La pérdida de JAK1 impulsa la inmunodeficiencia innata

La vía de señalización Janus quinasa: transductores de señales y activadores de la transcripción (JAK-STAT) es fundamental para ajustar las respuestas inmunitarias y su desregulación está estrechamente asociada con el cáncer y los trastornos inmunitarios. La alteración de la vía de señalización de la interleucina (IL)-15/STAT5 debido a la pérdida de las cadenas del receptor IL-15, JAK3 o STAT5 conduce a deficiencias inmunitarias con anomalías de las células asesinas naturales (NK). JAK1, junto con JAK3, transmite señales aguas abajo de IL-15, pero aún no se ha dilucidado la contribución exacta de JAK1 a la biología de las células NK. Para estudiar las consecuencias de la deficiencia de JAK1 en células NK, generamos ratones con eliminación condicional de JAK1 en células NKp46+ (Jak1fl/flNcr1Cre). Aquí mostramos que la eliminación de JAK1 intrínseco de células NK redujo significativamente el número de células NK en la médula ósea y afectó su desarrollo. En línea, observamos una pérdida casi completa de células NK en el bazo, la sangre y el hígado, lo que demuestra el papel crucial de JAK1 en las células NK periféricas. En línea, los ratones Jak1fl/+Ncr1Cre mostraron una vigilancia tumoral mediada por células NK significativamente deteriorada. Nuestros datos sugieren que JAK2 no puede compensar la pérdida de JAK1 en las células NK. Es importante destacar que la eliminación condicional de JAK2 en las células NKp46+ no tuvo efecto en las células NK periféricas, lo que revela que la JAK2 intrínseca de las células NK es prescindible para la supervivencia de las células NK. En resumen, identificamos que la pérdida de JAK1 en las células NK impulsa la inmunodeficiencia innata, mientras que la deficiencia de JAK2 deja inalterados el número de células NK y la maduración. Por lo tanto, proponemos que, a diferencia de los inhibidores de JAK1/JAK2 utilizados actualmente, el uso de inhibidores específicos de JAK2-sería ventajoso para los pacientes al dejar las células NK intactas.

Palabras clave: JAK-STAT, células asesinas naturales, JAK1, JAK2, vigilancia tumoral

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INTRODUCCIÓN

Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos innatos que reconocen y matan células transformadas o infectadas por virus (1). La deficiencia de células NK es un subtipo raro pero cada vez más apreciado de inmunodeficiencia primaria (IDP). La deficiencia clásica de células NK se caracteriza por la ausencia de células NK en la sangre periférica y da como resultado una mayor susceptibilidad a las infecciones virales (2). La vía de señalización Janus quinasa (JAK), transductor de señal y activador de la transcripción (STAT), actúa en sentido descendente de múltiples citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, regulando así de manera crítica las respuestas inmunes (3, 4). Tras la unión de un ligando específico a su receptor afín, los cambios conformacionales conducen a la oligomerización del receptor y la activación de las JAK asociadas al receptor. Las JAK se autofosforilan y transfosforilan entre sí y fosforilan las cadenas de receptores, proporcionando los sitios de acoplamiento para las moléculas STAT. Luego, los STAT se someten a fosforilación mediada por JAK, se dimerizan y se translocan al núcleo, donde regulan la transcripción de genes diana (5). JAK3 y STAT5 son actores cruciales en la transducción de la señal aguas abajo de las citocinas que utilizan el receptor c (6). Las mutaciones de "pérdida de función" (LOF) en los genes que codifican JAK3 (7) o STAT5B (8) conducen a EIP con una anomalía de las células NK, lo que subraya la importancia de la vía para los linfocitos innatos. La inmunodeficiencia de estos pacientes se ha explicado por el deterioro de las respuestas de IL-7 e IL-15 (6). Es importante destacar que JAK1 tiene un papel dominante sobre JAK3 en la activación de STAT5 aguas abajo de los receptores de citoquinas que contienen c (9). Es atractivo especular que las mutaciones LOF de JAK1 también podrían provocar EIP. Hasta la fecha, solo se ha identificado un paciente que alberga mutaciones de la línea germinal de JAK1, en las que JAK1 estaba reducido pero no ausente, y de hecho presentó supresión inmune (10). En ratones, la pérdida completa de JAK1 conduce a la letalidad perinatal y los ratones recién nacidos muestran una fuerte reducción de timocitos y células B (11). Estas observaciones se confirmaron en ratones adultos: la eliminación inducible de JAK1 conduce a un deterioro de la homeostasis de las células madre hematopoyéticas (HSC) y reduce notablemente las frecuencias de las células B y el subconjunto B220+CD11c+NK1.1+ de Células NK (12). Sin embargo, hasta la fecha, ningún estudio ha analizado directamente el efecto de la pérdida de JAK1 en las células NK convencionales.

