Enfermedad renal: ¿Cómo induce el níquel la autofagia en el riñón?

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Parte Ⅰ: el níquel induce la autofagia a través de las vías PI3K/AKT/mTOR y AMPK en riñón de ratón

Heng Yin, Zhicai Zuo y otros.

1. Introducción

Níquel(Ni), un elemento natural, está ampliamente distribuido en los compartimentos ambientales, incluidos el suelo, el agua y el aire (Schrenk et al, 2020). Ni (Níquel)compuestos y Ni metálico (Níquel)tienen muchas aplicaciones industriales y comerciales, como la producción de aleaciones, galvanoplastia, baterías de níquel-cadmio y catalizadores en la industria química y alimentaria (Genchi et al., 2020). Sin embargo, el amplio uso industrial de Ni (Níquel)conduce a una contaminación ambiental generalizada, lo que aumenta el riesgo de exposición humana al Ni a través de los alimentos y el agua potable (Das et al, 2018). Aunque ni (Níquel) es un micronutriente esencial para humanos y animales, la exposición excesiva al Ni es extremadamente peligrosa para la salud humana (Das et al., 2018).

Con la creciente incidencia de Ni (Níquel)En los últimos años, la toxicología del Ni, incluida la inmunotoxicidad, la hepatotoxicidad, la nefrotoxicidad y la toxicidad pulmonar, ha atraído una atención cada vez mayor (Gathwan et al., 2013; Deng et al., 2016; Hasanein y Felegari, 2017; Guo et al., 2020a) .2020b). losriñón, como un órgano diana importante en Ni (Níquel)toxicología, con una acumulación de Ni (Níquel)y Ni (Níquel)los compuestos que contiene a través de la exposición crónica pueden inducir un daño renal significativo (Elangovan et al, 2018). La investigación existente de nuestro equipo de investigación ha demostrado la inducción del estrés oxidativo, la apoptosis, la inflamación y la detención del ciclo celular en elriñónde pollos de engorde por NiCl2 (Níquelcloruro 2) en alimentos superior a 300 mg/kg (Guo et al, 2014, 2016a, 2016b). Varios estudios han sugerido que el mecanismo de toxicología renal del Ni incluye daño oxidativo, roturas de cadenas de ADN y apoptosis (Lee et al, 2001; Chen et al., 2010).

Jugando un papel crucial en la homeostasis celular,autofagiase ha encontrado que tiene una asociación con la incidencia y la patogenia de diversas enfermedades (Martin et al, 2019). Estudios recientes han demostrado que la muerte celular puede ser intermediada por el descontrol o la sobreestimulación deautofagia(Denton y Kumar, 2019). Como un proceso intracelular complejo y altamente ordenado,autofagiacomienza a partir de la formación de vesículas de doble membrana conocidas como autofagosomas que envuelven parte del citosol y los orgánulos (Martin et al, 2019). Posteriormente, los autofagosomas participan en la proteólisis de las sustancias engullidas después de pasar a los lisosomas.

autofagiaes sensible a varios tipos de estrés celular, como la privación de factores de crecimiento o nutrientes, hipoxia, daño en el ADN, especies reactivas de oxígeno (ROS), agregación de proteínas, patógenos intracelulares o daño a los orgánulos (Dodson et al, 2013). Es un proceso extremadamente complejo para regularautofagia, que involucra muchas vías de señalización, incluidas la proteína quinasa activada por monofosfato de adenosina (AMPK), la fosfatidilinositol 3-quinasa-I (PI3K) y las vías del objetivo de la rapamicina en mamíferos (mTOR) (Cao et al2021). Y, la vía mTOR tiene un efecto fundamental enautofagiainiciación. La actividad mTOR es un punto de control central deautofagia, cuyo efecto inhibitorio conduce a la desfosforilación de ULK1 aliviandoautofagiainhibición (Parzvch y Klionsky, 2014). Además, PI3K/Akt y AMPK son los principales reguladores aguas arriba de mTOR (Gong et al, 2020; Xu et al, 2020). Investigaciones anteriores sugirieron que los metales pesados ​​(como Cd, Hg, Cu y Pb) pueden inducir la aparición deautofagia(Su et al, 2017). Aunque Huang et al. (2016) y Son et al. (2017) han encontrado que Ni (Níquel)la exposición podría inducir eficientementeautofagiaen las células epiteliales bronquiales, el mecanismo preciso aún no está claro,

El efecto de Ni (Níquel)enautofagiarara vez se ha informado, y solo unos pocos estudios están disponibles sobre los efectos del Ni sobre la función renal.autofagiade ratones in vivo. Por lo tanto, el trabajo actual tiene como objetivo confirmar si NiCl2 (Níquelcloruro 2)el tratamiento puede inducirautofagiay evaluar el mecanismo potencial de NiCl (Níquelcloruro)-inducidoautofagia, incluidas las vías AMPK y PI3K/AKT/mTOR.

