El inhibidor de JAK bloquea la señalización JAK-STAT-APOL1 inducida por citocinas de COVID-19-en células glomerulares y podocitopatía en organoides renales humanos Ⅱ

Nuestros resultados cambian el paradigma actual de la terapia inducida por interferón.APOL1-nefropatía. Varios ejemplos enqué estados elevados de interferón causaron glomerulopatía colapsante en portadores de alto riesgoAPOL1genotipocondujo a un paradigma que privilegiaba a los interferones como los principales desencadenantes secundarios de las reacciones mediadas por APOL1-glomerulopatía (31, 36, 37). Este paradigma se vio reforzado aún más por el hecho de que el interferón alfa, beta,y gamma inducidaAPOL1expresión en podocitos cultivados y líneas celulares endoteliales (22). Sin embargo,Este arquetipo se ve cuestionado por la observación de que los interferones no siempre están elevados en el suero depacientes conInfección por COVID-19y COVAN, mientras que otras citocinas, incluidas IL-6, IL-1 y IL-18aumentan (4, 17, 18). En el estudio actual, demostramos que incluso en ausencia de interferones,estas citoquinas no interferónicas indujeron individual y colectivamente robustasAPOL1expresión en humanospodocitos y GEC y al mismo tiempo resalta una sinergia previamente no apreciada. Al demostrarque la señalización JAK-STAT es el mediador central de estos efectos combinados de citocinas, nuestros resultados proporcionanuna explicación plausible de cómo impulsa la tormenta de citoquinas COVID-19APOL1expresión y el altoincidencia de glomerulopatía colapsante observada en pacientes con variante de riesgoAPOL1yCOVID-19infección. Estos hallazgos pueden tener implicaciones para otrosNefropatías mediadas por APOL1-. 

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Si bien nuestros resultados muestran queCitoquinas inducidas por la COVID-19-son suficientes para inducirAPOL1expresióny provocar la pérdida depodocitos microorganoides renales, no excluyen la posibilidad de que los SAR-CoV-2 también puede infectar directamente las células renales, como se informó recientemente (38, 39). Sin embargo, SAR-CoV-2en tejido renal humano sólo se ha demostrado en muestras de autopsia en las que el factor de confusiónNo se pudo excluir la contribución de la autólisis del tejido (3, 4, 15, 16). La mayoría de los informes de biopsias de riñónde los pacientes con COVAN no han podido detectar el virus SARs-CoV-2 a pesar de utilizar métodos sensibles (3, 4),incluyendo dos de los nueve casos en el estudio actual que fueron probados por inmunohistoquímica y enhibridación in situ.

Al demostrar la podocitopatía inducida por citocinas, nuestro modelo de microorganoides renales se separó delpublicado recientementeorganoide renalmodelo de enfermedad renal mediada por APOL1-por Liu et al, quienesorganoides renales generados a partir de iPSC editadas con CRISPR de un donante no africano en el que G0APOL1Los alelos se editaron a alelos G1 pero con un trasfondo genético G0. Mientras que el interferón gammaAPOL1expresión en sus organoides, no causó citotoxicidad (40). La falta de citotoxicidad en susorganoide renalEl modelo podría explicar el trasfondo genético menos tóxico en el que se basan las mutaciones G1.fueron superpuestos. Se sabe que la citotoxicidad deAPOL1El haplotipo se ve afectado por su genética.antecedentes (41). Elmicroorganoide renalen el presente estudio se generó a partir de iPSC sin editarde un afroamericano portador del genotipo G1G2. La preservación del haplotipo genético nativo puedehan contribuido a la citotoxicidad asociada a APOL1-observada en nuestromicroorganismos renales. 

