Producción de lipasa por Yarrowia lipolytica en fermentación en estado sólido utilizando subproductos de frutas amazónicas y harina de soja como sustrato Parte 1

Abstracto: La producción de ácidos grasos poliinsaturados a partir del aceite de pescado, que se relaciona con diversos beneficios para la salud, incluidos los efectos contra las enfermedades cardiovasculares, los efectos antihipertensivos, anticancerígenos, antioxidantes, antidepresivos, antienvejecimiento y antiartríticos, entre otros, se puede realizar ventajosamente a través de la aplicación de lipasa. Sin embargo, el alto costo asociado con la producción de enzimas puede hacer que el proceso sea inviable y, por lo tanto, se deben investigar sustratos alternativos para resolver estos problemas. Esta investigación tuvo como objetivo producir lipasa por Yarrowia lipolytica IMUFRJ50682 en fermentación en estado sólido utilizando subproductos de la industria de procesamiento de alimentos (torta de aceite de andiroba y harina de soja) y verificar la aplicación potencial en la hidrólisis inicial de aceite de pescado. para producir más ácidos grasos poliinsaturados en un proceso adecuado. Se realizó un tamizaje para el análisis de combinaciones de torta de andiroba y harina de soya en diferentes proporciones (0:1{{20}}0 a 100:0, respectivamente) a las 48 h del proceso de fermentación. Posteriormente, la matriz sólida compuesta por harina de soja y torta de aceite de andiroba se complementó con aceite de soja y Tween 80 para mejorar la actividad de la lipasa. El extracto enzimático se caracterizó por el perfil proteico por electroforesis. Finalmente, el extracto enzimático y el biocatalizador sólido producido se aplicaron para evaluar el potencial de hidrólisis del aceite de pescado en un estudio inicial. La actividad lipolítica máxima (63,7 U·g −1 ) se logró usando torta de andiroba y harina de soya (50:50) después de 24 h de fermentación. El aceite de soja al 1,5 por ciento y Tween 80 (0,001 por ciento) en una emulsión proporcionaron un aumento de 15-veces (82,52 U·g-1) en la actividad enzimática. El análisis electroforético demostró una banda entre 37 y 40 kDa que puede estar relacionada con la lipasa y una banda de 75 kDa referente a la subunidad de la -conglicinina presente en la harina de soya. Después de 48 h, el biocatalizador sólido mostró un mayor grado de hidrólisis (DH) (71,0 por ciento) que el extracto enzimático (61,5 por ciento). El biocatalizador sólido fue estable durante el almacenamiento a temperatura ambiente durante 7 meses. La producción de lipasas utilizando subproductos de frutas amazónicas y harina de soja en fermentación en estado sólido es viable, así como la aplicación del extracto y biocatalizador sólido en la aplicación inicial para la hidrólisis de aceite de pescado para producir ácidos grasos poliinsaturados de forma industrial. proceso adecuado.

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Palabras clave: Carapa guianensis Aublet; producción de lipasa; fermentación en estado sólido; sostenibilidad; Yarrowia lipolytica

1. Introducción

Las frutas amazónicas tienen un alto potencial biotecnológico para la investigación y aplicación en diversos sectores de la economía, como la industria farmacéutica y de alimentos, debido a la presencia de macro y micronutrientes que incluyen proteínas, carbohidratos, fibras, carotenoides, ácidos grasos poliinsaturados y vitaminas, entre otros. [1].

La andiroba (Carapa guianensis Aublet) es una planta amazónica que produce frutos oleaginosos con potencial comercial para la extracción de aceite con propiedades medicinales como efecto analgésico, antiedematogénico y antiinflamatorio [2,3]. Además, presenta propiedades tecnológicas interesantes para la industria cosmética por ser rico en compuestos emolientes, siendo suministrado como insumo para las industrias cosméticas de todo el mundo [4]. El fruto de la andiroba es una cápsula que pesa entre 90 y 540 g y está compuesta por 1 a 16 semillas marrones, con un peso entre 1 y 70 g. Para obtener el aceite, las semillas se parten en pequeños pedazos y se secan en hornos hasta alcanzar un 8 por ciento de humedad. Luego, se comprimen en prensas tipo expeller metálicas [5], produciendo el aceite de andiroba que presenta gran interés industrial y alto valor comercial ya que este producto puede superar los 50 dólares el litro, dependiendo de sus características [6].