El níquel afecta el riñón y causa enfermedad renal.

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2. Materiales y métodos

2.1. Químicos y anticuerpos

Níquelcloruro(NiCl) fue proporcionado por Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd (Chengdu, China). En el análisis de inmunotransferencia, todos los anticuerpos se adquirieron de Cell Signaling Technology (CST, EE. UU.), incluida la cadena ligera 3B (LC3B) de proteína asociada a microtúbulos anti-conejo (N.° de cat. 43566T), p62 anti-conejo (SQSTM1) (Cat n.° 5114D), anti-conejo Beclin1 (Cat. n.° 3495T), anti-conejoautofagiaproteína relacionada 12 (Atg12)(n.° de cat. 4180T), Atg5 anticonejo (n.° de cat. 12994T), Atg16L1 anticonejo (n.° de cat. 8089T), Atg7 anticonejo (n.° de cat. 8558T), Atg3 anticonejo ( N.° de cat. 3415T), objetivo de rapamicina en mamíferos anti-conejo (mTOR) (n.° de cat. 2983T), p-mTOR anti-conejo (n.° de cat. 5536T), anti-conejo unc-51 como quinasa 1 (ULK1 )(Cat. n.° 8054D), anti-conejo p-UIK1 (Cat. n.° 5869T), anti-conejo PI3K (Cat. n.° 4292S), anti-conejo p PI3K (Cat. n.° 4228T, anti-conejo Akt (Cat. n.° .9272S), p-Akt anti-conejo (n.° de cat. 4060T), mTOR anti-conejo (n.° de cat. 2972S), p-mTOR anti-conejo (n.° de cat. 5536S), AMPK anti-conejo (n.° de cat. 5831S) ), anti-p-AMPK de conejo (n.º de cat. 2535S) y -actina (n.º de cat. 4970T).

2.2.Animales y tratamientos

Dashuo Biological Technology Company (Chengdu, China) proporcionó un total de 160 ratones ICR macho sanos de ocho semanas de edad. Todos los animales se mantuvieron en condiciones constantes (temperatura 25±2C; 12-h ciclo de luz-oscuridad) en ambientes asépticos, y se alimentaron con dieta estándar de gránulos y agua ad libitum. Los ratones se clasificaron aleatoriamente en cuatro grupos, cada uno con cuarenta mics después de aclimatarse durante siete días. Se administró agua destilada por vía intragástrica al control, mientras que Ni (Níquel)(NiCl2 (Níquelcloruro 2).6H2O) con dosis de 7,5, 15 y 30 mg/kg por vía intragástrica a animales en grupos experimentales. El Ni que adopta aquí se determinó de acuerdo con el valor de la dosis letal media (DL50, 306,11 mg/kg) alcanzado en la investigación sobre la toxicidad oral aguda de ratones macho. NiCl (Níquelcloruro)Se diluyó ,6HZO usando agua destilada antes de realizar los experimentos. A los cuatro grupos se les administró una dosis forzada de 1 ml por 100 g de peso corporal una vez al día durante 28 días. Después del tratamiento durante 14 y 28 días, todos los animales fueron sacrificados humanitariamente para recoger susriñónmuestras para su análisis en las secciones a continuación. Todos los animales de experimentación y los procedimientos se llevaron a cabo siguiendo el acuerdo de recibir la aprobación del Comité de Ética y Cuidado Animal de la Universidad Agrícola de Sichuan (aprobación n.º: 2012-024, Chengdu, China).

2.3. Determinación del índice y funciones renales

Todos los ratones fueron pesados ​​cada semana y sacrificados humanamente al terminar el tratamiento, y luegoriñonesfueron cortados y pesados. losriñóníndice utilizado fue una relación entreriñónpeso y peso corporal.

Los investigadores midieron el nitrógeno ureico en sangre (BUN) y los niveles de creatinina sérica (CRE) siguiendo las instrucciones de los kits comerciales producidos por el Instituto de Bioingeniería Naniing Jiancheng de China (Nanjing, China),

2.4. Determinación de la acumulación renal de Ni (Níquel)

Riñónlas muestras se tomaron el día 28 durante el experimento. Luego, 1 ml de HClO y 9 ml de HNO. (Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd., China) para digerir en húmedo 0 porciones de 0,5 g de muestras durante 24 h en tubos resistentes a altas temperaturas. Luego, estos tubos se colocaron en una placa caliente para evaporar todo el líquido, seguido de la suspensión del residuo usando 10 mL 0,1 M/L HNO. Posteriormente, los investigadores analizaron muestras en términos de Ni (Níquel)con la ayuda de un espectrofotómetro de absorción atómica de llama (AAS700, PerkinElmer, USA).

