La hormona de crecimiento local no hipofisaria se induce con el envejecimiento y facilita el daño epitelial

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RESUMEN

Los factores microambientales que modulan el daño DINA relacionado con la edad no están claros. La hormona del crecimiento no hipofisaria (np) se induce en el colon humano, las células del colon humano no transformadas y los fibroblastos, y en organoides intestinales 3-dimensionales con daño en el ADN asociado con la edad. La npGH autocrina/paracrina suprime p53 y atenúa la respuesta al daño del ADN (DDR) mediante la inducción de TRIM29 y la reducción de la fosforilación de ATM, lo que reduce la reparación del ADN y la acumulación de daños en el ADN. Los organoides cultivados hasta 4 meses exhiben marcadores de envejecimiento, p16 y SA- -galactosidasa y longitud de telómero reducida, así como acumulación de daño en el ADN, con aumento de npGH, supresión de p53 y DDR atenuada. La supresión de GH en organoides envejecidos aumenta p53 y disminuye el daño del ADN. Los ratones WT exhiben una acumulación de daño en el ADN del colon dependiente de la edad, mientras que en ratones de edad avanzada sin señalización de GH en el colon, el daño en el ADN permanece bajo, con p53 elevada. Dado que la inducción de npGH asociada con la edad permite un microambiente pro-proliferativo, la anulación de la señalización de npGH podría ser un objetivo como terapia antienvejecimiento al impedir el daño del ADN y las patologías relacionadas con la edad.

INTRODUCCIÓN

Las funciones biológicas disminuyen con el envejecimiento concomitantemente con un aumento de las enfermedades relacionadas con la edad.flavonoidesLas patologías relacionadas con la edad son impulsadas por daños acumulados en el ADN y deficiencias en la reparación del ADN que causan mutaciones y aberraciones cromosómicas asociadas con la edad. El daño persistente del ADN también puede bloquear la proliferación celular, lo que resulta en senescencia y apoptosis, lo que impulsa aún más el proceso de envejecimiento (Ou y Schumacher, 2018). El daño del ADN se acumula con la edad en células murinas y humanas no transformadas de tipo salvaje (WT), como lo demuestra el aumento de la variante de histona 2A fosforilada (yH2AX), un marcador de roturas de ADN de doble cadena (DSB) (Sedelnikova et al., 2004) y daños en el ADN no reparados (Dolle et al., 1997; Hasty et al., 2003; Lombard et al., 2005; Petr et al., 2020). La inestabilidad genómica resultante de la reparación defectuosa del daño del ADN puede favorecer la transformación celular (Negrini et al., 2010). El daño del ADN desencadena la fosforilación de genes mutados por ataxia-telangiectasia (ATM), responsables de la reparación de rupturas de ADN monocatenario y DSB. ATM fosforila y estabiliza el supresor de tumores p53, asegurando así la reparación del daño del ADN al facilitar varias vías de reparación del ADN. Por lo tanto, ATM juega un papel clave en la activación tanto de la respuesta al daño del ADN (DDR) como de la reparación del ADN (Ou y Schumacher, 2018).

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La expresión y la actividad de ATM se deterioran con la edad (Feng et al..2007; Gutierrez-Martinez et al.,2018), lo que probablemente da como resultado una pérdida de p53 funcional relacionada con la edad y conduce a daños en el ADN acumulados e inestabilidad cromosómica (Simon et al.,2009) Las respuestas de .p53 a factores estresantes como la radiación son menores en ratones mayores (Feng et al., 2007) y en fibroblastos dérmicos humanos derivados de individuos mayores (Goukassian et al., 2000). Por lo tanto, las características del envejecimiento incluyen la disminución de la actividad de DDR y la supresión de p53 con daño acumulado en el ADN no reparado, todo lo cual permite un entorno favorable para la proliferación epitelial (Lopez-Otin et al., 2013).