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Los primeros conocimientos sobre la contribución de JAK1 a la biología de las células NK se derivan de estudios que utilizan inhibidores de JAK, fármacos aprobados para el tratamiento de cánceres y enfermedades autoinmunes (13). Tanto los ratones como los pacientes tratados con el inhibidor de JAK1/JAK2, Ruxolitinib, mostraron una reducción del número de células NK y deterioro de la maduración y la función (14, 15). Dado que JAK2 también ha estado implicada en el impulso de la diferenciación de las células NK (14, 16), queda por dilucidar cuál de las dos quinasas es responsable de los efectos observados del tratamiento con ruxolitinib. Utilizando ratones con inactivación de Jak1 o Jak2 en células NKp46+, mostramos aquí que JAK2 es prescindible para la supervivencia de las células NK. Por el contrario, la eliminación de JAK1 en células NK maduras conduce a una deficiencia de células NK y la pérdida de un alelo de Jak1 es suficiente para alterar el control del crecimiento tumoral. Por lo tanto, identificamos JAK1 como un factor clave para las células NK maduras y generamos un modelo de ratón de deficiencia clásica de células NK.

MATERIALES Y MÉTODOS

Ratones y líneas celulares

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; fueron proporcionados amablemente por el Dr. Alexander Dohnal (CCRI, Viena, Austria). El alelo Jak1tm1c del mutante se generó a partir de ratones con el primer alelo knockout Jak1tm1a (descrito by International Mouse Phenotyping Consortium https://www.mousephenotype.org) mediante escisión del casete lacZ-neo mediante recombinación Flp.

El potencial condicional de los ratones Jak1fl/fl se activó mediante recombinación Cre y escisión del exón 3 de Jak1 flanqueado por loxP. La recombinación específica de tejido se indujo mediante cruzamiento de Jak1fl/fl o Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] con B6NTg(Ncr1Cre); (18) ratones. Los ratones Stat5fl/fl (19) y Stat5fl/flNcr1Cre (18) se describieron anteriormente. Los ratones Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre estaban en un fondo C57B6/N y Jak2fl/fl estaban en un fondo mixto. Los animales de experimentación fueron emparejados por edades (8 a 12 semanas) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en la Universidad de Medicina Veterinaria de Viena, de acuerdo con las directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia de Animales de Laboratorio (FELASA) (2014). Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar Animal de la Universidad de Medicina Veterinaria de Viena y por la autoridad nacional (Ministerio Federal de Ciencia e Investigación de Austria) según el artículo 26 y siguientes. de Experimentos con Animales, Tierversuchsgesetz 2012—TVG 2012, bajo las licencias BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 y BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 y se realizaron de acuerdo a los lineamientos de FELASA y ARRIVE. A lo largo del artículo, Jak1WT hace referencia a datos agrupados de ratones Jak1fl/+ y Jak1fl/fl. Las líneas celulares de linfoma de ratón RMA-Rae1 [amablemente proporcionada por el Prof. A. Cerwenka; (20)] y YAC-1 se cultivaron en medio completo RPMI1640 (Sigma) que contenía FCS al 10 % (Bio & Sell), penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 mg/mL (Sigma) y {{58 }}mercaptoetanol (Sigma).