2.5. Observación histopatológica y de ultraestructura

Después de recolectarse y luego fijarse en paraformaldehído al 4 por ciento, elriñónlas muestras se deshidrataron con alcohol, se incluyeron en parafina, se cortaron en rodajas de 5 um y se procesaron para teñirlas con hematoxilina y eosina. Se utilizó una cámara digital (Nikon DS-Ri1, Japón) para observar los cortes y tomar fotografías de los cambios histopatológicos. Diez campos microscópicos de cadariñónfueron revisados. Las imágenes mostradas en el periódico eran las representativas.

Para la evaluación ultraestructural, se aplicó glutaraldehído al 2,5 por ciento para fijarriñóntejidos (alrededor de 1 mm5) a temperatura ambiente. A esto le siguió la fijación posterior de estos tejidos en tetróxido de osmio al 1 por ciento, deshidratado en acetona e incluido en resina epoxi. Las rebanadas ultrafinas preparadas se colocaron en rejillas de cobre y luego se tiñeron con acetato de uranilo y acetato de plomo. Las imágenes de la ultraestructura se capturaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEM-1400Flash (JEOL, Japón).

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2.6. inmunohistoquímica

Después de desparafinarse con xileno, las rebanadas de parafina se rehidrataron utilizando un conjunto graduado de solución de etanol. A esto le siguió un lavado con agua destilada y PBS, y un bloqueo de 15 minutos de las actividades de peroxidasa endógena (EPA) mediante incubación usando 3 por ciento de H2O en metanol para extinguir el EPA. Para facilitar la recuperación del antígeno, tratamos los cortes con microondas durante 15 minutos en 0.0tampón de citrato de sodio 1 M con pH de 6,0. Después de saturarlos con suero normal de cabra al 10 % durante 30 minutos, Luego, los cortes se incubaron usando anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados. El anticuerpo secundario IgG anti-conejo/ratón de cabra biotinilado al 1 por ciento (Boster, Wuhan, China) se usó para incubar cortes lavados con PBS a 37 grados durante 1 h, y luego a 37 grados, el complejo estreptavidina-biotina (SABC;Boster , Wuhan, China) se utilizó durante 30 min. A esto le siguió la inmersión de los cortes en clorhidrato de diaminobencidina (DAB; Boster, Wuhan, China) para la visualización de la inmunorreacción. Finalmente, después de una ligera contratinción con hematoxilina, los cortes se deshidrataron con etanol, se aclararon con xileno y se montaron sucesivamente.

Se utilizó la densidad óptica integrada (IOD) para la cuantificación de los niveles de proteína de LC3B y p62. El método analítico para el valor de IOD se refirió a Fanget al. (2018). Se adoptó un sistema de cámara de microscopio digital Nikon DS-Ril (Japón) para tomar imágenes. Luego, los investigadores seleccionaron cinco campos (0.064 mm²) en cada área de imágenes de cada corte para su análisis con la ayuda del software Image-Pro Plus v6.0 (Media Cybernetics Inc, Bethesda, MD, EE. UU. ).

2.7. transferencia occidental

Extracción de proteínas deriñónlas muestras se realizaron utilizando el tampón de lisis RIPA, y el reactivo de ensayo de proteínas BCA (P0010S, Beyotime Technology, China) se utilizó para medir la concentración. Luego se llevó a cabo SDS-PAGE para muestras de proteínas, que luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Bloqueadas usando leche desnatada al 5 por ciento durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con anticuerpo primario a 4 grados durante la noche. Después de usar un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante para incubar durante 1 h, se empleó un Chemidoc XRS para detectar bandas de proteína en las membranas usando el kit ECL (P0018A, Beyotime Technology, China).

2.8.Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Riñonesse tomaron y se molieron con nitrógeno líquido en un mortero usando un mazo y luego se conservaron a baja temperatura (-80 grados), el ARN total renal se extrajo usando RNAiso Plus (9108/9109, Takara, Otsu, Japón) siguiendo las recomendaciones de el fabricante. Esto fue seguido por la síntesis de ADN complementario (ADNc) con un kit de reactivos RR047A Prim-ScriptTM RT producido por Takara en Japón siguiendo las instrucciones. A partir de entonces, se realizó qRT-PCR mediante el uso de un sistema de PCR en tiempo real LightCycler ⑩ 480 (Bio-Rad, EE. UU.) y un kit SYBR Premix Ex TaqTMII (DRR820A, Takara, Japón). Los cebadores utilizados para una PCR se enumeran en la Tabla 1. Se utilizó actina para la normalización de la expresión génica y la expresión relativa de ARNm se calculó mediante el método 2-4ac (Livak y Schmittgen, 2001).