A medida que la secreción de la hormona del crecimiento hipofisaria (GH) disminuye con la edad, la señalización alterada de la GH se ha implicado en el proceso de envejecimiento (Ho y Hoffman, 1993). , y modelos de enfermedades humanas (Brown-Borg et al., 1996; Junnila et al., 2013), los beneficios de la deficiencia de GH provienen principalmente de observaciones que favorecen factores secundarios que prolongan la vida útil, incluida una mayor sensibilidad a la insulina, disminución de la oxidación de proteínas hepáticas , disminución de la incidencia de cáncer y disminución de la inflamación asociada con la edad (Aguiar-Oliveira y Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016). Hijos de familias del estudio de Leiden con longevidad familiar y menor mortalidad que los controles emparejados ambientalmente tienen niveles de GH circulantes integrados más bajos (van der Spoeletal., 2016), mientras que GHexcess disminuye la vida útil como se ve en pacientes con acromegalia (Chesno-kova et al., 2019a; Melmed, 2020; Waters y Barclay, 200 7) y en modelos murinos transgénicos que sobreexpresan GH (Bartke, 2003).usos de hesperidinaAlgunos han sugerido una correlación negativa entre la estatura y la longevidad en humanos (He et al., 2014; Samaras and Storms, 1992) y en perros (Greer et al., 2007). Presumimos que los efectos adversos de la GH sobre el envejecimiento pueden, al menos, en parte, atribuirse al daño acumulado en el ADN (Ches-nokova y Melmed, 2020). En apoyo de esta premisa, los linfocitos derivados de pacientes con acromegalia exhiben daño en el ADN con un aumento de las aberraciones cromosómicas (Bayram et al., 2014), mientras que el daño en el ADN no reparado se acumula en el hígado de un modelo de acromegalia de pez cebra (Elbialy et al., 2018). Los niveles altos de GH circulante atenúan la reparación del ADN del colon murino, lo que desencadena la acumulación de daño en el ADN, mientras que el daño del ADN se atenúa después de bloquear el receptor de GH (GHR) en células de colon humano y en ratones con señalización de GHR anulada (Chesnokova et al., 2019a).

La GH no pituitaria (np) sintetizada localmente en los tejidos periféricos es idéntica a la GH1 endocrina producida por la pituitaria y actúa a través de mecanismos autocrinos/paracrinos a través de la GHR ampliamente expresada (Ballesteros et al., 2000) que reconoce tanto la GH pituitaria como los ligandos npGH ( Waters y Barclay, 2007; Waters et al, 2006).imperio perdido cistancheComo la activación de DDR induce npGH (Chesnokova et al., 2013), planteamos la hipótesis de que el daño del ADN del colon acumulado asociado con la edad induce la expresión de npGH, lo que, a su vez, limitaría aún más la reparación del daño del ADN.

Cistanche puede antienvejecimiento

Usando modelos humanos in vitro y ex vivo que reflejan el envejecimiento, mostramos aquí que se induce npGH y se acumula daño en el ADN en tejidos humanos envejecidos, como lo demuestra el aumento de la fosforilación de H2AX (yH2AX). Además, el daño en el ADN del colon aumenta significativamente en ratones WT de edad avanzada, mientras que el daño en el ADN epitelial permanece bajo en ratones GHR--de la misma edad sin señalización de GH y en ratones knockout para GHR específicos del colon (GHRcolKO).

También se indujo npGH local en organoides intratestinales 3-dimensionales (3D) envejecidos generados a partir de células madre pluripotentes humanas inducidas (iPSC) (Barrett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). El organoide npGH, a su vez, suprimió p53 y atenuó la reparación del daño en el ADN.fracción de flavonoides purificada micronizada 1000 mg usosLos efectos de la npGH fueron probablemente paracrinos, ya que el cultivo conjunto de fibroblastos que expresan GH con dispositivos de microfluidos Colon Intestine-Chip integrados con trineo colonoide humano suprimió p53/p21 y mejoró el daño del ADN. Por el contrario, la supresión de GH en organoides envejecidos previno el daño del ADN.

Por lo tanto, mostramos que la npGH epitelial se induce fuertemente durante el envejecimiento y que la npGH reduce la reparación del ADN y facilita la acumulación de daños en el ADN asociados con la edad. En general, los resultados sugieren que la npGH epitelial local del colon desencadena un cambio en el campo de la mucosa, creando un entorno de inestabilidad cromosómica que es favorable para el desarrollo neoplásico en el tejido envejecido.