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Modelo de tumor in vivo

A los ratones Jak1fl/+ y Jak1fl/+Ncr1Cre se les inyectaron sc 106 células RMA-Rae1 en ambos flancos y se controló el crecimiento del tumor cada dos días. Diez días después de la inyección, se sacrificaron los ratones y se determinó el peso del tumor. Para el análisis de citometría de flujo de células NK que se infiltran en tumores, los tumores se cortaron en trozos de aproximadamente 5 mm2 y la suspensión de células individuales se obtuvo usando el GentleMACSTM Octo Disociator (Miltenyi Biotec) con tampón de digestión que contenía colagenasa D (1 mg/ml; Sigma Aldrich). y ADNasa I (20 mg/ml; Roche).

Aislamiento, expansión y estimulación de células NK

Las células NK se aislaron de suspensiones unicelulares de bazo utilizando perlas MACS marcadas con DX5- según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Las células NK se expandieron en medio completo RPMI1640 suplementado con 5,000 U/mL de rhIL-2 (Proleukin, Novartis) durante 7 días. El número de células CD3-NK1.1+ se evaluó mediante citometría de flujo los días 0, 3, 5 y 7. El día 7, las células se lisaron para análisis de transferencia Western. Para el análisis de pSTAT5, se estimularon 106 esplenocitos con 50 ng/ml de rmIL-15 (PeproTech) durante 15 minutos y las células se fijaron en PFA al 2 % seguido de permeabilización y rehidratación con metanol.

Ensayo de citotoxicidad de células NK

Para los ensayos de citotoxicidad in vitro, las células NK clasificadas con DX5-MACS se expandieron durante 7 días en IL-2 como se describió anteriormente y se mezclaron en las proporciones efector:objetivo indicadas con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE, Molecular Probes , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit) células objetivo marcadas. Después de 4 h de incubación a 37 ◦ C, las células se tiñeron con Sytox Blue Dead Cell Stain (Thermo Fischer) y la lisis específica de las células diana se evaluó mediante citometría de flujo.

Citometría de flujo

Se prepararon suspensiones unicelulares a partir del bazo, la médula ósea o el hígado. El hígado se perfundió a través de la vena porta con 5–10 ml de PBS estéril. La separación de linfocitos se realizó utilizando el 37,5% de personal (GE Healthcare). Para el análisis de sangre, los eritrocitos se lisaron utilizando BD FACS Lysing Solution según el protocolo del fabricante (BD Bioscience). Los anticuerpos (clones) dirigidos a las siguientes proteínas se adquirieron de eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3) CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) y Ter119 (TER-119). Los anticuerpos CD49a (Ha31/8) y pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] se adquirieron de BD Pharminogen y pan-Rae1 (186107) se adquirió de R&D Systems. El número total de células se evaluó mediante citometría de flujo utilizando cuentas de conteo Count Bright Beads (Invitrogen). Los experimentos de citometría de flujo se realizaron en un BD FACSCanto II (BD Bioscience) o Cytoflex (Beckman Coulter) y se analizaron utilizando el software BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) o FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

FIGURA 1|La pérdida de JAK1 en las células NKp46+ conduce a una ausencia casi completa de células NK periféricas. (A) La frecuencia (panel izquierdo) y el número total (panel derecho) de células NK Lin−(CD3−CD19−Ly-6G−Ter119−) CD122+ en la médula ósea se evaluaron mediante flujo. citometría. (B) Las células Lin-CD122+ de la médula ósea se dividieron en precursores de NK (NKP: NKp46-NK1.1-), células NK inmaduras (iNK: NKp46-NK1.1+) y maduras. Células NK (mNK: NKp46+NK1.1+). (C) La frecuencia de células NK CD3-NKp46+ en el bazo se evaluó mediante citometría de flujo y se muestran gráficos representativos. (D, E) La frecuencia (panel izquierdo) y el número total (panel derecho) de células NK CD3-NKp46+ en el bazo (D) y la sangre (E) se evaluaron mediante citometría de flujo. (F) La frecuencia de las células NK convencionales (CD3-NK1.1+NKp46+CD49b+, panel izquierdo) y células ILC1 (CD3-NK1.1+NKp46+CD49a+ , panel derecho) se analizó en el hígado de ratones Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre y Jak1fl/flNcr1Cre mediante citometría de flujo. (A, B, D – F) Los gráficos de barras representan la media ± SEM de 1 a 2 experimentos independientes; norte=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001.