2.9. análisis estadístico

Los datos se expresaron en forma de media ± desviación estándar y se analizaron mediante LSD o análisis de varianza T3 de Dunnett. Se utilizó el software SPSS (versión 22.0, IBM Corp, Armonk, NY, EE. UU.) para todos los análisis estadísticos para Windows. PAGS<0.05 represents="" a="" significant="">

Tabla 1: La secuencia de cebadores utilizados en el estudio,

3. Resultados

3.1.NiClz (Níquelcloruro)deteriora la función renal

Como se muestra en la Fig. 1A, el peso corporal disminuyó en tres grupos tratados con NiCl2 (Níquelcloruro 2). Y, también se encontró una disminución significativa en el peso relativo de losriñón(P<0.05) in="" the="" 30="" mg/kg="" group="" at="" 28="" days="" (fig.="">

Se utilizaron CRE y BUN séricos como biomarcadores estándar para la función renal. Los resultados de la función renal se muestran en las Fig. 1C y D, y las concentraciones de CRE y BUN aumentaron significativamente (P<0.05)in the=""> (Níquelcloruro 2)-grupos de tratamiento a los días 14 y 28 relativos al control.

Fig.1E mostró que los tres Ni (Níquel)los grupos de tratamiento tienen concentraciones significativamente mayores de Ni en el riñón (P<0.05)compared to="" the="">

3.2. NiCl (Níquelcloruro)- induce variaciones histopatológicas de riñón

La figura 2 muestra que NiClz (Níquelcloruro)tratamiento provocó variaciones histopatológicas de lariñóncon dosis y tiempo, involucrando glomérulo inflamado junto con espacio capsular estrecho, la degeneración vacuolar y granular en el epitelio tubular renal.

Figura 2. NiCl2 (Níquelcloruro 2)induce cambios histopatológicos en el riñón.

Las lesiones histopatológicas incluyeron glomérulo inflamado junto con espacio capsular estrechado (*), degeneración vacuolar (flechas negras) y degeneración granular (flechas blancas) en los epitelios tubulares renales. Tinción HE, barra de escala=50 µm.

3.3.NiCl (Níquelcloruro)induce la autofagia y aumenta los genes y proteínas relacionados con la autofagia en el riñón

LC3 y p62 son los biomarcadores cruciales deautofagia(Gómez-San-chez et al..2016). En comparación con el control, los tres NiCl2 (Níquelcloruro 2) los grupos de tratamiento presenciaron un aumento significativo en el nivel de proteína de LC3-I/I (P< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28,="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" protein="" level="" of="">< 0.05)(fig.3a-c).="" inconsistent="" with="" the="" protein="" experiment="" results,="" relative="" to="" the="" control="" group(fig.="" 3d="" and="" e),="" the="" treatment="" groups="" showed="" significantly="" increased="" mrna="" expression="" level="" of="" lc3=""><0.05)and significantly="" decreased="" mrna="" expression="" level="" of=""><0.05). otherwise,="">autofagiaes también la determinación por TEM en este estudio. Como se muestra en la Fig. 3F, las observaciones de TEM mostraron que el número de autolisosomas aumentó en el tejido renal después de NiCl2 (Níquelcloruro 2)exposición.

Figura 3. NiCl2 (Níquelcloruro 2)aumenta la autofagia en el riñón de ratones.

(A) Los resultados de Western blot de LC3 y p62. (B, C) La cuantificación de LC3-II/I y p62. (DE) La expresión de ARNm de LC3 y p62. (F)

La estructura ultraestructural de la célula epitelial del túbulo contorneado proximal (las figuras de la derecha muestran el agrandamiento parcial de las figuras de la izquierda; las flechas negras indican estructuras de autolisosomas).

Los valores se presentan con la media ± desviación estándar (n {{0}}). Las columnas marcadas con letras diferentes son diferencias significativas (P <>

Además, la inmunohistoquímica se utilizó para medir los niveles de proteína de LC3B y p62 en elriñóntejido en el presente estudio. Como se muestra en la figura 4, las células positivas se tiñeron de marrón y LC3B y p62 se expresaron principalmente en el citoplasma de las células epiteliales del túbulo renal. En comparación con el control, los valores de IOD de LC3B exhibieron un aumento significativo (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Níquelcloruro) los días 14 y 28. Además, los valores de IOD de p62 se redujeron significativamente (P< 0.05)in="" these="" three="" treatment="" groups="" on="" days="" 14="" and="" 28="" when="" in="" comparison="" with="" the="">

Figura 4. Resultados de inmunohistoquímica de LC3B y p62 en riñón de ratón.