Además, en contraste con la expresión de la proteína APOL1 regulada positivamente que informamos aquí, un estudio recienteno encontró diferencias enAPOL1Nivel de ARNm en la biopsia de riñón de un paciente con COVAN en comparación concontroles sanos (26). Este desacuerdo en nuestros resultados puede explicarse por la naturaleza transitoria deAPOL1ARNm en relación con la proteína, especialmente cuando las biopsias se obtuvieron varias semanas después de la prueba inicial.diagnóstico de infección por COVID-19 cuando los efectos agudos de la tormenta de citocinas inducida por COVID-19-y laEl perfil de expresión de ARNm correspondiente puede haberse disipado. Es concebible que cuanto más lejos estéde la tormenta de citoquinas inducida por COVID-19-, más débiles serán los reactivos de fase aguda aguas abajo delreceptor de citocinas, incluidas las proteínas STAT fosforiladas yAPOL1ARNm. Nuestros resultadossugieren que la proteína APOL1 inducida persiste más alláAPOL1ARNm y STAT fosforilados.

Este estudio tiene tres implicaciones clínicas principales. Primero, subrayan la necesidad de genotipar a los negros oSe ha descubierto que personas hispanas tienen glomerulopatía colapsante en el contexto de COVID activo o reciente-19infección. Sin embargo, sibiopsia de riñónno es factible ni posible,APOL1genotipado de negro oLos individuos hispanos infectados con COVID-19-con proteinuria nueva o que empeora y IRA también es probable que seanalto rendimiento. En segundo lugar, porque múltiples citocinas inducidas por la COVID-19-activan de forma redundante el sistema JAK-STAT.vía para inducirAPOL1expresión, una estrategia terapéutica basada en la eliminación selectiva oEs poco probable que la inhibición de cualquier citocina sea eficaz para prevenir o tratar COVAN. Actualmente,baricitinib solo está autorizado para su uso bajo una autorización de uso de emergencia para el tratamiento de la COVID-19requiriendo oxígeno suplementario. Por lo tanto, su potencial como tratamiento para COVAN requiere seriasconsideración, especialmente para los portadores negros e hispanos de alto riesgoAPOL1genotipos que tienenInfección por COVID-19. Por último, basándose en la evidencia de que la deficiencia de interferón se asocia con gravesinfección por COVID-19, se propuso administrar interferón como terapia para la COVID-19. En elAl momento de escribir este artículo, según ClinicalTrials.gov, treinta y seis ensayos clínicos de interferón como terapia enCOVID-19 están en curso o completados. En contraste con la lógica detrás de estos ensayos clínicos, nuestraLos resultados advierten contra la administración de interferones como tratamiento para la infección por COVID-19 en portadores dealto riesgoAPOL1genotipo porque los interferones podrían regular positivamente la expresión de enfermedades patógenas.APOL1enelriñón y precipitado COVAN. 

Nuestro estudio tiene algunas limitaciones. Nuestra serie de casos COVAN de nueve colapsos comprobados por biopsiacasos de glomerulopatía es un tamaño de muestra relativamente pequeño y puede haber subestimado la asociaciónentre el genotipo de alto riesgo y COVAN o ha estado sujeto a sesgo de muestreo. El desafío logístico deLa obtención de biopsias de riñón de pacientes con infección activa por COVID-19 en entornos de cuidados intensivos limita lafrecuencia debiopsias de riñónen esta población. El mismo factor es probablemente responsable del hecho de queLa mayoría de las biopsias en este estudio se realizaron varias semanas o meses después del diagnóstico inicial deInfección por COVID-19. El análisis de biopsias de riñón obtenidas más cerca del desencadenante infeccioso puede proporcionarconocimientos adicionales sobre los primeros fenotipos celulares. Además, el estudio actual no identifica quiény cuándo tratar COVAN con inhibidores de JAK. Las respuestas a estas preguntas y la determinación de laLa eficacia de la inhibición de JAK como tratamiento para COVAN será el foco de futuras investigaciones.Este trabajo destaca la asociación de alto riesgoAPOL1genotipo y el papel de JAK-STAT-APOL1señalización en el desarrollo de COVAN. A medida que evoluciona nuestra comprensión de la pandemia de COVID-19,Existe una necesidad urgente de aumentar la concienciación de los médicos y de la salud pública sobre las complicaciones renales.de COVID-19. También existe una necesidad urgente de terapia COVAN. Nuestro estudio ofrece nuevos datos sobre JAKinhibidores como fuertes candidatos terapéuticos para COVAN asociado a APOL1-.

Métodos

Anticuerpos y reactivos.