Es importante destacar que, aunque existe un uso inapropiado generalizado de la GH como hormona "antienvejecimiento" a pesar de la falta de un impacto convincente en el proceso de envejecimiento (Blackman et al., 2002; Clemmons et al., 2014; Lieut al., 2007; Melmed, 2019), nuestros resultados muestran que la señalización local de GH contribuye al microambiente tisular, favoreciendo el desarrollo de patologías relacionadas con la edad. Por lo tanto, la supresión de la señalización local de npGH para restringir el daño adverso del ADN epitelial puede ofrecer un objetivo terapéutico de envejecimiento anovulatorio. Los resultados de estos estudios informan un enfoque innovador para la extensión de la vida útil (es decir, la supresión en lugar de la inducción de la señalización local de GH). RESULTADOS

El daño del ADN del colon humano y la npGH se acumulan con el envejecimiento

El daño del ADN asociado con la edad se evaluó en muestras de tejido de parafina de colon humano no tumoral derivadas de cohortes de pacientes que abarcaban 3 grupos de edad: jóvenes (18-39 años), de mediana edad (40-60 años) y ancianos ( {{6 años). Cuando se calificó para yH2AX, 3 de 11 muestras (27 por ciento) en la cohorte joven exhibieron daño en el ADN, 8 de 16 (50 por ciento) exhibieron daño en el ADN en la mediana edad y 8 de 18 (45 por ciento) muestras envejecidas exhibieron daño en el ADN (Figuras 1A-1C y 1J).

Como mostramos anteriormente que el daño en el ADN induce npGH (Chesnokova et al, 2013), buscamos determinar si la acumulación de daño en el ADN dependiente de la edad estaba asociada con la expresión de GH en tejido de colon no tumoral. Como no se expresa en células de colon neuroendocrino (Chesnokova et al, 2016), excluimos estas células del análisis.

La expresión de GH epitelial se detectó en el 16 por ciento -17 por ciento de las muestras de colon normal derivadas de cohortes de mediana edad y ancianas (38 y 42 muestras, respectivamente), pero solo en el 2 por ciento de la cohorte joven (37 muestras), mientras que el La puntuación de expresión de GH aumentó en la cohorte de mediana edad y aumentó aún más en las muestras de la cohorte de edad avanzada (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">oteflavonoideEn resumen, estos resultados apuntan a la acumulación de daños en el ADN sin inducción en el colon envejecido.

La activación de DDR induce npGHin local en colon murino y humano

A continuación, consideramos si la DDR activada desencadena la expresión local de npGH en el colon y tratamos a los ratones con nutlin3 para estabilizar la p53 (Vassilev et al, 2004) y observamos la inducción de la p53 en el colon y más (Figura 2A). Además, en muestras de adenocarcinoma de colon derivadas de los mismos pacientes antes y después de las terapias que dañan el ADN (Tabla S1), observamos una modesta expresión de npGH epitelial inicial previa al tratamiento y una mayor expresión de npGH después de la terapia en las 6 muestras de pacientes estudiadas (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR activa la expresión de GH in vitro

Utilizamos el etopósido, inhibidor de la topoisomerasa II, para producir roturas de ADN monocatenario y DSB (Walles et al, 1996) y para determinar si DDR activa la GH in vitro. La npGH inducida por daños en el ADN en células de adenocarcinoma de colon humano NCC, hNCF y HCT116 (Figuras 3A y S1A-S1C); en organo-ids, GH y ARNm de GH inducidos por etopósido (Figuras 3B y S1D), mientras que los niveles de ARNm de IGF1 y prolactina no cambiaron (Figura S1E). La fosforilación de STAT5, una señal de GH corriente abajo (Waters, 2016), se indujo en todos los tipos de células (Figuras 3A-3C y S1A-S1C). Por el contrario, la anulación de npGH con ARN pequeño de interferencia (ARNip) de GH evitó que el etopósido indujera pSTAT5 (Figuras 3C y S1F), proporcionando evidencia de que la npGH de colon inducida por daños en el ADN es funcionalmente activa. Las imágenes de NCC tratadas con etopósido durante 24 h mostraron coexpresión de GH e yH2AX en múltiples células (Figura 3D).