FIGURA 2|Las células NK Jak1fl/flNcr1Cre restantes muestran un fenotipo inmaduro. (A, B) Se analizaron células NK CD3-NKp46+ esplénicas para determinar la expresión de CD27 y CD11b mediante citometría de flujo. (A) Se muestra la frecuencia de células en cada etapa de maduración: DN (CD27 −CD11b−), CD27 (CD{{10}}CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). El número total de células en cada etapa de maduración se muestra en la Figura S1C. (B) Se muestran parcelas representativas. (C) Las células pSTAT5(Y694)+ se analizaron dentro de la población CD3-NKp46+NK1.1+ ex vivo después de 15 minutos de estimulación con IL-15 mediante citometría de flujo. (D) Se analizaron células NK CD3-NKp{{30}} esplénicas para determinar la expresión de los receptores activadores e inhibidores indicados mediante citometría de flujo. Se muestra el porcentaje de células NK positivas para cada receptor. Los datos de intensidad de fluorescencia media se presentan en la Figura S1D. (A – D) Los gráficos de barras y los números en los gráficos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes; norte=5–8. **p<0,01, ***p<0,001.

Transferencia occidental

La lisis celular, SDS-PAGE y transferencias Western se realizaron como se describió anteriormente (21). La detección de quimioluminiscencia se realizó utilizando el sustrato Clarity Western ECL (BioRad) y el generador de imágenes molecular ChemiDocT XRS+ (BioRad) y se analizó mediante el software Image Lab (BioRad). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-actina (C4, sc-47778) de Santa Cruz como control de carga, anti-JAK2 (D2E12; #3230), antiPerforin (#3693) y anti-JAK1 (#3332). ) de Tecnología de señalización celular.

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Análisis estadístico

Se realizaron pruebas t no pareadas o ANOVA unidireccional con pruebas posteriores de Tukey utilizando GraphPad Prism versión 5.00 (software GraphPad). El nivel de significancia se indica para cada experimento (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0,001).

RESULTADOS

La eliminación de JAK1 reduce el número de células NK y de ILC1 de forma dependiente de la dosis

