganos con perfiles de expresión génica se han utilizado en estudios de modelos de predicción de toxicidad para superar los datos de toxicidad derivados de la evaluación de toxicidad de un solo órgano, que es insuficiente para comprender los mecanismos tóxicos de los fármacos en el sistema [11].

En este estudio, describimos la toxicidad de la ifosfamida en elriñónyhígadodespués de exposición aguda y repetida en ratas Sprague-Dawley (SD). Se realizaron ensayos de perfiles de expresión génica de apoyo para revelar el gen diana común que fue alterado por la ifosfamida tanto en el hígado como en elriñón, lo que sugiere una idea de la toxicidad integradora de ifosfamida.

2. Resultados

2.1. Estudio de toxicidad de dosis única

No se observó toxicidad en los grupos de 12,5, 25 y 50 mg/kg de ifosfamida, ni muerte, síntomas tóxicos, cambios en el peso corporal ni hallazgos histopatológicos.

Por su parte, en el estudio de hematología, los recuentos relativos de reticulocitos (RET) y absolutos de neutrófilos (NEUA) y linfocitos (LYMA) disminuyeron de forma dosis-dependiente.

2.2. Estudio de toxicidad de dosis repetidas de una semana

El peso corporal total disminuyó después de 1 semana de administración de ifosfamida, y los valores medios de pérdida de peso corporal en el grupo de 100 mg/kg fueron más altos que los del grupo de 75 mg/kg (Tabla 1). Mientras tanto, el peso relativo de los órganos aumentó gradualmente en los grupos tratados con ifosfamida (Tabla 2).

Una semana de administración IP consecutiva de ifosfamida suprimió el índice hematológico, incluidos RBC, HGB, HCT, MCV y PLT, de manera dependiente de la dosis (Tabla 3). Además, BUN y CREA aumentaron 1,2 veces en el grupo de control en comparación con el grupo de ifosfamida (Tabla 4).Riñónlesiónfue apoyado además por un estudio histopatológico.

No se observaron signos histopatológicos en los hígados de ratones en los grupos de 75 y 100 mg/kg de ifosfamida (Figura 1A). Mientras tanto, elriñonesSe encontró que los grupos de ifosfamida de 75 y 100 mg/kg tenían un grado de alteración patológica de mínimo a leve, incluida la degeneración/dilatación tubular (1 moderada en el grupo de 100 mg/kg), necrosis unicelular, hiperplasia del urotelio y hemorragia focal /congestión (Cuadro 5). Además, se observó un aumento evidente en la expresión de KIM-1 en el área del túbulo renal en elriñóndel grupo de 100 mg/kg (Figura 1B).

2.3. Estudio de toxicidad de dosis repetidas de cuatro semanas

Se observó mortalidad en los grupos tratados con 50 (5/10) y 70 (10/10) mg/kg después de 21 y 10 días de administración consecutiva, respectivamente. Además, la disminución del peso corporal con el aumento del peso relativo de los órganos,hígado, yriñón, en todos los grupos tratados con ifosfamida, respalda la toxicidad por dosis repetidas durante 4-semanas.

Se realizaron análisis hematológicos y bioquímicos séricos en los sujetos supervivientes. Varios parámetros sanguíneos, incluidos RET, RBC, MONA, EOSA y LUCA, disminuyeron significativamente después de 4 semanas de administración de ifosfamida.

En comparación con el grupo de control, los análisis bioquímicos mostraron diferencias estadísticas después de 4 semanas de administración de ifosfamida. Por ejemplo, los niveles de AST y CK aumentaron significativamente, y la relación A/G, GLU y GGT disminuyeron (p < 0.01)="" en="" el="" grupo="" tratado="" con="" 50="" mg/kg,="" en="" comparación="" con="" el="" control.="">

2.4. Análisis de expresión génica inducida por ifosfamida

Los DEG inducidos por ifosfamida se identificaron en el hígado yriñóntejidos (Cuadro 6). Para el hígado, los genes expresados ​​diferencialmente incluían 2672 genes a 100 mg/kg BW/día, 1283 genes estaban regulados al alza y 1389 genes estaban regulados a la baja. En los riñones, 401 genes se expresaron diferencialmente a 100 mg/kg de peso corporal/día: 149 genes se regularon al alza y 252 genes se regularon a la baja. Tanto en el hígado como en el riñón, el número de genes regulados negativamente fue mayor que el número de genes regulados positivamente. Esto podría sugerir que el tratamiento con ifosfamida parece inhibir la expresión génica.