Las células epiteliales que sufren daños en el ADN secretan GH Para determinar si la npGH intracelular inducida ejerce efectos autocrinos/paracrinos, evaluamos los niveles de GH secretados en NCC y medio de cultivo organoide después del tratamiento con etopósido. El medio recolectado de ANCC a las 8 y 24 h después del tratamiento y de los organoides a las 4-48 h después del tratamiento mostró aumentos de GH dependientes del tiempo después de la activación de DDR (Figura 3E). Debido a que el NCC y los organoides expresan receptores de GH al igual que el tejido del colon humano (Chesnokova et al., 2016), estos resultados sugieren que la GH local inducida en respuesta al daño del ADN puede someter el tejido envejecido a acciones autocrinas/paracrinas.

La GH autocrina/paracrina suprime la p53 de las células del colon humano

Como la GH endocrina suprime la p53 del colon murino (Chesnokova et al, 2016), determinamos si la GH local ejerce efectos au-autocrinos/paracrinos similares en las células del colon epitelial humano. El análisis de dos líneas separadas de NCC derivadas de dos pacientes diferentes después de la nucleofección con hGH o infección con GH que expresa lentivirus (lenti-GH) (Figuras 4A, 4B y S2), así como organoides que expresan hGH de manera estable (Figura 4C) mostró supresión p53 y sobreexpresión concomitante. Las células derivadas de órganos infectados con lenti-GH o vector vacío (lenti-V) pulsados ​​con bromodesoxiuridina (BrdU) mostraron una supresión de p53 seguida de una incorporación modesta pero significativamente mayor de BrdU evaluada por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Figura S3A). Por el contrario, la supresión de GH con lentivirus que expresan GH de horquilla pequeña (GH) condujo a una disminución de la formación de colonias y del tamaño de colonias en NCC (Figuras S3B y S3C), lo que indica acciones de npGH a favor de la literatura.

Efectos de GH paracrina en Colon Intestine-Chip humano Para evaluar los efectos paracrinos de npGH en las células epiteliales de la mucosa intestinal, cocultivamos UNCF infectado con lenti-GH y Colon Intestine-Chip dispositivos de microfluidos (Kasendra et al, 2020) sembrados con colón sano células epiteliales derivadas de organoides durante 8 días. La secreción local de GH de hNCF en el medio se confirmó mediante ELISA (338 ng/mL/1 × 10 células de grado). Se añadió 5-etinilo-2'-desoxiuridina （EdU） （20 μM） el día 7 , los chips se fijaron 24 h más tarde y se tiñeron para EdU y H2AX, y EdU más núcleos se contaron en células epiteliales. Un conjunto separado de fichas sembradas

con células epiteliales se utilizó para evaluar p53/p21 mediante transferencia Western. La proliferación de células epiteliales de chip aumentó (p<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

La GH autocrina/paracrina suprime DDR

La activación de ATM tras el daño del ADN fosforila H2AX, que marca los sitios de ADN dañados para activar DDR y promover la reparación (Turinetto y Giachino, 2015). ATM también fosforila p53, mejorando aún más la reparación del ADN (Blackford y Jackson 2017). En hNCC, así como en organoides infectados con pIRES2-ZsGreen1hGH o con lenteja-GH, la sobreexpresión de GH suprimió la fosforilación de ATM y ADN-proteína quinasa (PK)cs, ambos involucrados en la reparación del ADN (Blackford y Jackson. 2017), y disminución de la fosforilación de una proteína diana p53 (Figuras 5A-5C).

La histona acetilasa Tip60 activa ATM (Jackson y Bartek, 2009) y está regulada negativamente por TRIM29 (Sho et al., 2011; Sun et al, 2005). Observamos que la sobreexpresión de GH en NCC y en organoides también resultó en la inducción de TRIM29, que a su vez suprimió Tip60 (Figuras 5A-5C). Se observaron resultados similares en la segunda línea de NCC 48 h después de la nucleofección con un plásmido que expresa GH y 6 días después de la infección con lenti-GH (Figuras S4A y S4B).