Se utilizaron anticuerpos primarios contra las siguientes proteínas: APOL1 conejoantihumano [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (concentración final 0,05 ug/ml);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (concentración final 0,95 ug/mL) según un informe reciente (42)];Ratón APOL1 antihumano [Genentech, 4.17A5; Inmunofluorescencia [IF] 1:2000 (concentración final2,13 ug/ml)]; Antihumano de ratón GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); vinculinaratón antihumano (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 ratón antihumano (Santa CruzBiotecnología, sc373787; WB 1:300); WT1 conejo antihumano (Abcam, ab89901; WB 1:1000); ESTADÍSTICA1ratón antihumano (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 conejo antihumano(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 ratón antihumano (CST, 9139; WB 1:1000); fosforiladoSTAT1 (Y701) conejo antihumano (CST, 9167; WB 1:1000); Anticonejo fosforilado-STAT2 (Y690)humano (CST, 88410; WB 1:1000); Conejo fosforilado-STAT3 (Y705) antihumano (CST, 9145; WB1:2000); PODXL antihumano de cabra (I+D, AF1658; IF 1:500), antihumano de conejo E-Cadherin (CellSeñalización, 3195S; IF 1:200), antihumano de ratón NEPH1 (Santa Cruz, sc-373787; IF 1:100). Secundariolos anticuerpos incluían IgG anti-conejo de cabra, anticuerpo unido a HRP (CST, 7074s; WB 1:1000); caballo contraIgG de ratón, anticuerpo unido a HRP (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 conjugado burro antiratón (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 conjugado anti-burrocabra (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000) y burro conjugado Alexa Fluor 405anti-conejo (Thermo Scientific, A48258; 1:000). Para qRT-PCR, ensayos de expresión genética TaqManincluyó APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) y PECAM-1 (Hs00169777_m1).Tinción de inmunohistoquímica renal para APOL1, sinaptopodina y CD31. Comenzando con formol fijadoPortaobjetos de biopsia de riñón incluidos en parafina, la recuperación del antígeno se realizó con (solución de EDTA a pH 8.0)durante 56 minutos a 100 grados. Anticuerpos primarios contra APOL1 (5.17D12, Genentech), sinaptopodina (ProgenBiotechnik, 61094) y CD31 (Cell Signaling, 3528s) se aplicaron a 1:4000 (concentración final 0,95ug/mL), 1:100 y 1:1600, respectivamente durante 60 minutos a 36 grados. Conjugado HQ listo para usarSe incubaron multímeros anti-conejo secundarios (760-4815) durante 12 minutos a 36 grados. esto fue seguidomediante la adición de anti-HQ HRP durante 12 min. Se incubó DAB (760-159) durante 5 minutos a temperatura ambiente.temperatura. La sección de tejido se contratiñó con hematoxilina (760-2021) durante 4 minutos a temperatura ambiente.Se añadió reactivo azulante (760-2037) durante 4 minutos a temperatura ambiente.

Tratamiento con citoquinas de células cultivadas.

Células endoteliales glomerulares humanas primarias, podocitos primariosse subcultivaron de riñón de donante humano y los podocitos derivados de organoides se trataron con 50 ng/ml,Concentración de 20 ng/ml o 10 ng/ml de las siguientes citocinas: CXCL9 humana recombinante(Bioleyenda, 578102); CXCL10 humano recombinante (Biolegend, 573502); Humano recombinanteCXCL13 (Bioleyenda, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Bioleyenda, 592102); IL-8 (Bioleyenda, 574202); Interferón (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeta (Peprotech, 300-02BC); IFN gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alfa (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Se predeterminó una concentración de citocina estandarizada de 50 ng/ml basándose en el precedente deTratamientos con células humanas que evalúan los síndromes de shock por citocinas en la infección por COVID-19 (17). Hacer un seguimientoLos experimentos utilizaron concentraciones de 20 ng/ml y 10 ng/ml. Tratamientos posteriores, incluido el organoide.y experimentos de podocitos derivados de organoides, se realizaron utilizando 10 ng/ml. Inhibidor de JAK 1/2,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), se utilizó a una concentración final de 10 uM en todosexperimentos.