Los resultados del análisis de la función biológica se enumeran en la Tabla 7. Se descubrió que la administración de ifosfamida durante 1-semanas alteraba los genes relacionados con el desarrollo de los órganos, principalmente en el hígado. En elriñón, se confirmó que los genes relacionados con la localización de células inmunitarias fueron los más afectados.

En el análisis de la vía canónica de los DEG, los cambios en la síntesis de colesterol y los genes relacionados con la vía de presentación de antígenos fueron evidentes en elhígadoyriñóntejidos, respectivamente (Figura 2). Además, LXE / RXR y la señalización de respuesta de fase aguda fueron la vía canónica común regulada por la parte superior en elhígadoyriñón, que estaban implicados en la homeostasis de los lípidos y la señalización de citocinas inflamatorias, respectivamente.

En el análisis de la lista de toxicidad hepática, los genes relacionados con la síntesis de colesterol fueron los más afectados, seguidos por las proteínas de respuesta de fase aguda positiva y el panel de insuficiencia renal aguda (Tabla 8). Además, los resultados de la lista de riñones revelaron que los genes relacionados con la insuficiencia renal generalmente se vieron afectados por la ifosfamida, incluidos los biomarcadores de glomerulonefritis reversible y el panel de insuficiencia renal aguda.

Según la base de conocimientos de IPA, un regulador corriente arriba común regula la expresión génica en el hígado y el riñón después del tratamiento con ifosfamida (Figura 3). IRF7 fue el principal regulador que cambió tanto en el hígado como en el riñón y se descubrió que interactuaba con otros genes diana como USP18, RSAD2 e ISG15. Además, el análisis de RT-PCR en tiempo real confirmó la expresión de IRF7, USP18, RSAD2 e ISG15. Aunque la extensión de los cambios en cada gen fue diferente entre el hígado y el riñón, la expresión se suprimió en los tejidos del hígado y del riñón después de 1 semana de administración de ifosfamida. RSAD2 y USP18 tienen genes mayormente alterados por el tratamiento con ifosfamida en el hígado y el riñón, respectivamente.

3. Discusión

En este estudio, se exploró la toxicidad integral de ifosfamida en múltiples órganos con diferentes dosis y términos de exposición a través de la ruta IP en ratas bajo el estándar GLP. En clínica, la ifosfamida puede ejercer una acción antitumoral bimodal con efectos citotóxicos e inmunomoduladores combinados con inmunoterapia adoptiva [12]. Se sabe que la ifosfamida se elimina principalmente por vía renal y alrededor del 80 por ciento de la dosis se encuentra en forma inalterada, la nefrotoxicidad es un efecto secundario comúnmente conocido de la ifosfamida, y los metabolitos como el cloroacetaldehído y la acroleína son responsables de su uso clínico [13, 14].

En el presente estudio, un estudio de toxicidad repetido de 1-semanas fue adecuado para explorar la toxicidad orgánica derivada de la ifosfamida. Una semana de administración de ifosfamida suprimió el índice sanguíneo de manera dependiente de la dosis, lo que podría reflejar la típica mielosupresión derivada de la ifosfamida. Junto con la nefrotoxicidad, varios informes han indicado que la mielosupresión es una de las principales toxicidades limitantes de la dosis de ifosfamida, y la leucopenia es generalmente más grave que la trombocitopenia [15,16]. La nefrotoxicidad de la ifosfamida puede conducir al síndrome de Fanconi, en el que hay un deterioro de la función del túbulo proximal que provoca un daño irreversible, y el metabolito tóxico acroleína provoca urotoxicidad con cistitis hemorrágica [17]. Esto está de acuerdo con los resultados del presente estudio. En el estudio histopatológico se examinaron riñones e hígados para explorar alteraciones patológicas derivadas de la ifosfamida. En los grupos que recibieron 75 y 100 mg/kg de ifosfamida, se detectaron grandes áreas de degeneración tubular y dilatación con hiperplasia del urotelio en el área de la pelvis renal. Además, la expresión de KIM-1, una molécula de lesión del túbulo proximal renal, apoyó la presencia de nefrotoxicidad relacionada con la ifosfamida. Mientras tanto, solo se observó una vacuolización periportal mínima en el hígado. Además, aunque los valores de AST y ALT disminuyeron de manera dependiente de la dosis, los cambios estuvieron dentro del rango de referencia [18]. Las razones más profundas de la disminución de los niveles de enzimas hepáticas deberán estudiarse más a fondo. En general, se acepta que la ifosfamida es un agente alquilante que rara vez se asocia con hepatotoxicidad, y solo se han informado algunos casos que inducen daño hepático, especialmente cuando se combina con otros fármacos quimioterapéuticos como la doxorrubicina [19].