La producción anual de andiroba es de unas 122,16 toneladas [7] y la producción de aceite no supera el 30 por ciento del peso del fruto [8]. Estas cifras significan que anualmente se generan aproximadamente 36.648 toneladas de aceite y 85.512 toneladas de torta. El subproducto obtenido tras la exploración de estos frutos aún puede contener lípidos (20 por ciento), cenizas (4,2 por ciento), proteínas (7,3 por ciento) y carbohidratos (17 por ciento), y por esta composición, su uso en procesos biotecnológicos es interesante [9]. Una forma de aplicar estos subproductos es a través de la fermentación en estado sólido (SSF) para producir compuestos de alto valor agregado como las enzimas.

La fermentación en estado sólido se lleva a cabo utilizando una matriz sólida en ausencia de agua libre, pero el sólido debe tener suficiente humedad para el crecimiento microbiano [10]. Se ha informado que el uso de SSF produce compuestos aromáticos [11], antibióticos [12], ácidos orgánicos [13], biopesticidas [14], biosurfactantes [15], enzimas [16] y otros compuestos. La producción de enzimas en SSF requiere el uso de microorganismos como hongos y bacterias que crecen en condiciones comúnmente utilizadas en SSF. Entre los microorganismos utilizados biotecnológicamente destacan las levaduras, especialmente Yarrowia lipolytica, por su potencial para producir lipasas [10].

Yarrowia lipolytica es una levadura no convencional que tiene una temperatura máxima de crecimiento de 32-34 ◦C y es incapaz de sobrevivir en condiciones anaeróbicas. Y. lipolytica está clasificada como generalmente reconocida como segura (GRAS) por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y esto permite su uso seguro en procesos/productos alimentarios y farmacéuticos [9]. Se reconoce que esta levadura produce lipasas intracelulares, extracelulares y asociadas a la pared celular. Yarrowia lipolytica puede producir lipasas utilizando una variedad de fuentes de carbono, incluidos aceites, ésteres metílicos y ácidos grasos [17]. Las características mencionadas hacen que Y. lipolytic sea versátil para aplicaciones biotecnológicas, especialmente en la producción de lipasas.

Las lipasas (triacilglicerol acil hidrolasas EC 3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrólisis de triglicéridos a ácidos grasos libres y glicerol en presencia de agua [18]. Las lipasas se pueden aplicar en muchos sectores, incluida la industria alimentaria, entre otros. Se ha informado el uso de lipasas en la hidrólisis de la maduración de la leche, la grasa y el queso, en la modificación de las grasas de la mantequilla, en la mejora del aroma de las bebidas y la panadería, en el aderezo de los alimentos y en el desarrollo del sabor de la carne y el pescado. [19]. Además, las lipasas ya se han aplicado a la hidrólisis del aceite a la concentración de ácidos grasos poliinsaturados que se pueden utilizar en la industria alimentaria como suplemento enriquecido [20].

Varios estudios han informado el uso de desechos y subproductos en la producción de lipasa, entre ellos cáscaras de soja, cáscaras de sandía, harina de semilla de algodón, harina de soja y torta de aceite de andiroba [9,21-26]. Sin embargo, la combinación de torta de andiroba y harina de soya en diferentes proporciones para la producción de lipasa por Yarrowia lipolytica aún no ha sido reportada. Esta investigación tuvo como objetivo producir lipasa de Yarrowia lipolytica mediante fermentación en estado sólido (SSF) utilizando subproductos de la industria de procesamiento de alimentos (torta de aceite de andiroba y harina de soja) para aplicar en la hidrólisis de aceite de pescado para producir ácidos grasos poliinsaturados.

2. Resultados y Discusión

La estrategia adoptada para producir lipasa por Yarrowia lipolytica en SSF utilizando la combinación de torta de andiroba y harina de soya en diferentes proporciones se basó de acuerdo al diagrama de flujo mostrado en la Figura 1.

2.1. Caracterización de subproductos agroindustriales

La composición físico-química de la torta de andiroba se muestra en la Tabla 1. La torta de andiroba presentó 13,7 por ciento de proteínas, 26,9 por ciento de extracto etéreo, 0,4 por ciento de carbohidratos y 45,6 por ciento de fibras insolubles. Por su parte, la harina de soya presentó 48.3 por ciento de proteínas, 2.4 por ciento de extracto etéreo, 14.0 por ciento de carbohidratos y 18.0 por ciento de fibras insolubles. Cada nutriente presente en la torta tiene un papel en el metabolismo microbiano. El contenido de nitrógeno es esencial para la síntesis de proteínas, nucleótidos y metabolitos secundarios para el crecimiento y metabolismo de los microorganismos, así como para la biosíntesis de enzimas [25]. El contenido de aceite residual (extracto etéreo) presente en la torta de andiroba actúa como fuente de carbono, participando en la formación de biomasa y la producción de energía para el desempeño de la función celular [26]. Adicionalmente, el aceite presente en la torta de andiroba es un sustrato hidrofóbico y puede actuar como inductor en la producción de lipasa, como lo reportan Brígida et al. [17]. Inicialmente, la lipasa unida a la célula del microorganismo hidroliza el lípido presente en el medio e inicia el crecimiento celular. A lo largo del proceso, la disponibilidad de sustratos disminuye, por lo que el organismo secreta lipasas extracelulares [27].