Cultivo primario de células endoteliales glomerulares humanas. El congeladostock de humanos primarios de bajo riesgo (G0G0)Las células endoteliales glomerulares se adquirieron de Celprogen (36066-05), se descongelaron y se cultivaron en humanos.Medio completo de cultivo de células endoteliales primarias glomerulares con suero, libre de antibióticos (Celprogen,M36066-05SA) en placas recubiertas con matriz extracelular patentada (Celprogen, E36066-05-PD10 yE36066-05-12Bueno) en un ambiente humidificado a 37 grados y 5 % de CO2. Las células se pasaron usando 1XTripsina EDTA (Celprogen, T1509-014). Las células se utilizaron para experimentos entre los pases 2 a 4.Las células se validaron mediante qRT-PCR y mostraron un enriquecimiento en la expresión del gen PECAM1 (células endoteliales).marcador, también conocido como CD31).

Aislamiento glomerular de riñón humano donado y subcultivo de podocitos.El riñón de un donante humano fueadquiridos a través del Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades (NDRI). El genotipo APOL1 del donante fueG0G1. El aislamiento glomerular se realizó utilizando el método de tamiz adaptado de una publicación anterior (43,44). Brevemente, trabajando sobre hielo en una campana esterilizada, primero se decapsula el riñón y se corta por la mitad en sentido medio sagital.. Se diseccionó la médula, dejando la corteza restante. Luego se picó la cortezay se pasó secuencialmente a través de tamices de malla de acero inoxidable (tamaños 425 µm, 250 µm) y se recogió enparte superior de un tercer tamiz (150 µm) mientras se lava frecuentemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) previamente enfriadacon 1% de BSA (sin calcio ni magnesio) (Endecotts, Sieves 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Se recogieron los glomérulos, se centrifugaron y se resuspendieron en 5 ml de PBS. 10 µL de la muestrase tiñeron con el reactivo NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) y visualizado mediante microscopía óptica. Luego se incubaron los glomérulos en tampón de digestión.[DMEM/F12, 1 mg/ml de cada uno de (colagenasa I, IV y V), ADNasa I (50 U/ml o 50 µg/ml)] a 37 grados para1 hora para obtener una suspensión de células individuales (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 con 10%FBS (Sistemas de I+D,S10350H) se añadió para detener la digestión y la muestra se centrifugó a 450 g por minuto a 4 grados.Los podocitos aislados se subcultivaron en RPMI avanzado (Fischer Scientific, MT10040CV) con FBS al 10%.y penicilina-estreptomicina al 1% (Thermo Fisher Scientific, 15070063) en placas recubiertas de vitronectina(StemCell Technologies, 07004) a 37 grados y 5% de CO2. Las células subcultivadas fueron visibles a ~5 días yfueron tratados después de 2 semanas en cultivo.

Extracción de proteínas y transferencia Western.Todas las placas de cultivo y muestras se mantuvieron a 4 grados. una monocapade células se lisó y se recogió con Cell Lysis Buffer (Cell Signaling, 9803) con completainhibidor de mini proteasa e inhibidor de fosfatasa (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Las muestras se sonicaron al nivel 4 durante 10 segundos cada una, se centrifugaron a 12000 rpm x 5 min, el sobrenadantese recogió en un tubo Eppendorf nuevo y la concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de proteína BCA(Pierce, 23225). Los lisados ​​​​de proteínas se diluyeron con 4x tampón de muestra LaemmLi 2-mercaptoetanol(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) y se calentó a 95-100 grados durante 5 minutos. Lisados ​​de proteínasLuego se separaron usando geles sin manchas Criterion TGX (4-20%) y se transfirieron usando Bio-Rad TransSistema de transferencia Blot Turbo. Las membranas transferidas se bloquearon durante 1 hora en leche descremada al 3% en tampón Tris.solución salina y se incuba con anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 grados. día siguiente despuéslavado estándar, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano picante secundaria conjugadaanticuerpo durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente antes de la obtención de imágenes con el sistema de imágenes Bio-Rad ChemiDoc MPsegún las instrucciones del fabricante.

