Ishophloroglucin A aislado de Ishige Okamurae suprime la melanogénesis inducida por -MSH: in vitro e in vivo, parte 1

Abstracto:El difloretohidroxicarmalol (DPHC) aislado de Ishige Okamura (IO) mostró efectos blanqueadores potenciales frente a la radiación UV-B. Sin embargo, los componentes de IO y su mecanismo molecular contra la hormona estimulante de melanocitos (-MSH) aún no se han investigado. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar los efectos inhibidores de la isofloroglucina A (IPA), un florotanino aislado de algas pardas IO, y su extracto crudo (IOE), en la melanogénesis in vivo en un modelo de pez cebra inducido por -MSH y en células de melanoma B16F10. in vitro. Se llevaron a cabo estudios de acoplamiento molecular de los florotaninos para determinar sus efectos inhibitorios y dilucidar su modo de interacción con la tirosinasa, una glicoproteína relacionada con la melanogénesis. Además, los cambios morfológicos y el contenido de melanina disminuyeron en el modelo de pez cebra inducido por -MSH después del tratamiento con IPA e IOE. Además, la transferencia de Western reveló que IPA regulaba al alza la expresión de proteínas extracelulares en células B16F10 estimuladas con -MSH. Por lo tanto, estos resultados sugieren que el IPA aislado de IOE tiene potencial para su uso en las industrias farmacéutica y cosmética.

Según estudios relevantes,cistanchees una hierba común conocida como "la hierba milagrosa que prolonga la vida". Su principal componente escistanósido, que tiene varios efectos tales comoantioxidante, antiinflamatorio y promoción de la función inmunológica. El mecanismo entre la cistanche y el blanqueamiento de la piel radica en el efecto antioxidante de los glucósidos de cistanche.Melaninaen la piel humana se produce por la oxidación de tirosina catalizada por tirosinasa. La reacción de oxidación requiere la participación de oxígeno, por lo que los radicales libres de oxígeno en el cuerpo se convierten en un factor importante que afecta la producción de melanina. Cistanche contiene cistanosido, que es un antioxidante y puede reducir la generación de radicales libres en el cuerpo, por lo tantoinhibiendo la producción de melanina.

1. Introducción

Las algas marinas han ganado una gran atención de las industrias de alimentos funcionales, cosmética y farmacéutica, ya que utilizan compuestos bioactivos como florotaninos, fucoidanos, polisacáridos y proteínas [1–7]. De acuerdo con un estudio anterior, Ishige Okamurae (IO) fue examinado por sus efectos inhibidores sobre la actividad de la tirosinasa [8]. Aunque su florotanino, difloretohidroxicarmalol (DPHC), se evaluó para la actividad anti-melanogénesis inducida por radiación UV-B en un modelo in vitro [8], no se realizaron más estudios para explicar la interacción entre DPHC y proteínas relacionadas con la melanogénesis. En este estudio, se evaluó la interacción con la tirosinasa de un nuevo compuesto polifenólico, la isofloroglucina A (IPA) [9], en un estudio de acoplamiento molecular, en comparación con el de DPHC.

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El acoplamiento molecular es un método computacional eficiente para predecir el modo de unión potencial de moléculas pequeñas o ligandos dentro del sitio activo de una proteína o receptor de una estructura tridimensional conocida para estudiar sus patrones de interacción o para el diseño de fármacos [10-12]. Estudios previos han informado sobre el sitio de interacción de la enzima tirosinasa y el valor energético investigado por estudios de acoplamiento molecular [13,14]. Funcionalmente, la tirosinasa es una enzima limitante de la velocidad que cataliza una velocidad de reacción relativamente lenta en la vía de señalización y desempeña un papel fundamental en la biosíntesis de melanina en orgánulos especializados llamados melanosomas, sintetizados específicamente por células melanocíticas [15]. Por lo tanto, la actividad enzimática de la tirosinasa modelada a través de simulaciones de acoplamiento molecular in silico ha sido el objetivo de la investigación de inhibidores para prevenir trastornos cutáneos hiperpigmentados. En base a esto, en campos experimentales y computacionales, muchos compuestos fenólicos o inhibidores que poseen capacidad quelante de metales han sido ampliamente estudiados como inhibidores de la tirosinasa [16].