Recientemente, un progreso notable en los datos de expresión génica en toxicología con tecnologías de alto rendimiento ha llevado a la generación de conjuntos de datos suficientemente grandes en estudios de toxicidad, y se han realizado muchos intentos para aplicar el perfil génico a la predicción de toxicidad química [10,20]. En este estudio, se realizó un análisis de micromatrices para analizar la respuesta del transcriptoma inducida por la administración de ifosfamida, y se seleccionaron DEG con un cambio mayor o igual a 1,5 como el gen objetivo y se usaron la función biológica, la vía canónica y el análisis de la lista Tox. comprender la función de los genes inducidos por ifosfamida. Se realizó un análisis adicional del regulador corriente arriba para evaluar la posibilidad de toxicidad multiorgánica en el hígado y el riñón.

En este estudio, se seleccionaron DEG cambiados 1.5-veces, y los genes regulados a la baja fueron ligeramente más dominantes que los genes regulados al alza tanto en el hígado (52 por ciento) como en el riñón (62 por ciento). Los resultados del análisis de la función biológica indicaron que la ifosfamida cambia los genes, con funciones biológicas relacionadas con el desarrollo de tejidos que se observan comúnmente tanto en el hígado como en el riñón.

Un estudio previo de Snouber et al. [21] informaron que se descubrió que el tratamiento con ifosfamida regula a la baja las vías de respuesta oxidativa al estrés mediadas por Nrf-2 en el cultivo de microfluidos [21]. De acuerdo con los estudios anteriores, la ruta de respuesta al estrés oxidativo mediada por NRF2-fue modulada significativamente por las principales redes, lo que fue confirmado tanto por la presente ruta canónica como por el análisis de la lista de toxinas. Las presentes vías alteradas de respuesta oxidativa al estrés mediadas por Nrf-2 podrían estar estrechamente relacionadas con el metabolito tóxico de la ifosfamida. Múltiples metabolitos tóxicos de ifosfamida pueden reaccionar con GSH, un potente antioxidante, para formar conjugados en diferentes sitios a lo largo de la vía, y una disminución en el nivel de GSH da como resultado una mayor toxicidad, lo que indica la implicación del estrés oxidativo en la toxicidad orgánica de ifosfamida [8,22]. ]. En este sentido, se utilizaron mesna y N-acetilcisteína para aliviar la toxicidad orgánica de la ifosfamida. Mesna sirve como un desintoxicante regional al unirse al metabolito tóxico de la ifosfamida, principalmente contra la acroleína, a través de una adición de Michael para formar una sustancia menos dañina [23]. Además, se informa que la N-acetilcisteína tiene actividad antioxidante y mejora el agotamiento de GSH en condiciones de estrés oxidativo [24]. Se necesitan más estudios para dilucidar la relación exacta entre el antídoto de ifosfamida y la vía regulada en condiciones nefrotóxicas. Podemos especular que la mejora de la toxicidad de ifosfamida por mesna o N-acetilcisteína podría ser seguida por mejores vías de respuesta oxidativa al estrés mediadas por Nrf-2-.

En este estudio, las señales relacionadas con la inflamación se regularon al alza tanto en el hígado como en el riñón, lo que puede reconocerse mediante la señalización de fase aguda en el análisis de vías canónicas. Este resultado indicó la implicación de la reacción inflamatoria en la fisiopatología de la toxicidad orgánica de la ifosfamida en ambos tejidos, lo que fue respaldado por el análisis del regulador aguas arriba. En el análisis del regulador aguas arriba, los genes relacionados con la señal de IRF7 e interferón (IFN), incluidos USP18, RSAD2 e ISG15, se seleccionaron como reguladores aguas arriba comunes en el hígado y el riñón. IRF7 es un factor específico de los linfoides, que se expresa constitutivamente en el citoplasma de las células inmunitarias y también puede ser inducido por interferón tipo I, infección por virus y estímulos externos en varias células [25]. Un estudio anterior informó sobre las controvertidas propiedades pro o antioncogénicas de IRF7 en diversas células tumorales, y los cambios en la expresión de IRF7 se asociaron con daños en el ADN [26–28].