La GH autocrina/paracrina atenúa la reparación del ADN

A continuación, medimos los efectos en los mecanismos de reparación de DSB, específicamente la unión de extremos no homólogos propensos a errores (NHEJ) (Jackson y Bartek, 2009) y la recombinación homóloga a prueba de errores (HR) (Beucher et al., 2009) ; Blackford y Jackson, 2017; Chapman et al., 2012). Nuclefectamos NCC que expresaba de forma estable NHEJ y cassettes de indicadores HR con pcDNA3.1-plásmidos GH1 (hGH1) humanos, inducimos DSB mediante la cotransfección con un plásmido que codifica la endonucleasa I-Excel y medimos la reincorporación de los indicadores de reparación de DSB. La eficacia de la transfección se controló cotransfectando con el plásmido que codifica DsRed (Seluanov et al, 2010). La eficiencia de NHEJ después de la nucleofección de pcDNA3.1-hGH1 fue de 0,77-0,83 y se redujo a las 48 h (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

La GH autocrina/paracrina aumenta el daño del ADN no reparado

Al examinar si npGH aumenta el daño en el ADN, observamos que NCC y los organoides transfectados de manera estable con lenti-GH mostraron un aumento del daño en el ADN endógeno no reparado medido por el ensayo Comet (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

La GH se induce en organoides intestinales humanos 3D envejecidos y atenúa DDR

Tras el aumento observado de la expresión de GH y el daño del ADN en especímenes de colon humano envejecidos, "envejecimos" organoides generados a partir de tres líneas iPSC independientes para recapitular un modelo de tejido humano envejecido. Estos organoides están compuestos por enterocitos, células caliciformes, células de Paneth y células enteroendocrinas y expresan homeobox 2 de tipo caudal (CDX2) (Barrett et al., 2014; Gao et al., 2009; Workman et al., 2017). Dos de las tres líneas de iPSC (líneas 1 y 3) se obtuvieron de personas mayores de 60 años, y la tercera línea de iPSC (línea 2) se derivó de fibroblastos de un individuo de 30-años. Los organoides generados a partir de las líneas 1 y 3 se cultivaron durante un máximo de 2 meses, momento en el que la proliferación celular disminuyó significativamente. Por el contrario, los organoides generados a partir de la línea 2 proliferaron con fuerza en cultivo durante un máximo de 4 meses. El envejecimiento celular se confirmó en las 3 líneas por el aumento de p16, así como por la disminución de la longitud de los telómeros (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

Como estas características de organoides in vitro parecen recapitular fielmente los cambios celulares consistentes con el envejecimiento del tejido humano (Baker et al.,2011;Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013), utilizamos este modelo para estudiar más a fondo los mecanismos de señalización que subyacen al envejecimiento epitelial del colon humano. En la línea 1, los niveles de ARNm de GH se indujeron después de 1 mes en cultivo y aumentaron aún más después de 2 meses (p < 0,05)="" (figura="" 6c),="" lo="" que="" es="" consistente="" con="" un="" aumento="" significativo="" de="" npgh="" observado="" en="" organoides="" envejecidos="" tanto="" en="" western="" blot="" como="" en="" inmunohistoquímica="" (ihc)="" (figuras="" 6d,="" 6e="" y="" s5b).="" yh2ax="" también="" se="" indujo="" fuertemente="" con="" un="" cultivo="" prolongado,="" lo="" que="" indica="" un="" daño="" en="" el="" adn="" endógeno="" acumulado="" con="" el="" envejecimiento="" in="" vitro.="" de="" acuerdo="" con="" los="" resultados="" que="" muestran="" p53="" suprimida="" en="" ncc="" y="" organoides="" transfectados="" con="" gh="" (figuras="" 4a-4c),="" observamos="" p53="" suprimida="" a="" 1="" y="" 2="" meses="" de="" cultivo,="" en="" concordancia="" con="" un="" aumento="" de="" npgh="" (figuras="" 6e="" y="" s5b).="" resultados="" similares="" (="" a="" y="" b)="" western="" blot="" de="" (a)="" células="" ancc,="" hncf="" y="" hct116="" y="" (b)="" organoides.="" las="" células="" se="" trataron="" con="" las="" dosis="" indicadas="" de="" etopósido="" y="" se="" analizaron="" 24="" h="" después.="" los="" organoides="" se="" trataron="" con="" etopósido="" 3="" um="">

(C) NCC nucleofectado con GH siRNA (siGH RNA) o scramble RNA (Scr RNA) como control durante 24 h se trató con las dosis indicadas de etopósido (Etop) y se analizó 24 h después. La cuantificación de ImageJ de transferencias occidentales se muestra en la Figura S1.