La melanina modula principalmente el color de la piel y actúa como un pigmento protector cuando la piel se expone a la radiación UV [17]. La exposición a la radiación UV provoca la liberación de la hormona estimulante de los melanocitos (-MSH) de los queratinocitos y melanocitos cutáneos para inducir la síntesis de melanina y, posteriormente, proteger la piel de los efectos dañinos de la radiación solar [18]. Sin embargo, la exposición a largo plazo a la radiación UV induce una síntesis significativa de melanina por -MSH, lo que resulta en daños en la piel como pecas, manchas solares y puntos negros en la epidermis, lo que lleva a daño por foto del ADN y cáncer de piel [19]. Después de esto, se ha estudiado ampliamente la administración de -MSH en los melanocitos para inducir cambios considerables en la actividad de la tirosinasa para la melanogénesis en el melanoma [20].

El pez cebra muestra variaciones en el color de la piel como los humanos. Son un modelo animal utilizado para comprender el origen genético del color de la piel humana, conectando la biología básica del organismo modelo con la genética humana [21]. Además, los pigmentos en las regiones ventral y lateral de la gástrula del pez cebra y su transparencia durante las etapas larvarias permiten una observación simple del proceso de pigmentación, lo que brinda la oportunidad de desarrollar modelos viables para comprender los trastornos de las células de la piel que resultan de defectos en el desarrollo de los melanocitos [22– 24].

La síntesis de melanina se produce a través de la actividad de varias proteínas relacionadas con la melanogénesis, como la tirosinasa, el factor de transcripción asociado a la microftalmía (MITF), la proteína relacionada con la tirosinasa-1 (Trp-2) y la proteína relacionada con la tirosinasa{ {6}} (Trp-1) [15]. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar el efecto inhibitorio del IPA y el extracto crudo IO (IOE) en la actividad de la tirosinasa y la melanogénesis en el pez cebra inducido por -MSH in vivo y en las células de melanoma B16F10 in vitro para evaluar su uso potencial en el tratamiento de la pigmentación de la piel y el melanoma. .

2. Resultados

2.1. Estudio de acoplamiento molecular

Se llevó a cabo un método de acoplamiento para simular la unión de la enzima tirosinasa comercial con IPA, DPHC y arbutina [25]. Los modos de unión de IPA, DPHC o arbutina con tirosinasa de hongo se presentan en la Figura 1A-C. Como se muestra en el diagrama 3D del complejo tirosinasa-IPA (Figura 1A), tirosinasa-DPHC (Figura 1B) y tirosinasa-arbutina (Figura 1C), aunque IPA, DPHC y arbutina se acoplaron al sitio activo, la tirosinasa- El complejo IPA mostró el área de superficie de unión más grande. Además, como se muestra en un diagrama 2D, el complejo tirosinasa-IPA mostró más interacciones con los diversos aminoácidos de la tirosinasa, en comparación con la tirosinasa-DPHC o la tirosinasa-arbutina. Siete anillos de benceno (1.°, 2.°, 3.°, 8.°, 9.°, 12.° y 16.°) y sus átomos de oxígeno tienen interacciones π–π con histidina60, metionina61, lisina157, glutamato158, prolina160, prolina201, arginina206 y valina218 . En particular, el 16º anillo de benceno se combinó con Histidine60 e Histidine204, los principales aminoácidos del sitio activo. Además, muchos átomos de oxígeno en IPA interactuaron a través de enlaces de hidrógeno con glutamato 158, prolina 160, aspartato 167, metionina 184, fenilalanina 197, asparagina 199, glutamina 202, asparagina 205 y arginina 209. Además, en base a los resultados del análisis de acoplamiento, se calculó que la energía de unión total y la energía de interacción CDOCKER usando el programa de energía de interacción CDOCKER de DS 3.0 (Figura 1D) fueron las siguientes: energía de interacción con tirosinasa: isofloroglucina A (IPA): − 152,154 kcal/mol, difloretohidroxicarmalol (DPHC): −65,5221 kcal/mol y arbutina: −33,6835 kcal/mol y la energía de enlace con tirosinasa: Ishoploroglucina A (IPA): −546,504 kcal/mol, difloretohidroxicarmalol (DPHC): −407,706 kcal /mol y arbutina: −79,0913 kcal/mol.

2.2. Efectos de los inhibidores melanogénicos sobre la síntesis de melanina en larvas de pez cebra

El propósito de este estudio fue determinar si IPA e IOE pueden inhibir la melanogénesis en larvas de pez cebra in vivo. En nuestro estudio anterior, IPA e IOE no mostraron toxicidad en larvas de pez cebra [26]. Tratamos larvas de pez cebra con pez cebra (0.05, 0.15 y 0.5 nM) e IOE (3, 10 y 30 µg/mL ) para determinar su contenido en melanina. Para estimar las actividades inhibitorias, medimos el contenido total de melanina de los extractos de pez cebra. El efecto fenotípico sobre la melanina del pez cebra se observó analizando la pigmentación de su cuerpo bajo un microscopio a temperatura ambiente. La melanina superficial se redujo significativamente por varias concentraciones de los inhibidores objetivo (Figura 2). El tratamiento con 3 nM -MSH aumentó significativamente el contenido de melanina del pez cebra en comparación con el grupo no tratado. Las concentraciones más altas de IPA (0,5 nM) e IOE (30 µg/ml) redujeron el contenido total de melanina en casi un 28,56 % y un 30,36 %, respectivamente, que presentaron efectos similares a los del grupo tratado con arbutina (200 µM) (Figura 2A, B).