Se ha demostrado que el inhibidor de JAK1/JAK2, Ruxolitinib, reduce el número, la maduración y la función de las células NK (14, 15). Para comparar y abordar la contribución de JAK1 y JAK2 a la biología de las células NK, generamos ratones con eliminación condicional de JAK1 o JAK2 en células NKp46+. Por lo tanto, cruzamos ratones Ncr1Cre (18) con ratones Jak1fl/fl o Jak2fl/fl [consulte la sección Materiales y métodos y (17)], respectivamente. Las células NK se desarrollan en la médula ósea a partir de precursores de células NK (NKP), que se definen como Lin-CD122+NK1.1-NKp46-. Se convierten en células NK inmaduras (iNK) que se convierten en NK1.1+ mientras que solo las células NK maduras (mNK) son NK1.1+NKp46+ (22). Como la expresión de la recombinasa Cre en ratones Ncr1Cre está impulsada por el promotor NKp46, la eliminación mediada por Cre está restringida a las células NK. Observamos una disminución significativa en el porcentaje y el número total de células NK de médula ósea en ratones Jak1fl/flNcr1Cre (Figura 1A). Las células NK Lin-CD122+ en ratones Jak1fl/flNcr1Cre mostraron porcentajes enriquecidos de precursores de células NK (NKP) y células NK inmaduras, mientras que las mNK se redujeron significativamente en la médula ósea en línea con un bloqueo del desarrollo en la célula iNK. etapa que previene la progresión a la etapa de células mNK (Figura 1B). La eliminación de un alelo de Jak1 condujo a un número intermedio de células NK de la médula ósea (Figura 1A). Consistentemente, el desarrollo de células NK mostró un fenotipo intermedio que sugiere un efecto de la dosis del gen Jak1 en el desarrollo de células NK (Figura 1B). El bloqueo en el desarrollo de células NK de la médula ósea se tradujo en una reducción drástica del número de células NK en la periferia. La pérdida de JAK1 provocó una deficiencia casi completa de células NK sanguíneas y esplénicas (Figuras 1C a E). De acuerdo con el efecto de dosificación del gen Jak1, los ratones Jak1fl/+Ncr1Cre mostraron porcentajes reducidos de células NK y números totales al 50% en comparación con los compañeros de camada de tipo salvaje en el bazo y la sangre (Figuras 1C-E). La eliminación del efector posterior JAK1 y del factor de transcripción STAT5 en las células NKp46+ también conduce a una reducción de las células NK maduras (18). Una comparación directa de ratones Jak1fl/flNcr1Cre y Stat5fl/flNcr1Cre reveló que la eliminación de JAK1 provocó una deficiencia de células NK aún más pronunciada en el bazo y la sangre que la eliminación de STAT5 (Figuras S1A, B). Los linfocitos innatos NKp46+ del hígado comprenden dos grupos de linajes distintos (23). Las células NK convencionales (cNK) se caracterizan por la expresión de CD49b y circulan libremente, mientras que los linfocitos innatos tipo 1 residentes en el hígado (ILC1) se caracterizan por la expresión de CD49a y están restringidos al hígado (24). De manera similar al bazo y la sangre, las cNK del hígado y las ILC1 residentes en el tejido fueron eliminadas casi por completo tras la pérdida de JAK1 (Figura 1F). Nuevamente, la eliminación de un alelo de Jak1 resultó en una abundancia intermedia de linfocitos innatos del hígado (Figura 1F). En resumen, estos hallazgos nos llevaron a concluir que la expresión de JAK1 en células NKp46+ es indispensable para el desarrollo y mantenimiento de las células NK en órganos periféricos de una manera dependiente de la dosis.

JAK1 es crucial para la maduración de las células NK

En la periferia, las células NK experimentan etapas de maduración que se caracterizan por la expresión secuencial de los marcadores de superficie CD27 y CD11b (22). Un alelo de Jak1 fue suficiente para impulsar la maduración de las células NK, ya que no detectamos ninguna diferencia en el porcentaje de células en cada etapa de maduración entre las células Jak1WT y Jak1fl/+Ncr1Cre (Figuras 2A, B). Las células NK Jak1fl/flNcr1Cre restantes mostraron un aumento en la población inmadura (CD27+CD11b−) y una disminución en la población CD27−CD11b+ madura (Figuras 2A, B y Figura S1C). Este resultado sugiere que las células restantes podrían haber perdido JAK1 y no haber recibido suficiente señalización IL-15 para madurar por completo. De hecho, las células NK Jak1fl/flNcr1Cre restantes mostraron una fosforilación reducida de STAT5 ex vivo tras la estimulación a corto plazo con IL-15 (Figura 2C). La actividad de las células NK está controlada por un equilibrio entre los receptores activadores e inhibidores. La eliminación de ni uno ni ambos alelos de Jak1 tuvo efecto sobre el porcentaje de células NK que expresan los siguientes receptores activadores e inhibidores: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E y Ly49A (Figura 2D). La diferencia más destacada fue una ligera disminución de las células NK Ly49G2+ y un aumento de las células NK DNAM-1+ en los ratones Jak1fl/flNcr1Cre (Figura 2D). De manera similar, no se detectaron diferencias importantes en el nivel de expresión (MFI) de cada receptor, además de un aumento en el MFI de DNAM1 y Ly49G2 (Figura S1D). Además de su papel como receptor activador, la expresión de DNAM- 1 marca un paso en el desarrollo; Las células DNAM-1+ dan lugar a células DNAM-1- (25). Razonamos que los cambios en DNAM-1+ reflejan el bloque de maduración de las células NK Jak1fl/flNcr1Cre.