(D) Imagen representativa de NCC tratada con etopósido 20 μM durante 24 h. GH, rojo; yH2AX, verde; faloidina, gris; DAPI, azul. Un núcleo verde brillante indica apoptosis. Barra de escala, 20 um. Control, células no tratadas.

(E) Western blot de GH en medio de cultivo de ANCC y organoides tratados con etopósido 20 o 5 uM, respectivamente. El medio se recogió del calor 8 y 24 hy de los organoides a las 4-48 h después del tratamiento. Ponceau se utilizó como control de carga. Se muestran transferencias representativas de al menos 3 experimentos independientes.

se obtuvieron mediante el cultivo de organoides generados a partir de las líneas iPSC 2 y 3 durante 4 y 2 meses, respectivamente (Figuras S6A-S6D).

Además, el aumento de npGH en organoides envejecidos se asoció con DDR atenuada, con fosforilación suprimida de ATM y DNA-PKcs y niveles más bajos de p53 fosforilada (Figuras 6E y S5B). Estos resultados sugieren que la actividad DDR suprimida conduce a un daño de ADN no reparado acumulado, como también lo demuestra la inducción de yH2AX (Figuras 6E y S5B). Después de 2 meses en cultivo, los organoides envejecidos infectados con shRNA de GH mostraron un aumento de p53 (Figuras 6F y S7A) y una disminución del daño en el ADN medido por el ensayo Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

La deficiencia de señalización de GH atenúa el daño del ADN del colon in vivo en ratones envejecidos

Para confirmar nuestros resultados obtenidos en organoides envejecidos, estudiamos ratones WT y GHR-7 envejecidos in vivo. El daño del ADN del colon aumentó significativamente en ratones WT viejos (24-meses) versus jóvenes (3-meses) (p<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

DISCUSIÓN

Mostramos aquí que npGH aumenta con la edad en el tejido del colon humano y en organoides intestinales humanos 3D. Demostramos varias líneas de evidencia que sugieren que en tejido de colon humano envejecido, la npGH es inducida por daño en el ADN, como se observa en modelos humanos, incluidas células epiteliales no tumorales, fibroblastos de colon normales, organoides y tejido de cáncer de colon de pacientes sometidos a terapias que dañan el ADN. ; también mostramos hallazgos similares in vivo en el colon de ratones con DDR activado.

Usando organoides intestinales humanos en 3D, observamos un aumento de p16, senescencia y acortamiento de los telómeros, todos consistentes con los cambios asociados con la edad en el tejido humano (Baker et al., 2011; Liu et al., 2019; Lopez-Otin et al., 2013 ). A pesar de las limitaciones del modelo de organoides, nuestros resultados respaldan a los organoides intestinales como una recapitulación humana fiel para estudiar los mecanismos de señalización que subyacen a los cambios de colon asociados con la edad (Hu et al., 2018).

Encontramos que la npGH local, actuando de forma autocrina/paracrina, suprime p53 y aumenta la proliferación de células vecinas. La GH inducida también suprime la DDR y la reparación del ADN, mejorando aún más la acumulación de daños en el ADN. Los resultados también son consistentes con los efectos observados sobre la acumulación de daños en el ADN dentro de los tumores pituitarios humanos secretores de GH (Ben-Shlomo et al., 2020).