(A) Las imágenes de inmunohistoquímica de LC3B. (barra de escala=50 µm) (B) Las imágenes de inmunohistoquímica de p62 (barra de escala=50 µm)

(C) La densidad óptica integrada (IOD) de LC3B. (D) La densidad óptica integrada (IOD) de p62.

Los valores se presentan con la media ± desviación estándar (n {{0}}). Las columnas marcadas con letras diferentes son diferencias significativas (P <>

Genes y proteínas relacionados conautofagiae involucrado en laautofagiase midió el flujo para verificar aún más los efectos de NiCl (Níquelcloruro) enautofagia. Estos incluyeron Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 y Atg3 (Li y Zhang, 2019; Nishimura y Tooze, 2020). Como se muestra en la Fig. 5A-C, en comparación con el control, los grupos de tratamiento de Ni (Níquel)muestran niveles significativamente más altos de proteínas de Beclinl, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 y Atg3 (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" additionally,="" the="" treatment="" groups="" of="" ni="" also="" exhibited="" significantly="" elevated="" mrna="" expressions="" of="" beclin1,="" atg5,="" atg12,="" atg16l1,="" atg7,="" and=""><0.05)on days="" 14="" and="" 28="" of="" the="" experiment="" (fig.6d-e)relative="" to="" the="">

Figura 5. NiCl2 (Níquelcloruro 2)aumenta los genes y las proteínas relacionados con la autofagia en el riñón de los ratones.

(A) Los resultados de Western blot de Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 y Atg3. (B&G) La cuantificación de la expresión de las proteínas Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 y Atg3.

(HM) La expresión de ARNm de Beclin1, Atg5, Atg12, Atg16L1, Atg7 y Atg3. Los valores se presentan con la media ± desviación estándar (n=8). Las columnas marcadas con letras diferentes son diferencias significativas (P <>

3.4.NiCl2 (Níquelcloruro 2)induce las vías PI3K/Akt/mTOR y AMPK en el riñón

mTOR es un regulador esencial deautofagia(Wang et al., 2017). Y las vías reguladoras aguas arriba bien establecidas de mTOR incluyen PI3K/Akt y AMPK (Gong et al..2020:Xu et al..2020). Por lo tanto, este estudio midió la proteína de las vías AMPK y PI3K/Akt.

Como Fg.6A y B muestran que los niveles de proteína de p-PI3K, p-AKT y p-mTOR tuvieron una disminución significativa (P< 0.05)in="" the="" three="" groups="" treated="" with=""> (Níquelcloruro 2)en los días 14 y 28 del experimento con respecto al control. Los grupos de tratamiento exhibieron niveles de proteína de p-AMPK y p-ULK1 significativamente más altos (P<0.05)than those="" of="" the="" control="" on="" days="" 14="" and="" 28.="" it="" can="" be="" seen="" from="" fig.6="" chat,="" compared="" to="" the="" control.="" the=""> (Níquelcloruro 2)Se encontró que los grupos de tratamiento tenían una disminución significativa en las expresiones de ARNm de PI3K, AKT y mTOR (P<0.05)on days="" 14="" and="" 28.="" ampk="" and="" ulk1="" of="" the="" treatment="" groups="" showed="" significant="" increases="" in="" mrna="">< 0.05)on="" days="" 14="" and="" 28="" in="" comparison="" with="" the="" control.="">Estos resultados revelan queautofagiainducida por NiCl2 (Níquelcloruro 2)en riñón de ratón involucradas las vías AMPK y PI3K/Akt/mTOR.

Figura 6. NiCl2 (Níquelcloruro 2)induce las vías de señalización PI3K/Akt/mTOR y AMPK en los riñones de ratones.

(A) Los resultados de Western blot de p-PI3K, PI3K, p-AKT, AKT, p-AMPK, AMPK, p-mTOR, mTOR, p-ULK1 y ULK1.

(BF) La cuantificación de la expresión de la proteína p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, p-AMPK/AMPK, p-mTOR/mTOR y p-ULK1/ULK1. (G K)

La expresión de ARNm de PI3K, AKT, AMPK, mTOR y ULK1. Los valores se presentan con la media ± desviación estándar (n=8). Las columnas marcadas con letras diferentes son diferencias significativas (P <>

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