Además de su importante papel regulador en el IFN tipo I para funciones antivirales, se informó que IRF7 suprime las respuestas inflamatorias a través de la vía de señalización TLR4 [29]. Además, Stout-Delgado et al. [30] informaron que el incremento oxidativo inducido por el envejecimiento afecta la actividad de IRF7, mientras que la reducción del estrés por agentes antioxidantes mejoró la actividad de IRF7. En este estudio, la administración de ifosfamida suprimió la expresión de los reguladores aguas arriba y los patrones de expresión fueron idénticos tanto en el hígado como en el riñón. Los cambios actuales en la expresión de IRF7 podrían estar relacionados con la reacción inflamatoria y la propiedad de agente alquilante citotóxico de la ifosfamida, lo que podría sugerir que IRF7 es un objetivo prometedor para la toxicidad orgánica de la ifosfamida.

En este estudio, encontramos un gen que se inhibió de manera idéntica tanto en el hígado como en el riñón después de la administración de ifosfamida, pero la interpretación de su importancia toxicológica se centró solo en el riñón, lo que limita el descubrimiento actual. Además, otros estudios de confirmación relacionados con el efecto del antídoto de ifosfamida comercialmente disponible en el gen actualmente alterado podrían respaldar los presentes hallazgos.

En conclusión, se encontró que un estudio de toxicidad repetido (1 semana) de la administración de ifosfamida tenía una nefrotoxicidad sesgada en lugar de una hepatotoxicidad. Además, los presentes resultados proporcionan evidencia del mecanismo de hepatotoxicidad y nefrotoxicidad inducido por ifosfamida que implica la inhibición de IRF-7. Se requieren más estudios toxicogenómicos de los órganos relacionados con el sistema inmunitario para dilucidar el mecanismo toxicológico sistémico de la ifosfamida y para respaldar la relación entre la toxicidad del gen y del órgano.

4. Materiales y Métodos

4.1. Estudio de animales

Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley (SD) libres de patógenos específicos masculinos de ocho semanas de edad (n=140) de Orient Bio Inc. (Seongnam, Corea). Los animales fueron examinados y aclimatados a las condiciones ambientales del laboratorio durante una semana antes del experimento. Todos los animales se alojaron en jaulas de plástico bajo condiciones de laboratorio controladas (temperatura, 23 ± 3 ◦C; humedad, 55 ± 10 por ciento; y ciclo de luz/oscuridad de 12/12-h) con comida de laboratorio y agua ad libitum. El estudio en animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Toxicología de Corea (Daejeon, Corea), y todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las Directrices de prueba para la evaluación de la seguridad de los medicamentos de la Administración de Alimentos y Medicamentos de Corea. El estudio en animales se dividió en tres secciones: estudio de toxicidad de administración consecutiva de dosis única (aguda) y dosis repetidas (1 semana y 4 semanas). Se asignaron al azar cuarenta ratas a cuatro grupos (control, t1, t2 y t3) utilizando el sistema Path/Tox (versión 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, EE. UU.) en cada estudio de toxicidad.