Extracción de ARN y qRT-PCR.El ARN se aisló de la monocapa celular usando tampón de lisis RLT yQiagen RNEasy Mini Kit (74106) según las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió en ADNc utilizandoReactivos y protocolo de transcriptasa inversa Invitrogen SuperScript IV (Thermo Fisher, 18091050).Las reacciones qRT-PCR se realizaron con Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) y ensayos de expresión genética utilizando el sistema QuantStudio 6 Flex(Thermo Fisher Scientific) usando ∆∆Ct Método con GAPDH como gen de referencia.

Genotipado.El ADN se extrajo de bloques de tejido FFPE utilizando el kit de tejido QIAamp DNA FFPE(Qiagen, 56404) según el protocolo del fabricante. El genotipado se realizó utilizando Applied Biosystems.Ensayos de discriminación alélica de Taqman para G1 SNP (p.Ser342Gly) y polimorfismo G2(p.Asn388_Tyr389del) utilizando QuantStudio 6 Flex System. Este ensayo tiene una especificidad analítica del 100% yuna sensibilidad analítica (límite de detección) de 1,0ng de ADN para la detección deAPOL1variantes de riesgo en el ADNextraído de monocitos de sangre periférica. Los ensayos se validaron previamente comparando los resultados consecuenciación directa (secuenciación de Sanger). Las medidas de control de calidad del genotipado incluyeron el uso deréplicas técnicas, 100% de coincidencia de controles positivos de cada genotipo y controles negativos.

Derivación del microorganoide renal iPSC del paciente G1G2.Los microorganismos renales se derivaron según elprotocolo publicado (27), con algunas modificaciones. Brevemente, células madre pluripotentes humanas inducidas (iPSC)se disociaron en células individuales usando TrypLE Select y se sembraron en placas recubiertas con vitronectina enMedio StemFlex (Thermo Fisher Scientific, A3349401) con inhibidor de Rho quinasa 10uM (TocrisBioscience, 1254) a una densidad de 11,000-14,000 células/cm2 y cultivado en un ambiente humidificado a37 grados y 5% CO2. Luego, las células se transfirieron a medios TeSR-E6 (Stemcell Technologies, 05946) conCHIR99021 8 µM (Tocris Bioscience, 4423) durante 4 días. Del día 5 al día 7, las células fueron tratadas con200 ng/ml de FGF9, 1 µg/ml de heparina y 1 µM de CHIR99021. El día 7, las células se lavaron con PBS ydisociado con TrypLE. Luego, las células disociadas se lavaron con DMEM simple y se centrifugaron a300xg durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió en medio Stage1 [TeSR-E6 que contiene 200 ng/mlFGF9, heparina 1 µg/ml, CHIR99021 1 µM, PVA al 0,1 %, inhibidor de Rho quinasa 10 µM (Tocris Bioscience)]y se transfirió a una placa 24-pozo AggreWell 400 (Stemcell, 34411) a aproximadamente 1,2 millonescélulas/pozo. Luego la placa se centrifugó a 100 xg durante 3 minutos y se incubó durante 48 horas a 37 grados y5% CO2 en una incubadora de cultivo celular estándar. Después de 48 horas (día7+2), los organoides del AggreWell fuerontransferido a una 6-placa de fijación baja con medio Stage2 [TeSR-E6 que contiene 200 ng/mL de FGF9, 1µg/mL de heparina, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] en un agitador orbital dentro de una incubadora de células durante otros 72horas. Desde el día 7+5 en adelante, todos los organoides se actualizaron con medios de la Etapa 3 [TeSR-E6 que contiene0.1% PVA] en días alternativos hasta que se utilice para experimentos.