La ceniza cuantificada en torta de andiroba (4,5 por ciento) y harina de soya (6,3 por ciento) representa el contenido de varios minerales y puede ser utilizada en el metabolismo del microorganismo; sin embargo, algunos minerales como los iones de sodio y manganeso pueden inhibir el crecimiento de Yarrowia lipolytica [17] y, por lo tanto, es necesario evaluar adecuadamente los subproductos.

Los carbohidratos y el contenido de fibra en las materias primas se pueden utilizar en la nutrición microbiana de forma limitada, ya que Yarrowia lipolytica no produce amilasas ni celulasas y hemicelulasas [28,29], lo que dificulta la descomposición de estos polisacáridos y la liberación de compuestos ricos en carbono a utilizarse en el metabolismo de la levadura. Por lo tanto, se sugiere que el crecimiento de la levadura se debe principalmente a la presencia de sustratos hidrofóbicos en la torta.

Los valores de porosidad de la torta de andiroba y la harina de soya se muestran en la Tabla 1. De acuerdo con la Tabla 1, la porosidad de la torta de andiroba y la harina de soya fueron 0.425 y 0.412 m3 lecho de aire m−3, respectivamente. Los valores de porosidad más altos se asocian con una mejor transferencia de masa y calor durante la fermentación, lo que conduce a una mejor producción de enzimas. Además, la porosidad es un parámetro importante para comprender la humedad del medio: los valores altos de humedad pueden estar asociados con valores bajos de porosidad, y esto afecta la aireación del medio y, en consecuencia, la producción de lipasa [22].

2.2. Producción de lipasa por SSF

El uso de subproductos para la producción de lipasa por fermentación en estado sólido y la producción de biocatalizadores sólidos estables permite la aplicación de la enzima directamente en el medio de reacción, reduciendo los costos asociados con la extracción y purificación de la enzima para su posterior aplicación. Además, el uso de subproductos proporciona nutrientes para el crecimiento y desarrollo microbiano, actúa como soporte físico para el microorganismo y reduce los costos del medio de cultivo para el proceso. Además, la fermentación en estado sólido permite el aprovechamiento de residuos y subproductos agroindustriales, siendo una alternativa para reducir los problemas ambientales asociados a la disposición inadecuada de residuos [30].

Después de la caracterización, los subproductos se utilizaron como sustrato de matriz sólida en la producción de lipasa usando SSF, siendo monitoreadas las actividades lipolíticas y proteolíticas, la humedad y el pH durante el proceso de fermentación. La Figura 2 muestra los perfiles de las variables de respuesta medidas durante 48 h de fermentación utilizando Y. lipolytica y la combinación de torta de andiroba y harina de soja en diferentes proporciones como sustratos.

En cuanto al uso de los sustratos individualmente, se encontró la actividad lipolítica máxima de 4.36 U·g −1 para la harina de soya (0:100; Figura 2A) y 13.48 U·g −1 para torta de aceite de andiroba (100:0; Figura 2B), después de 12 y 24 h, respectivamente. Después de alcanzar el punto de mayor actividad de la lipasa, se observó una reducción de sus valores, lo que puede estar relacionado con el aumento de la actividad de la proteasa. Esta enzima tiene afinidad por las estructuras proteicas, y debido a esto, puede actuar para degradar la estructura de la lipasa, reduciendo su actividad [24,31,32].

La torta de andiroba y la harina de soya usadas en diferentes proporciones de (25:75), (50:50) y (75:25) produjeron los valores máximos de actividad de lipasa de 57.21 U·g −1 después de 12 h (Figura 2C), 63,70 U·g-1 (Figura 2D) y 40,13 U·g-1 (Figura 2E) después de 24 h de fermentación, respectivamente, lo que indica que la mezcla de las matrices puede mejorar la actividad de la lipasa. La mejora en la actividad enzimática después de una combinación de torta de andiroba y harina de soya puede explicarse observando las composiciones fisicoquímicas de ambas materias primas, como se muestra en la Tabla 1. La harina de soya tiene un alto contenido de proteína mientras que la torta de andiroba tiene un mayor contenido de aceite. . Así, la mezcla de torta de andiroba y harina de soja para la producción de lipasa demostró ser más interesante que usar cada una por separado, y esto favorece la no dependencia de un solo sustrato así como el uso de más de un subproducto.