4.2. Experimento de toxicidad

El estudio de toxicidad se dividió en tres secciones: estudios de toxicidad de dosis única (aguda) y dos dosis repetidas (dosis consecutivas de 1 semana o 4 semanas). Para cada estudio de toxicidad, las ratas se asignaron al azar a grupos adecuados (control, dosis 1, dosis 2 y dosis 3 para estudios de toxicidad de una sola semana y de 4-semanas; control, dosis 1 y dosis 2 para 1- semana de estudio de toxicidad) utilizando el sistema Path/Tox (versión 4.2.2, Xybion Medical Systems Corporation, Lawrenceville, NJ, EE. UU.). En el estudio de toxicidad, la ifosfamida se administró por vía intraperitoneal (IP), y el grupo control recibió agua destilada (DW). La dosis de ifosfamida utilizada en el estudio de toxicidad fue la siguiente: estudio de toxicidad aguda (12,5, 25 y 50 mg/kg), estudio de toxicidad 1-semana (75 y 100 mg/kg PC/día) y {{19 }}estudio de toxicidad semanal (25, 50 y 70 mg/kg PC/día). Los síntomas clínicos generales, el peso corporal y la mortalidad de los animales se registraron diariamente durante la administración, y todos los animales se sacrificaron 24 h después de la última administración de ifosfamida. Se recogieron muestras de sangre y se colocaron en tubos de microcentrífuga y tubos EDTA-K2 para bioquímica sérica y análisis hematológico, respectivamente. Los tejidos de hígado y riñón se fijaron en formaldehído y se sometieron a análisis histopatológico. Se realizaron inmunohistoquímica, análisis de micromatrices y RT-PCR en tiempo real adicionales en los tejidos hepáticos y renales del estudio de toxicidad subaguda (100 mg/kg de peso corporal/día).

4.3. Análisis hematológicos y bioquímicos séricos

Las pruebas hematológicas estándar se realizaron utilizando un sistema de hematología ADVIA 120 (Bayer, Fernwald, Alemania). Se utilizaron los siguientes indicadores: recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de glóbulos rojos (RBC), hematocrito (HCT), concentración de hemoglobina, volumen corpuscular medio (MCV), hemoglobina corpuscular media (MCH), recuento de plaquetas (PLT), recuento de linfocitos (LYM), monocitos (MON), neutrófilos (NEU), basófilos (BAS), eosinófilos (EOS), células grandes no teñidas (LUC) y reticulocitos (RET).

El ensayo bioquímico se llevó a cabo utilizando un analizador automático (TBA 120FRNEO; Toshiba Corp., Tokio, Japón) con suero centrifugado. Los principales indicadores bioquímicos fueron alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST), fosfatasa alcalina (ALP), nitrógeno urinario en sangre (BUN), creatinina (CREA), glucosa (GLU), colesterol total (TCHO), relación albúmina/globulina (A/G), triglicéridos (TG), bilirrubina total (TB), gamma-glutamil transferasa (GGT), fosfolípidos (PL), calcio, cloruro, sodio inorgánico, fósforo y potasio.

4.4. Examen histopatológico e inmunohistoquímico

Los tejidos embebidos en parafina se seccionaron con un grosor de 5- µm, se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se examinaron microscópicamente.

El tejido renal se sometió a inmunohistoquímica. Las secciones desparafinadas y lavadas se preincubaron con suero de cabra al 10 por ciento para bloquear la tinción no específica. Luego, los portaobjetos se incubaron durante la noche con el anticuerpo anti-KIM1 primario (1:750; Santa Cruz, CA, EE. UU.). Después de eliminar los anticuerpos primarios, las secciones se procesaron con el kit VECTASTAIN Elite ABC HRP (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido) y se examinó la expresión de KIM1 bajo un microscopio óptico.

4.5. Análisis de micromatrices y análisis de interacción proteína-proteína (PPI)

El hígado y el riñón del grupo de 1-semanas (100 mg/kg) se homogeneizaron y el ARN total se extrajo con un mini kit de RNasa (Qiagen). La síntesis de ADNc se logró utilizando un kit de síntesis de ADNc (Affymetrix, Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.) y se sometió a análisis de micromatrices y PPI.

El análisis de micromatrices se realizó con Affymetrix GeneChip Rat {{0}}.0 con GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix Santa Clara, CA, EE. UU.), y el los resultados se procesaron con el software de análisis GeneSpring GX v13.0 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los genes expresados ​​diferencialmente (DEG), que cambiaron más de 15- veces después de la administración de ifosfamida, se seleccionaron mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey. Las funciones biológicas y las vías canónicas de los DEG seleccionados se analizaron utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA, ver. 9.0; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EE. UU.), y se realizó un análisis de reguladores aguas arriba para identificar los reguladores aguas arriba que podrían ser responsable de los DEG derivados de la toxicidad de la ifosfamida. Se realizó un análisis adicional de la red de interacción proteína-proteína (PPI) de los DEG utilizando el software STRING (versión 10), y la interacción se confirmó cuando la puntuación de confianza media fue superior a 0,4. La interacción de proteínas es la probabilidad aproximada de que exista un vínculo predicho entre dos proteínas en la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto.