FIGURA 3|JAK2 es prescindible para la supervivencia y maduración de las células NK. (A) La frecuencia (panel izquierdo) y el número total (panel derecho) de células NK CD3 −NKp46+ en los bazos de ratones Jak2WT y Jak2fl/flNcr1Cre se evaluaron mediante citometría de flujo. (B) Se analizaron células NK CD3-NKp46+ esplénicas para determinar la expresión de CD27 y CD11b mediante citometría de flujo. Se muestra la frecuencia de las células en cada etapa de maduración: DN (CD27−CD11b−), CD27 (CD27+CD11b−), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27−CD11b+). (C) La expresión de JAK2 y -actina se analizó mediante transferencia Western en células NK tras 6 días de expansión en IL-2. Los escaneos de transferencias completas están disponibles en el material complementario. (A,B) Los gráficos de barras representan la media ± SEM de 2 a 3 experimentos independientes; norte=5–12.

FIGURA 4|La pérdida de un alelo de Jak1 afecta la actividad de las células NK. (A) Las células NK se purificaron mediante MACS a partir de bazos y se cultivaron en IL-2 durante 7 días. El número de células CD3-NK1.1+NKp46+ vivas se evaluó cada 2 o 3 días. Los símbolos y las barras de error presentan la media ± SEM de 2 a 4 réplicas biológicas. (B) La expresión de JAK1, Perforina y -actina se analizó en células NK expandidas a partir de dos experimentos independientes mediante transferencia Western. Los escaneos de transferencias completas están disponibles en el material complementario. (C) Las células NK expandidas de ratones Jak1WT y Jak1fl/+Ncr1Cr se mezclaron con células diana YAC{{20}} (panel izquierdo) o RMA-Rae1 (panel derecho) teñidas con CFSE en las proporciones objetivo efectoras indicadas. . La lisis específica se evaluó mediante citometría de flujo. Para YAC-1 se muestra un gráfico representativo de uno de dos experimentos independientes. Los símbolos y las barras de error presentan la media ± SEM de 2 réplicas técnicas. Para RMA-Rae1 se muestra una media de dos experimentos independientes. Los símbolos y las barras de error presentan la media ± SEM de 2 a 3 réplicas biológicas. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 es prescindible para la supervivencia y maduración de las células NK

Hasta ahora hemos demostrado que la eliminación de JAK1 intrínseca de las células NK conduce a una deficiencia de células NK. Para dilucidar si JAK2 afecta la supervivencia y maduración de las células NK, analizamos las células NK esplénicas en ratones Jak2fl/flNcr1Cre y sus compañeros de camada de tipo salvaje. No pudimos detectar ningún impacto de la eliminación de JAK2 en la frecuencia o el número total de células CD3-NKp46+ en el bazo (Figura 3A). Además, los ratones Jak2fl/flNcr1Cre mostraron una maduración normal de las células NK, ya que se detectaron porcentajes similares de células CD27-CD11b+ en ambos genotipos (Figura 3B). Como la eliminación de la proteína JAK2 en las células NK fue muy eficiente (Figura 3C), estos datos definen inequívocamente que, a diferencia de JAK1, la JAK2 intrínseca de las células NK es prescindible para la supervivencia y maduración de las células NK.

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La pérdida de un alelo de Jak1 afecta la funcionalidad de las células NK

Para obtener más información sobre cómo JAK1 regula la funcionalidad de las células NK, analizamos el crecimiento de células NK esplénicas purificadas con MACS de Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre y Jak1fl/flNcr1Cre. Las células NK deficientes en JAK1-no se expandieron, lo que muestra que incluso bajo una dosis muy alta de IL-2 otras JAK no pueden compensar la pérdida de JAK1 (Figura 4A). La pérdida de un alelo de Jak1 resultó en una deficiencia menor de crecimiento (Figura 4A). El análisis de transferencia Western confirmó la expresión reducida de la proteína JAK1 en células NK Jak1fl/+Ncr1Cre expandidas, que fue paralela a niveles reducidos de perforina (Figura 4B). En línea, las células NK Jak1fl/+Ncr1Cre mostraron una actividad citotóxica alterada contra las líneas celulares diana YAC-1 y RMA-Rae1 (Figura 4C). Estos resultados demuestran que JAK1 no sólo es indispensable para mantener las células NK en la periferia sino que también contribuye a su actividad citotóxica.