El pH inicial de las matrices es ácido debido a la presencia de ácidos grasos libres presentes en la matriz oleaginosa, condición que favorece el crecimiento de Yarrowia lipolytica ya que esta levadura necesita un medio ligeramente ácido para un buen crecimiento [33], evitando un paso medio de tamponamiento. También hay un aumento gradual del pH a lo largo del proceso en las matrices que van desde 6,39 a 7,32 (Figura 2A), 5,69 a 6,82 (Figura 2C), 5,64 a 7,68 (Figura 2D) y 5,21 a 6,03 (Figura 2E). En la matriz que contenía solo torta de andiroba, se observó una disminución gradual del pH (4.8 a 4.26, Figura 2B) debido al contenido de aceite residual en el medio sólido, ya que el aceite es inicialmente hidrolizado por la lipasa, no siendo consumido por la levadura en las horas iniciales, manteniendo así un pH ligeramente ácido.

En cuanto al contenido de humedad, no se observaron variaciones a lo largo de la fermentación, demostrando que el sistema de incubación con humedad saturada y las matrices fue efectivo para retener la humedad. Un medio de fermentación capaz de mantener un contenido de humedad óptimo es esencial para la producción de lipasa por Yarrowia lipolytica [24] ya que este parámetro puede afectar la aireación del sistema. Además, se requiere el contenido de humedad ideal para proporcionar el agua necesaria para el metabolismo del microorganismo y para solubilizar los nutrientes. Cuando el contenido de humedad está por encima del ideal, puede ocurrir una mala difusión de oxígeno en el sistema, quedando fuera del rango ideal para el microorganismo [34].

Algunos estudios han informado el uso de subproductos como sustratos en la fermentación en estado sólido. Sin embargo, en estos estudios hay una incorporación de fuentes puras de carbono y/o nitrógeno como glucosa, extracto de levadura, peptona y urea [35–37] en cantidades que pueden aumentar los costos del proceso. La matriz ideal debe presentar unas características para la aplicación que incluyen actuar como soporte, aportando los nutrientes necesarios para el crecimiento del microorganismo, y la secreción del producto biotecnológico de interés. Encontrar todas estas características en un subproducto puede ser arduo, lo que dificulta encontrar un sistema adecuado para un proceso de fermentación; por lo tanto, la búsqueda de nuevas materias primas y su combinación debe ser continua [16].

Así, se eligió la proporción de 50:50 entre torta de andiroba y harina de soya para pruebas posteriores. La elección de esta condición está asociada a la valorización de residuos inexplorados de la región amazónica.

2.3. Suplementación de matriz de fermentación

En la segunda parte de este trabajo, se suplementó torta de andiroba y harina de soya en la proporción de 50:50 con 1.5 por ciento de aceite de soya, como se muestra en la Figura 3. La suplementación se realizó para verificar si la disponibilidad de una fuente de carbono más fácilmente asimilable (aceite de soja) mejoró la producción de lipasa sobre el contenido de aceite residual presente en la torta de andiroba. La máxima actividad de lipasa de 56,32 U·g-1 se obtuvo después de 28 h de fermentación y la actividad de proteasa varió de 2,71 a 7,60 U·g-1. El pH varió de 5.63 a 7.63 y la humedad se mantuvo sin mayores fluctuaciones durante todo el período (53 a 58 por ciento). Como se presentó anteriormente, la actividad lipolítica obtenida después de la suplementación fue menor que el valor encontrado sin la suplementación. La suplementación de matriz para la producción de lipasa fue estudiada por Farias et al. [38] y Souza et al. [24]. Los autores encontraron una actividad de lipasa de 139 U·g-1 y 93,9 U·g-1 utilizando lodos y aceite de soja, respectivamente. Sin embargo, cuando Souza et al. [24] realizaron la fermentación usando solo harina de soya (sin suplementación), los autores encontraron 9.4 ± 0.3 U·g −1 de actividad de lipasa después de 10 h de fermentación, demostrando que la suplementación aumentó la actividad de la lipasa en la matriz de fermentación estudiada.