Aislamiento de podocitos a partir de microorganoides.El aislamiento de glomérulos de organoides renales se adaptó de unprotocolo previamente descrito (45). Brevemente, grupos de organoides renales derivados de iPSC con una inicialnúmero de celda inicial de 1.2x106 Las iPSC se disociaron mediante incubación con TrypLE select (ThermoFisher) durante 5 min a 37 grados. Se aplicó una mezcla suave con una pipeta de 1 ml cada 2-3 min para ayudardisociación. Por grupo, se colocó un único filtro celular de 70 µm (PluriSelect) en un tubo de 50 ml (Falcon)y la malla se hidrató con PBS. La solución celular se añadió usando una pipeta de 1 ml, permitiendo el flujode la solución por gravedad. Usando el émbolo de una jeringa estéril de 1 ml, la célula restanteLa solución capturada en el colador se empujó suavemente a través de la malla. El colador se lavó conPBS y se desecha, manteniendo el flujo celular. Luego se pipeteó el flujo celular sobre un recipiente prehidratado.Colador de células de 40 µm (Pluriselect) y se coloca en un tubo nuevo de 50 ml (Falcon) permitiendo que las células individualesfluir por gravedad y lavar abundantemente el tamiz con PBS para eliminar cualquier restocélulas. Luego se recogieron los glomérulos más grandes del filtro celular de 40 µm invirtiendo el tamiz sobreun tubo nuevo de 50 ml y se lavó con PBS para eliminar los glomérulos capturados. Este proceso fuerepetido usando el flujo continuo desde el proceso de 40 µm usando el filtro celular final de 30 µm (PluriSelect) pararecoger los glomérulos más pequeños. Se cultivaron glomérulos aislados de organoides renales derivados de IPSC enplacas recubiertas de vitronectina con RPMI 1640 avanzado que contiene 10 % de FBS en un cultivo celular estándarIncubadora a 37 grados más 5% de CO2. Los medios se renovaron cada dos días hasta que las células se utilizaron paraexperimentos.

Tinción por inmunofluorescencia, microorganoide.Los microorganismos renales se lavaron con PBS yfijado en PFA al 4 % en PBS durante 30-45 min en hielo. Luego, los organoides fijados se lavaron tres veces con PBS.y se incubó en sacarosa al 30% en PBS durante la noche a 4 grados. Los organoides se incluyeron en OCT ysometido a crioseccionamiento de 10 µm con un criostato Laica. Las criosecciones de organoides se lavaron tresveces con PBS y luego bloqueado con tampón de bloqueo 1 (1% gelatina de pescado, 2% suero de burro, 0.3% TritonX-100 en PBS) durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, las criosecciones se incubaron con primariaanticuerpos en tampón de bloqueo 1 durante la noche a 4 grados. Las criosecciones se lavaron tres veces con PBS. DespuésDespués del lavado, las criosecciones se incubaron con anticuerpos secundarios en el tampón de bloqueo 1 durante 2 horas a temperatura ambiente.temperatura. Después de cinco lavados con PBS, las criosecciones se montaron con un antifade Prolong Glass.solución de montaje (Thermo Scientific, P36980). Las imágenes fluorescentes se generaron utilizando un ECHO.microscopio.

Tinción de inmunofluorescencia, podocitos.Los cultivos de podocitos se lavaron con PBS y se fijaron en solución al 4%.PFA en PBS durante 10-15 min a temperatura ambiente. Después de la fijación, las células se lavaron tres veces con PBS.y bloqueado en tampón de bloqueo 2 (1% gelatina de pescador, 2% suero de burro, 0.1% saponina en PBS) durante 30-60mín. Las células se incubaron con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo 2 durante 2 horas a temperatura ambiente.(o durante la noche a 4 grados). Las células se lavaron tres veces con tampón de bloqueo 2 y se incubaron conanticuerpos secundarios en tampón de bloqueo 2 durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados conbloqueando el tampón 2 y un lavado final con PBS, las células se montaron con un Drop-n-Stain EverBritemedio de montaje (Biotium, 23008). Se capturaron imágenes fluorescentes utilizando un microscopio ECHO.