4.6. Estudio cuantitativo de RT-PCR en tiempo real

La expresión de genes reguladores comunes en el estudio de micromatrices se confirmó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores específicos de genes se obtuvieron de Bioneer (Daejeon, Corea). Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: factor regulador de interferón 7 (IRF7): directo, 5-TGCTTGTCTAGCACCAATAG-3 e inverso, 5-CACAAGGTCCACTAGAGATG-3; peptidasa 18 específica de ubiquitina (USP18): directa, 5-CTGTAGTTTGTCTCCCAACA-3 y inversa 5-GAACTGATTACCTCCCACTG-3; dominio radical S-adenosil metionina que contiene 2 (RSAD2): directo, 5-ACCAATCATCAGAGGTTGAC-3 e inverso, 5-CTGCATGATTGTTCTTGGAC-3; gen 15 estimulado por interferón (ISG15): directo, 5-AAGTCTCCCAAGACCAATTC-3y reverso, 5-CTACATTGGCTCTGGATAGG-30.

El ARN total se transcribió inversamente a ADNc usando SuperScript II (Invitrogen, Carls bad, CA, EE. UU.) y cebadores oligo-dT, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con la regulación aguas arriba se analizaron utilizando el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE. UU.) con una mezcla maestra SYBR Green (Applied Biosystems), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El cebador de ARN ribosómico 18S se usó como control interno y los resultados se expresaron como cambio de veces en relación con el grupo de control normal.

4.7. Análisis estadístico

Los datos se analizaron estadísticamente utilizando métodos de comparación múltiple. Cuando la prueba de Bartlett no mostró desviaciones significativas de la homogeneidad de la varianza, se utilizó el análisis de la varianza (ANOVA) para determinar si alguna de las medias de los grupos difería en el nivel de significancia de p < {{0}}.05.="" además,="" se="" usó="" la="" prueba="" de="" dunnett="" para="" determinar="" las="" diferencias="" en="" los="" datos="" entre="" los="" grupos="" de="" control="" y="" tratamiento="" cuando="" se="" encontró="" que="" los="" datos="" eran="" significativos="" a="" partir="" de="" la="" prueba="" anova.="" además,="" cuando="" se="" observaron="" desviaciones="" significativas="" de="" la="" homogeneidad="" de="" la="" varianza="" de="" la="" prueba="" de="" bartlett,="" se="" realizó="" una="" prueba="" de="" comparación="" no="" paramétrica,="" la="" prueba="" de="" kruskal-wallis="" (h),="" para="" determinar="" si="" alguna="" de="" las="" medias="" de="" los="" grupos="" difería="" en="" p="">< 0,05.="" cuando="" se="" observó="" una="" diferencia="" significativa="" en="" la="" prueba="" de="" kruskal-wallis="" (h),="" se="" realizó="" la="" subprueba="" de="" clasificación="" de="" dunn="" para="" cuantificar="" los="" pares="" específicos="" de="" datos="" de="" grupo="" que="" eran="" significativamente="" diferentes="" de="" la="" media.="" se="" realizó="" la="" prueba="" exacta="" de="" fisher="" para="" comparar="" pares="" de="" datos="" (incluyendo="" prevalencia="" y="" porcentaje).="" el="" nivel="" de="" probabilidad="" se="" fijó="" en="" 1="" o="" 5="" por="" ciento.="" los="" análisis="" estadísticos="" se="" realizaron="" comparando="" los="" datos="" de="" los="" diferentes="" grupos="" de="" tratamiento="" con="" los="" del="" grupo="" de="" control="" utilizando="" path/tox="" (versión="" 4.2.2,="" xybion="" medical="" systems="" corporation,="" lawrenceville,="" nj,="" ee.="">

Declaración de disponibilidad de datos:

Los datos están contenidos en el artículo o en los Materiales complementarios.