Otro componente comúnmente informado para la suplementación media es Tween 80. Esto se informa constantemente en la literatura, ya que este componente puede aumentar la actividad de la lipasa cuando se usa en fermentación sumergida [39], pero no hay informes sobre el uso de Tween 80 en fermentación en estado sólido. Tween 80 puede aumentar la producción de lipasa extracelular durante el proceso de fermentación debido a la capacidad de emulsificación del sustrato y, por lo tanto, mejorar la accesibilidad del sustrato para el microorganismo y alterar la permeabilidad celular [40]. Por lo tanto, se realizó un estudio combinando aceite de soya 1.5 (por ciento p/v) y Tween 80 0.001 por ciento (p/v) en una emulsión para complementar el medio sólido de fermentación, como se muestra en la Figura 4.

Sobre la suplementación con Tween 80, se verificó que después de 14 h de fermentación, la actividad lipolítica fue de 57,6 U·g-1. El mismo valor se obtuvo anteriormente solo con la suplementación de aceite de soja a las 28 h de fermentación, lo que prolonga el proceso de fermentación y afecta la viabilidad. La actividad lipolítica máxima después de 20 h de fermentación fue de 82,52 U·g −1, un aumento de 1.46-veces sobre la producción de lipasa usando solo aceite de soja y una reducción de 8-h en el tiempo de proceso.

Los largos tiempos de fermentación aumentan el costo del proceso, por lo que es interesante la búsqueda de un microorganismo binomial ideal, un medio que produzca lipasa en menor tiempo (alta productividad) y que utilice subproductos como matrices. Varios estudios en la literatura han reportado la producción de lipasa vía SSF para lograr condiciones adecuadas y viabilizar la obtención de lipasas. Se observó el uso de diferentes materias primas como harina de soya, canola, cáscara de sandía y torta de aceite de palmiste, con actividades que oscilan entre 9 y 127 U·g −1[9,22,24].

Sales, Castro, Ribeiro, y Coelho [22] estudiaron la producción de lipasa por Y. lipolytica en fermentación en estado sólido usando harina de soya suplementada con cáscara de sandía (5 por ciento) obteniendo una mejora en la actividad de la lipasa en un 31 por ciento, valor correspondiente a 75.22 U ·g −1. Sousa et al. [41] produjeron lipasa a partir de Y. lipolytica mediante fermentación en estado sólido para su aplicación en la síntesis de ésteres comerciales con valor para la industria alimentaria, y los resultados mostraron que la mejor condición de fermentación para producir el biocatalizador fue utilizando harina de soja y aceite de soja ( 3 por ciento p/p). La enzima producida en estas condiciones permitió la conversión de hasta 92,9 para sintetizar los ésteres útiles de alto valor agregado aplicados en la industria alimentaria.

Además de las altas actividades enzimáticas obtenidas en el presente trabajo, podemos destacar las ventajas adicionales: (i) la posibilidad de utilizar subproductos con bajo aprovechamiento, con atractivo de sustentabilidad para la región amazónica; (ii) la posibilidad de una combinación de diferentes subproductos, lo que permite la complementación nutricional para el metabolismo microbiano; (iii) la reducción de la presión sobre componentes ya ampliamente utilizados en la industria de bioprocesos, como la harina de soja; (iv) valorización económica de las regiones productoras de subproductos; (v) ampliación de las opciones de sustratos para la producción de lipasas, y (vi) reducción de los costes operativos, entre otras ventajas.

2.4. PAGINA SDS

El extracto enzimático crudo obtenido después de la fermentación utilizando una matriz compuesta por torta de andiroba y harina de soja (50:50) sin suplementación se analizó en SDS-PAGE. El análisis electroforético mostró las bandas de proteínas contenidas en el extracto enzimático, como se presenta en la Figura 5.

La calle 1 se refiere a marcadores proteicos estándar y la calle 2 es la muestra obtenida de la combinación de torta de andiroba y harina de soya en la mejor proporción estudiada (50:50). Es posible visualizar una banda alrededor de 37-40 kDa en el extracto enzimático crudo que puede estar relacionada con la lipasa y/o esterasa producida por Yarrowia lipolytica, como lo observaron Souza et al. [41], que también puede ser la principal lipasa extracelular de Y. lipolytica (Lip2), que se produjo ampliamente en todos nuestros estudios. Además, se informa que incluso para enzimas que están principalmente asociadas con la pared celular (Lip7 y Lip8) de Y. lipolytica, se ha observado la misma masa molecular (37–41 kDa) [42].

Además, según los resultados publicados previamente por nuestro grupo de investigación, las mismas bandas presentadas aquí estaban relacionadas con la actividad de esterasa y lipasa del zimograma revelado por el acetato de -naftilo como sustrato [41], lo que nos permitió correlacionarlas. Las bandas de 75 kDa se refieren a la subunidad de la -conglicinina presente en la harina de soja según lo encontrado por Sales et al. [22] y Cheng et al. [43] en la fermentación de harina de soja.

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