Pruebas de viabilidad. Para la viabilidad celular y las mediciones de ATP, se sembraron podocitos derivados de organoides.en una placa de pocillos 96- recubierta con vitronectina en medio de 100 uL (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) y cultivado en RPMI avanzado+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) en ambiente humidificado a 37 grados y 5% de CO2. Derivado de organoidesLos podocitos se sembraron simultáneamente en una placa de pocillos 6- que se utilizará para la extracción de ARN para qPCR yen una 24-placa de pocillos que se utilizará para inmunohistoquímica (IHC). Las células fueron tratadas con ~80% de confluenciacon seis condiciones [control, IFNG (10ng/mL), IFNG (10ng/mL) + baricitinib (concentración final 10uM),Todas las citocinas (10 ng/ml) y todas las citocinas (10 ng/ml) + baricitinib (concentración final 10 uM)]. Medios de comunicaciónse cambió a las 48 horas y las células se evaluaron a las 96 horas. 96-la placa de pocillos se procesó con Promegaensayos de viabilidad celular y ATP como se menciona más adelante; la 6-placa de pocillos se procesó para detectar ARNextracción, síntesis de ADNc y qRT-PCR; y la placa de pocillos 24- se fijó en PFA al 4 % para IHC. Título celularFlúorMTEnsayo de viabilidad celular (Promega, G6080) y CellTiter-Glo® 2.0 Ensayo (Promega, G9241) fueronSe realiza siguiendo las instrucciones del protocolo estándar proporcionadas por el fabricante. Los ensayos fueron multiplexadospor protocolo. Se evaluaron fluorescencia (ensayo de proteasa no lítica) y luminiscencia (ensayo de ATP lítico).medido usando un fluorómetro SpectramaxM3. La diferencia de medidas fue determinada por la prueba de Student.Prueba t no apareada.

Estadísticas.Todos los datos se presentan como media ± DE. Para los datos se utilizó el software GraphPad Prism 8.3.1.analysis. Cytokine conditions inducing >1,5 vecesAPOL1transcripción en comparación con el control tratado con mediosse analizaron para determinar su significancia mediante una prueba t no apareada con corrección de Holm-Sidak para múltiplescomparaciones. Los valores P informados son los valores p ajustados. La importancia se fijó en p<0.05.

Aprobación del estudio. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Duke,Carolina del Norte. El IRB no requirió el consentimiento informado del paciente porque la parte del caso de esteEl estudio fue una revisión retrospectiva de material patológico clínico y archivado únicamente. Riñón humano paraEl aislamiento glomerular y el subcultivo de podocitos se obtuvieron a través del National Disease Research.Intercambio (NDRI); Esta investigación sobre tejidos humanos también fue aprobada previamente a través del IRB de Duke. NDRIrequiere que todos los sitios de origen de tejido obtengan el consentimiento informado del donante de tejido o del sustituto.

Contribuciones de autorSEN, GL, SD, KS y DS realizaron experimentos y editaron manuscritos. AW y DT realizaron yinterpretó la histopatología y la IHC, y editó el manuscrito. GH aportó reactivos esenciales y editó elmanuscrito. SEN y OAO diseñaron el estudio, analizaron e interpretaron datos, diseñaron figuras yEscribió y editó el manuscrito.

Expresiones de gratitudEste trabajo fue apoyado por 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 y el Whitehead Scholar Award.(OAO); SEN contó con el apoyo de la beca de formación Duke Nephrology T32 (5T32DK007731-24). AgradecemosSuzie Scales (Genentech) por el generoso obsequio de anticuerpos específicos de APOL1-. Agradecemos a la InvestigaciónLaboratorio de Histología en Duke BRPC y Steven R. Colon en PhotoPath, Departamento de Patología de Duke.

Referencias

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, et al. IRA en pacientes hospitalizados con COVID-19. J. Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, et al. Lesión renal aguda en pacientes.hospitalizado con COVID-19.Riñón Int.2020;98(1):209-18. 

3. Mayo RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, et al. Una cohorte retrospectiva multicéntricaEl estudio define el espectro de la patología renal en la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19).Riñón Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernández-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, et al. IRA y colapsoGlomerulopatía asociada a COVID-19 y genotipo de alto riesgo APOL 1.J. Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, et al. Asociación deVariantes tripanolíticas de ApoL1 con enfermedad renal en afroamericanos.Ciencia.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ y Pollak MR. Nefropatía APOL1: de la genética a las aplicaciones clínicas.Clin J Am SocNefrol.2020. 

7. Friedman DJ y Pollak MR. APOL1 y la enfermedad renal: de la genética a la biología.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Mutaciones sin sentido en APOL1El gen MYH9 está altamente asociado con el riesgo de enfermedad renal en etapa terminal previamente atribuido al gen MYH9.Hum Genet.2010;128(3):345-50. 

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