Conflictos de interés:

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Referencias

1. Palmerini, E.; Setola, E.; Grignani, G.; D'Ambrosio, L.; Comandone, A.; Righi, A.; Longhi, A.; Cesari, M.; Paioli, A.; Hakim, R.; et al. Ifosfamida en dosis altas en pacientes con osteosarcoma de alto grado recidivante e irresecable: una serie retrospectiva. Celdas 2020, 9, 2389. [Referencia cruzada]
2. Klastersky, J. Efectos secundarios de la ifosfamida. Oncología 2003, 65, 7–10. [Referencia cruzada]
3. Sprangers, B.; Lapman, S. Los dolores de crecimiento de la ifosfamida. clin. Riñón J. 2020, 13, 500–503. [Referencia cruzada]
4. Elías, AD; Ayash, LJ; Wheeler, C.; Schwartz, G.; Tepler, I.; McCauley, M.; Mazanet, R.; Schnipper, L.; Frei, E., 3º; Antman, KH Ifosfamida/carboplatino/etopósido en dosis altas con apoyo de células madre hematopoyéticas autólogas: seguridad y direcciones futuras. Semin. oncol. 1994, 21, 83–85. [PubMed]
5. Mollenkopf, A.; Du Bois, A.; Meerpohl, HG Curso secuencial y manejo prospectivo de la toxicidad multiorgánica inducida por ifosfamida. Geburtshilfe Frauenheilkd. 1996, 56, 525–528. [Referencia cruzada]
6. Aleksa, K.; Matsell, D.; Krausz, K.; Gelboin, H.; Ito, S.; Koren, G. Citocromo P450 3A y 2B6 en el riñón en desarrollo: Implicaciones para la nefrotoxicidad de ifosfamida. pediatra nefrol. 2005, 20, 872–885. [Referencia cruzada] [PubMed]
7. Lowenberg, D.; espina, CF; Desta, Z.; Flockhart, DA; Altman, RB; Klein, TE PharmGKB resumen: Vías de ifosfamida, farmacocinética y farmacodinámica. Farmacogenético. genoma 2014, 24, 133. [Referencia cruzada] [PubMed]
8. Mac Allister, SL; Martín-Brisac, N.; Lau, V.; Yang, K.; O'Brien, PJ Acroleína y cloroacetaldehído: Un examen de los biomarcadores de toxicidad celulares y libres de células. química Biol. Obrar recíprocamente. 2013, 202, 259–266. [Referencia cruzada]
9. Kim, J.; Shin, M. Un modelo integrador de predicción de toxicidad inducida por fármacos en múltiples órganos utilizando datos de expresión génica. BMC Bioinforme. 2014, 15, S2. [Referencia cruzada]
10. Alexander-Dann, B.; Pruteanu, LL; Oerton, E.; Sharma, N.; Berindan-Neagoe, I.; Modos, D.; Bender, A. Desarrollos en toxicogenómica: comprensión y predicción de la toxicidad inducida por compuestos a partir de datos de expresión génica. mol. Omics 2018, 14, 218–236. [Referencia cruzada]
11. An, YR; Kim, JY; Kim, YS Construcción de un modelo predictivo para evaluar la toxicidad en múltiples órganos. mol. Toxicol Celular. 2016, 12, 1–6. [Referencia cruzada]
12. Binotto, G.; Trentín, L.; Semenzato, G. Ifosfamida y ciclofosfamida: Efectos sobre la inmunovigilancia. Oncología 2003, 65, 17–20. [Referencia cruzada]
13. Schwerdt, G.; Gordjani, N.; Benesic, A.; Freudinger, R.; Wollny, B.; Kirchhoff, A.; Gekle, M. Muerte inducida por cloroacetaldehído y acroleína de células del túbulo proximal humano. pediatra nefrol. 2006, 21, 60–67. [Referencia cruzada]
14. Ensergueix, G.; Paleta, N.; Joly, D.; Levi, C.; Chauvet, S.; Trivin, C.; Augusto, JF; Boudet, R.; Aboudagga, H.; Touchard, G.; et al. Nefrotoxicidad de ifosfamida en pacientes adultos. clin. Riñón J. 2020, 13, 660–665. [Referencia cruzada]
15. Decantar, KL; Brogden, RN; Pilkington, T.; Faulds, D. Ifosfamida/mesna. Una revisión de su actividad antineoplásica, propiedades farmacocinéticas y eficacia terapéutica en el cáncer. Drogas 1991, 42, 428–467. [Referencia cruzada]
16. Pronk, LC; Schrijvers, D.; Schellens, JHM; De Bruijn, EA; Plantación, A.; Locci-Tonelli, D.; Groult, V.; Verweij, J.; Van Oosterom, AT Estudio de fase I sobre docetaxel e ifosfamida en pacientes con tumores sólidos avanzados. Hermano J. Cáncer. 1998, 77, 153–158. [Referencia cruzada] [PubMed]
17. Skinner, R. Nefrotoxicidad crónica de ifosfamida en niños. Medicina. Pediatría Oncol. 2003, 41, 190–197. [Referencia cruzada]
18. Sharp, P.; Vilano, JS La rata de laboratorio; CRC Press: Boca Ratón, FL, EE. UU., 2012.
19. Cheung, MC; Jones, RL; Judson, I. Toxicidad hepática aguda con ifosfamida en el tratamiento del sarcoma: informe de un caso. J.Med. Caso Rep. 2011, 5, 180. [Referencia cruzada]
20. Cui, Y.; Paules, RS Uso de la transcriptómica en la comprensión de los mecanismos de toxicidad inducida por fármacos. Farmacogenómica 2010, 11, 573–585. [Referencia cruzada]
21. Snouber, LC; Jacques, S.; Monge, M.; Legallais, C.; Leclerc, E. Análisis transcriptómico del efecto de la ifosfamida en células MDCK cultivadas en biochips de microfluidos. Genómica 2012, 100, 27–34. [Referencia cruzada] [PubMed]
22. Dirven, HA; Megens, L.; Oudshoorn, MJ; Dingemanse, MA; van Ommen, B.; Van Bladeren, PJ Conjugación de glutatión del fármaco citostático ifosfamida y el papel de las glutatión S-transferasas humanas. química Res. Toxicol. 1995, 8, 979–986. [Referencia cruzada]
23. Jeelani, R.; Jahanbakhsh, S.; Kohan-Ghadr, HR; Thakur, M.; Kan, S.; Aldhaheri, SR; Yang, Z.; Andreana, P.; Morris, R.; Abu-Soud, HM Mesna (2-sulfonato sódico de mercaptoetano) funciona como regulador de la mieloperoxidasa. Radico libre. Biol. Medicina. 2017, 110, 54–62. [Referencia cruzada]