El agotamiento de las células NK inducido por la pérdida de un alelo de Jak1 perjudica la vigilancia tumoral

Las células NK son cruciales para el reconocimiento temprano y la eliminación de las células transformadas. Para investigar si la reducción de las células NK y su funcionalidad alterada en ratones Jak1fl/+Ncr1Cre da como resultado una mayor susceptibilidad al crecimiento tumoral y no se compensa por otros medios, utilizamos células de linfoma RMA-Rae1. Esta línea celular es una herramienta para estudiar la vigilancia de tumores dependientes de células NK de forma sólida y eficiente (20). Trasplantamos por vía subcutánea células de linfoma RMA-Rae1 en ambos flancos de ratones Jak1fl/+ y Jak1fl/+Ncr1Cre. La falta de un alelo de Jak1 afectó la capacidad de las células NK para controlar el crecimiento del tumor, como lo ilustra el aumento del tamaño del tumor (Figura 5A) y el peso del tumor en Jak1fl/+Ncr1Cre (Figura 5B). En línea, estos tumores mostraron una infiltración de células NK significativamente reducida (Figuras 5C, D). No pudimos detectar ninguna diferencia en la frecuencia de las células NK infiltrantes de tumores NKG2D+ (Figura 5E), que son cruciales para el reconocimiento de los tumores RMA-Rae1. En resumen, nuestros resultados muestran que el número reducido de células NK combinado con una funcionalidad deteriorada de las células NK en ratones Jak1fl/+Ncr1Cre son suficientes para alterar significativamente el control del crecimiento tumoral in vivo.

FIGURA 5|La pérdida de un alelo de Jak1 perjudica la vigilancia tumoral. (A, B) A los ratones Jak1fl/+ y Jak1fl/+Ncr1Cre se les inyectó sc con 106 células RMA-Rae1 y después de 10 días se evaluó el peso del tumor. Se muestran (A) imágenes representativas de tumores y (B) diagramas de puntos con líneas horizontales que representan los pesos medios de los tumores ± SEM de 2 experimentos independientes; n=6–8 (C, D) Las células NK infiltrantes de tumores se analizaron mediante citometría de flujo. (C) Se muestran gráficos representativos de células CD3-NKp46+ infiltrantes de tumores y su porcentaje entre las células Rae1-. (D) El número total de células CD3-NKp46+ infiltrantes de tumor por gramo de tumor y (E) los porcentajes de células NK NKG2D+ se presentan como gráficos de barras que muestran la media ± SEM de un experimento n=4– 5. ***p < 0,001.