Las acciones de la GH en el tejido normal del colon favorecen el desarrollo de un entorno pro-proliferativo que puede ser la base del aumento de las tasas de pólipos en el colon relacionado con la edad, ejemplificado por el daño del ADN asociado con la edad y la inestabilidad cromosómica como impulsores de la prevalencia del cáncer de colon en pacientes mayores de 50 años (Aunan et al.,2017). El aumento del daño en el ADN relacionado con la edad que mostramos aquí también es consistente con los informes de que yH2AX aumenta linealmente con la edad en muestras de colon normales (Risques et al., 2008). Nuestra marcada regulación positiva observada de yH2AX en organoides envejecidos es indicativa de acumulación de daño en el ADN, ya que yH2AX marca los sitios de daño en el ADN para atraer proteínas de reparación del ADN (Turinetto y Giachino, 2015). Estos resultados pueden ser aparentemente inconsistentes con el hecho de que la GH inducida en células envejecidas suprime la fosforilación de H2AX. Sin embargo, interpretamos estas observaciones para mostrar que la GH disminuye la actividad de DDR al disminuir la fosforilación de ATM, lo que, a su vez, disminuye (pero no elimina por completo) la fosforilación de proteínas aguas abajo, incluida H2AX. Cuando DDR no se activa adecuadamente, la reparación del ADN se altera, pero el yH2AX aún se acumula, ya que marca los sitios dañados del ADN no reparados. Por lo tanto, los niveles de yH2AX observados en organoides y tejidos humanos envejecidos reflejan un resultado neto de la actividad DDR y la cantidad de ADN no reparado.

El daño del ADN puede acumularse en el tejido envejecido debido a la pérdida de la reparación por escisión de bases, probablemente por la pérdida de la respuesta de p53 al daño del ADN (Cabelof et al., 2006; Simon et al., 2009, 2012). En nuestros experimentos, p53 disminuyó en las células de colon y los organoides que expresan npGH, de acuerdo con hallazgos anteriores de GH que suprime p53 (Chesnokova et al., 2016). Por el contrario, los ratones GHR-/- envejecidos, que son resistentes al cáncer y tienen una vida útil más larga (Basu et al., 2018), así como los ratones GHRcolKO específicos de colon, muestran una mayor expresión de p53 de colon, lo que probablemente mejora la reparación del ADN. Como la GH suprime p53 (Chesnokova et al., 2013), la inducción de npGH puede provocar cambios en el microambiente local consistentes con la disminución de p53 asociada con la edad (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). El promotor de GH contiene un sitio de unión a p53 (Chesnokova et al., 2013), y el p53 inducido por daños en el ADN activa la expresión de GH (Chesnokova et al. 2013, 2019a). Por lo tanto, nuestros resultados muestran que en organoides envejecidos, la acumulación de daño en el ADN induce npGH, que, a su vez, regula a la baja p53.

Es importante destacar que, dado que la npGH se secreta localmente a partir de células dañadas en el ADN, podría ser operativa una acción paracrina para la GH secretada en las células vecinas. Mientras cocultivábamos hNCF que expresa GH con Colon Intestine-Chip, observamos un aumento del daño y la proliferación del ADN y una regulación negativa de p53/p21 en células epiteliales integradas en el chip expuestas a los efectos paracrinos de los fibroblastos derivados. Estos resultados sugieren que el envejecimiento local no inducido en el tejido humano altera el microambiente del tejido al suprimir las proteínas supresoras de tumores y mejorar la proliferación epitelial y el daño del ADN.

Los resultados son consistentes con las observaciones de que el tratamiento con GH exógena aumenta la capacidad proliferativa, la formación de colonias y las metástasis en ratones DJ-1 KO (Chien et al., 2016), y con la evidencia de que la inducción de GH en células tumorales humanas está asociada con la progresión de varios tipos de cáncer (Perry et al.,2017); estos se corresponden con nuestros resultados que muestran menos formaciones de colonias y un tamaño de colonia más pequeño con la supresión de GH.