2.3. Efectos de IPA e IOE sobre la síntesis de melanina en células B16F10

Los efectos citotóxicos de IPA e IOE en células B16F10 se midieron mediante el MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ ensayo de bromuro de 7}}difeniltetrazolio). Inicialmente examinamos los efectos citotóxicos de IPA e IOE en células B16F10 tratadas con diferentes concentraciones sin estimulación de -MSH. IPA (0,15, 0,5, 1,5 y 5 nM) no reveló ninguna citotoxicidad significativa en las células B16F10, mientras que IOE (1, 3, 10 y 30 µg/mL) no mostró citotoxicidad (Figura 3A, B). Las concentraciones de IPA y IOE sin toxicidad se usaron para estudios adicionales.

Examinamos si el efecto de la inhibición de melanina del tratamiento con IPA o IOE in vivo era reversible sin estimulación de -MSH en células B16F10. El contenido de melanina disminuyó significativamente con el tratamiento con IPA (5 nM) o IOE (30 µg/mL) en comparación con el grupo de control (Figura 3C, D). Estos resultados sugirieron que IPA e IOE inhibieron la síntesis de melanina sin estimulación de -MSH en células B16F10, contribuyendo así a su efecto anti-melanogénesis.

2.4. Efectos de IPA e IOE sobre la actividad de tirosinasa y la síntesis de melanina en células B16F10 estimuladas por -MSH

Por lo tanto, se incubaron dosis de IPA (0.5, 1.5 y 5 nM) e IOE (3, 10 y 30 µg/mL) con células de melanoma B16F10 para determinar su bioactividad en la actividad de tirosinasa celular y -MSH -Melanogénesis mediada.

Las concentraciones de -MSH y arbutina se determinaron en función de los resultados de su citotoxicidad y producción de melanina en células B16F10 (Figura S2A-D). Al analizar los datos sobre la tasa de supervivencia, se usaron 1 nM de -MSH y 100 µM de arbutina para experimentos adicionales.

En cuanto a la actividad de tirosinasa celular, aunque los efectos inhibitorios de 1,5 nM de IPA fueron relativamente más bajos que los representados en el control positivo, la concentración difirió casi 10 veces, con la mayor concentración de arbutina a 100 µM (Figura 4A). IOE redujo la actividad de tirosinasa con una ligera fluctuación entre los efectos de diferentes concentraciones en comparación con el grupo tratado con -MSH (Figura 4B). En cuanto a la melanogénesis mediada por -MSH, se observaron reducciones significativas en el contenido de melanina en los grupos tratados con IPA 1,5 y 5 nM (Figura 4C). Además, 30 µg/mL de IOE inhibieron la pigmentación hasta el punto de parecerse al grupo en blanco (Figura 4D). Estos resultados sugieren que IPA e IOE regularon a la baja la actividad de tirosinasa y que este efecto inhibidor puede conducir a una disminución de la síntesis de melanina celular en las células B16F10.

2.5. Efectos de IPA e IOE sobre el mecanismo molecular en células B16F10 estimuladas por -MSH

Para dilucidar el mecanismo responsable de su efecto inhibidor de la melanogénesis, determinamos la influencia de IPA e IOE en los niveles de expresión de las moléculas de señalización involucradas en la síntesis de melanina (Figura 5). ERK (quinasa regulada por señal extracelular), JNK (quinasa Jun N-terminal) y p38 pertenecen a la cascada de transducción de señal intracelular de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) [27,28]. Como se presenta en la Figura 5A, B, la fosforilación de ERK mejoró con el tratamiento con IPA, mientras que la fosforilación de JNK disminuyó ligeramente después del tratamiento con IPA (1,5 y 5 nM) o IOE (30 µg/mL). Además, como se presenta en la Figura 5C, los niveles de p-p38 aumentaron mucho en los grupos estimulados con -MSH, en alrededor del 80 por ciento en comparación con el control. Además, después del tratamiento con IPA, IOE o arbutina, se suprimió ligeramente la fosforilación de p38. Estos hallazgos sugieren que los efectos inhibidores melanogénicos de IPA e IOE pueden estar relacionados con las vías de señalización de JNK y p38 MAPK.

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