DISCUSIÓN

La desregulación de la vía de señalización JAK-STAT está estrechamente asociada con el desarrollo del cáncer y con trastornos inmunitarios (7). La primera enfermedad relacionada con JAK descubierta fue la inmunodeficiencia combinada grave (SCID), que se caracterizaba por anomalías de las células NK causadas por mutaciones de LOF JAK3 (26, 27). Aquí mostramos que la eliminación de JAK1 en las células NKp46+ conduce a una inmunodeficiencia innata con pérdida de células NK e ILC1 en órganos periféricos, mientras que JAK2 es redundante para la supervivencia y maduración de las células NK. Nuestro trabajo anterior descubrió que la pérdida de STAT5 en las células NK conduce a una reducción grave del número de células NK en los órganos periféricos (18). La pérdida de células NK en ratones Stat5fl/flNcr1Cre se rescató mediante la expresión forzada de la molécula de supervivencia BCL2 (28). Este estudio definió STAT5 como un factor de supervivencia crucial para las células NK. Los ratones con deficiencia de STAT5B carecen en gran medida de células NK (29), en línea con el hecho de que STAT5 envía señales en sentido descendente de citocinas que son vitales para la biología de las células NK, como IL-2 o IL-15 (30). IL-15 es crucial para el desarrollo y la supervivencia de las células NK, ya que los ratones Il15-/- carecen en gran medida de células NK periféricas (31). IL-15 envía señales a través de un complejo receptor de la cadena del receptor c, IL-2R e IL-15r (32). Los ratones knockout para cada cadena de receptor demuestran un papel absolutamente crítico en las señales enviadas corriente abajo de IL-15 para el desarrollo de células NK (33, 34). Hasta la fecha, se ha establecido bien la contribución de JAK3 asociada a c al desarrollo de células NK. Los ratones con deficiencia de JAK3 muestran un fenotipo SCID similar al observado en pacientes humanos y el desarrollo de células NK está bloqueado en la etapa progenitora pre-NK (35, 36). Ahora colocamos a JAK1, previamente subestimado, como una parte crucial del eje IL-15/STAT5 en las células NK. Las células NK Jak1fl/flNcr1Cre muestran un bloqueo del desarrollo en la etapa de células iNK y una pérdida casi completa de células NK en órganos periféricos.

Curiosamente, las consecuencias de la eliminación de JAK1 para las células NK superan los efectos de la deficiencia de STAT5-. El deterioro de la activación combinada de STAT3 y STAT5 puede ser la causa de la pérdida más pronunciada de células NK, ya que se ha demostrado que STAT3 induce la expresión del gen crucial de supervivencia de las células NK Mcl1 (37, 38). Alternativamente, JAK1 y STAT5 pueden tener vidas medias diferentes que explican diferentes frecuencias de "simplemente eliminadores": células NK que acaban de perder el gen pero aún portan la proteína, lo que puede explicar las diferencias. El efecto de la dosis genética de la deficiencia de JAK1-se refleja en el número de células NK, mientras que la pérdida de un alelo de JAK1 es prescindible para la maduración de las células NK. Esto sugiere que STAT5 activado limita la tasa de supervivencia de las células NK, pero no de su maduración. La eliminación de un alelo de Jak1 también es suficiente para perjudicar significativamente la vigilancia del tumor basada en una disminución del número de células NK combinada con una funcionalidad disminuida de las células NK restantes. De acuerdo con nuestros datos, la eliminación específica de las células NK del gen diana Mcl1 de STAT5 conduce a una deficiencia grave de células NK que provoca un aumento significativo de la carga metastásica (38).

cistanche tubulosa-mejora el sistema inmunológico

Los JAK pueden presentar funciones redundantes y compensarse entre sí. La corriente abajo del receptor de interferón JAK1 puede compensar parcialmente la pérdida de actividad de la quinasa JAK2 (39). También se ha demostrado que JAK2 fosforila STAT5 aguas abajo de IL-15 durante la diferenciación in vitro de células NK (16). Por otro lado, JAK2 constitutivamente activo sólo puede compensar modestamente la pérdida de JAK1 en las células madre, lo que sugiere un papel no redundante de JAK1 y 2 en las HSC. En línea, observamos que en ausencia de JAK1, JAK2 no logra compensar la activación de STAT5, incluso bajo una dosis alta de IL-2 in vitro, para permitir la supervivencia de las células NK. Queda por dilucidar si se pueden lograr efectos compensatorios expresando una forma constitutivamente activa de JAK2. Más importante aún, demostramos que la pérdida de JAK2 en las células NKp46+ es prescindible para la supervivencia de las células NK. Las células NK con deficiencia de JAK2-están completamente maduras, lo que demuestra que JAK2 intrínseco de las células NK no impulsa la maduración de las células NK. Esto también indica que la maduración alterada de las células NK en ratones Jak2fl/flMx1Cre (14) es probablemente causada por funciones extrínsecas de JAK2 a las células NK. Se podría especular que la eliminación constitutiva de JAK2 altera el medio de las citoquinas.

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