Las vías de reparación de daños en el ADN protegen contra la inestabilidad cromosómica que impulsa la transformación celular (Negrini et al. 2010). Por ejemplo, Tip60 activa ATM (Jackson y Bartek, 2009) y ATM, un regulador central de DDR, fosforila y estabiliza p53. Las células envejecidas exhiben una reducción de la supresión de ATM y p53, así como una desregulación de la reparación del ADN con el subsiguiente daño del ADN no reparado (Lan et al., 2019). Por lo tanto, en las células del colon, el daño del ADN se acumula con la edad (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008), al menos en parte debido a la disminución de la eficiencia de DDR (Jackson y Bartek, 2009) y la supresión de p53 en la respuesta a la radiación y en ratones envejecidos se atribuyó a la disminución relacionada con la edad en p53-estabilizador de ATM (Feng et al, 2007). En nuestros experimentos, no inducido en respuesta al daño del ADN también suprimió Tip60, lo que probablemente a la disminución de la reparación del ADN como lo demuestra la atenuación de la fosforilación de ATM y p53, respectivamente. Estos resultados sugieren que la sobreexpresión local de npGH puede contribuir a la reparación de ADN y DDR desregulada relacionada con la edad. En organoides envejecidos, la inducción de GH atenuó DDR, mientras que la supresión de GH activó DDR, como lo demuestra la disminución del daño en el ADN. Estos resultados están respaldados por nuestras observaciones anteriores de que el bloqueo de la señalización de GH en ANCC condujo a una disminución del daño en el ADN (Chesnokova et al., 2019a). Además, mostramos que el daño del ADN del colon no se acumula en ratones GHRcolKO dirigidos al colon con GHR extirpado, pero sí se acumula en el intestino delgado, donde el GHR estaba intacto. Estos resultados, junto con nuestra demostración de que los ratones GHR-7-envejecidos no acumulan daño en el ADN del colon, respaldan in vivo la hipótesis de que la inducción local de npGH con células envejecidas puede hacer que las células sean susceptibles a la transformación y quizás también contribuyan a la resistencia a la terapia contra el cáncer, como se ha sugerido (Basu y Kopchick, 2019).

Los resultados que se muestran aquí también plantean la posibilidad de que los efectos de la GH puedan estar mediados por el factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF1). A diferencia de la GH, la señalización de IGF1 activa la reparación del ADN en células tumorales y no tumorales (Chesnokova y Melmed, 2020; Chitnis et al., 2014; Turney et al., 2012), y hemos demostrado que la supresión de p53 por parte de la GH y la inducción de ADN el daño ocurre independientemente del IGF1 en el tejido normal del colon (Ches-nokova et al., 2019a, 2019b). Sin embargo, en las células y tejidos en los que la GH activa el IGF1, este último factor de crecimiento también puede señalar de manera específica a la célula para contrarrestar la acción de la GH sobre la estabilidad del genoma.

Los hallazgos sugieren que la npGH inducida en el tejido del colon envejecido en respuesta al daño acumulado en el ADN facilita un mayor daño en el ADN y parece ser un determinante adverso de la reparación del daño en el ADN. La extrapolación de estos hallazgos proporciona una plataforma para varias aplicaciones clínicas potenciales. Dado que la acumulación de daños en el ADN es un sello distintivo de las enfermedades relacionadas con la edad, la señalización de la GH para bloquear los efectos autocrinos/paracrinos puede resultar útil para impedir el daño del ADN epitelial relacionado con la edad y, en última instancia, mejorar la progresión de las patologías epiteliales relacionadas con la edad (Miman et al. , 2016) Tal enfoque también puede beneficiar a los pacientes con cáncer que se someten a terapias que dañan el ADN, en quienes los cambios del campo epitelial generados por la acción autocrina/paracrina pueden dañar el tejido vecino normal. En este sentido, la interrupción de la señalización de GH con un antagonista de GHR aprobado (List et al., 2011; Trainer et al, 2000) puede conferir beneficios clínicos. Es importante destacar que la GH humana se ha promocionado de manera inapropiada como una terapia antienvejecimiento y de mejora de la fuerza no aprobada (Giordano et al., 2008; Holt y Ho, 2019; Medeiros y Siegel Watkins, 2018; Melmed, 2019). Dados los efectos paracrinos nocivos de la npGH que informamos aquí, la administración inadecuada de GH a largo plazo como elixir antienvejecimiento puede provocar la señalización de GHR y poner en riesgo el desarrollo de daño en el ADN de las células epiteliales, así como la posible activación de lesiones proliferativas ocultas.

Este artículo está extraído de Cell Reports 37, 110068, 14 de diciembre de 2021, ª 2021 The Author(s). 1 Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)