24. Alnahdi, A.; Juan, A.; Raza, H. N-acetil cisteína atenúa el estrés oxidativo y el desequilibrio redox dependiente del glutatión causado por el tratamiento con alto contenido de glucosa/ácido palmítico en células Rin-5F pancreáticas. PLoS ONE 2019, 14, e0226696. [Referencia cruzada]

25. Zhang, L.; Pagano, JS IRF-7, un nuevo factor regulador de interferón asociado con la latencia del virus Epstein-Barr. mol. Biol celular. 1997, 17, 5748–5757. [Referencia cruzada]
26. Pagano, JS Virus y linfomas. N. ingl. J.Med. 2002, 347, 78–79. [Referencia cruzada]
27. Romieu-Mourez, R.; Solís, M.; Nardin, A.; Goubau, D.; Baron-Bodo, V.; Lin, R.; Massie, B.; Salcedo, M.; Hiscott, J. Papeles distintos para el factor regulador de IFN (IRF)-3 y el IRF-7 en la activación de las propiedades antitumorales de los macrófagos humanos. Cáncer Res. 2006, 66, 10576–10585. [Referencia cruzada]
28. Ning, S.; Pagano, JS; Barber, GN IRF7: Activación, regulación, modificación y función. Genes Immun. 2011, 12, 399–414. [Referencia cruzada]
29. Chen, PG; Guan, YJ; Zha, GM; Jiao, XQ; Zhu, SA; Zhang, CY; Wang, YY; Li, HP Swine IRF3/IRF7 atenúa las respuestas inflamatorias a través de una vía de señalización TLR4. Oncotarget 2017, 8, 61958. [Referencia cruzada]
30. Stout-Delgado, HW; Yang, X.; Caminante, NOSOTROS; Tesar, BM; Goldstein, DR El envejecimiento afecta la regulación positiva del factor 7 regulador de IFN en las células dendríticas plasmocitoides durante la activación de TLR9. J. Immunol. Res. 2008, 181, 6747–6756. [Referencia cruzada]