El agotamiento de macrófagos reduce la patología de la enfermedad en la glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios dependientes del factor H Ⅱ

3. Resultados

Indujimos CSS en ratones mediante inmunización repetitiva con apoferritina del bazo de caballo. Los animales generan una IgG antiapoferritina activa inmune humoral.respuesta y depósito de IgG en glomérulos. Nuestros estudios anteriores revelaron que hay un aumento de Mϕinfiltración en los riñonesen esta configuración.

3.1. La expresión del gen macrófago aumenta en los riñones ICGN dependientes de FH. Para evaluar la presencia de Mϕs en riñones ICGN dependientes de FH, se realizó qRT-PCR con marcadores de macrófagos M2, CD204 (receptor eliminador de Mϕ 1) y CD206 (receptor de manosa Mϕ 1) [21-24]. La expresión de ambos genes en el riñón aumentó significativamente después del tratamiento con apoferritina en ratones FHKO (Figura 1), lo que indica unaaumento de la presencia de macrófagos en el riñón.

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3.2. Cambios en el curso del tiempo mediante el tratamiento con clodronato en la infiltración de macrófagos renales en ratones FHKO tratados con apoferritina. Para determinar el método eficaz para reducir Mϕs en ICGN dependiente de FH, agotamos Mϕs en ratones fh-/-

Figura 3: Datos suplementarios. Se muestran los perfiles de citometría de flujo de los monocitos F4/80+ de los ratones control y tratados con clodronato. Las células F4/80+ se reducen significativamente, llegando a menos del 10% mediante el tratamiento con clodronato. Cada punto de tiempo n=6.

3.4. El agotamiento de macrófagos reduce la glomerularidad

Patología en ICGN mediada por FH. Al final del experimento se evaluaron los depósitos de complejos inmunes en el riñón y las características histopatológicas de la ICGN. La tinción de inmunofluorescencia para C3 e IgG reveló que el agotamiento de Mϕ no moduló los complejos inmunes en este entorno. En la Figura 5 se muestran la tinción de inmunofluorescencia y la histopatología representativas. La característica histopatológica principal fue la hipercelularidad difusa de los mechones glomerulares en ratones fh-/- con CSS que se redujo significativamente al agotarse Mϕs.

3.5. Los macrófagos modulan las citocinas en la ICGN dependiente de FH.

Una vez señorainfiltrarse en el riñóny están expuestos a estímulos inflamatorios, liberan citocinas. Evaluamos, mediante ELISA, los niveles circulantes en plasma de TNF e IL-6 y el mCSF renal en ratones FHKO tratados con solución salina, apoferritina o apoferritina y clodronato. Los niveles circulantes de IL-6 fueron muy bajos en ratones de tipo salvaje, aumentaron en ratones FHKO y se redujeron en ratones FHKO tratados con clodronato (Figura 6). Las tres citoquinas, TNF, IL-6 y mCSF aumentaron significativamente en ratones tratados con apoferritina en comparación con los controles tratados con solución salina. El agotamiento de Mϕ por clodronato limitó significativamente el aumento de citocinas en este entorno

3.6. Los macrófagos modulan los profibróticos

Moléculas y laminina en ICGN dependiente de FH. Una vez elLos riñones desarrollan una enfermedad., tienden a volverse fibróticos. Las Mϕs participan en el proceso fibrótico sobreproduciendo moléculas profibróticas. La PCR en tiempo real reveló un aumento del 75 % en la expresión del ARNm del factor de crecimiento transformante beta1 (TGFbeta1), un aumento del 100 % en la expresión de la metaloproteinasa-9 (MMP9) y un aumento del 230 % en el ARNm de laminina. De acuerdo con la expresión del ARNm, la expresión de la proteína laminina aumenta significativamente en los ratones fh-/- con CSS que se redujo en ausencia de Mϕs (Figura 7).

4. Discusión

Nuestros estudios recientes han demostrado que en ausencia de FH, los ratones desarrollan difusaglomerulonefritis proliferativa(GN) con F4/80+ Mϕs alrededor de sitios de circuitos integrados [10]. Además, nuestros estudios demuestran que los ratones Cd11b-/- fh-/- tienen características exacerbadas de glomerulonefritis [26]. Dado que la presencia de un aumento de macrófagos inflamatorios M1 y su activación sostenida podría causar patología tisular, y su repolarización en el fenotipo antiinflamatorio ayudaría en la resolución de la patología de la enfermedad, el presente estudio se llevó a cabo para comprender mejor el papel de Mϕs en fh -/- ratones con ICGN. La mayor presencia de Mϕs en el riñón y la resolución de la patología de la enfermedad mediante el agotamiento de macrófagos durante la ICGN mediada por FH demuestran el papel crítico de Mϕs en este entorno y, por lo tanto, podrían servir como objetivos terapéuticos importantes en este entorno.

Figura 5: El agotamiento de Mϕs reduce la patología glomerular en la ICGN dependiente de FH. Se muestran imágenes representativas de glomérulos de ratones con deficiencia de FH tratados con solución salina (a), tratados con apoferritina (b) y tratados con apoferritina + clodronato. En (A), las secciones están teñidas con C3 (verde) e IgG (rojo), mientras que (B) muestra secciones teñidas con PAS. Los depósitos de IgG que aumentaron con el tratamiento con apoferritina permanecieron sin cambios, mientras que los glomérulos parecían más normales con el agotamiento de los macrófagos.

La ausencia de FH conduce a una mayor producción de C5a. C5a se une a C5aR1 y envía señales a Mos al riñón, donde se suman al medio inflamatorio. Además, nuestros estudios también demostraron que en este contexto de generación excesiva de C5a, la inactivación de C5a parece limitar la enfermedad [10]. La activación de Mos hace que se polaricen, pero permanecen en un estado continuo [27]. Nuestros resultados en este estudio muestran que la enfermedad glomerular en CSS se redujo en ratones fh-/- en los que se agotaron los Mϕ en comparación con los ratones fh-/- sin agotamiento de macrófagos. Por lo tanto, la eliminación de la ICGN alliviada con Mϕs en ratones fh-/- reduce la patología de la enfermedad. Sin embargo, las Mϕ también son necesarias para el proceso de reparación, y dado que las Mϕ cambian de estado de pro a antiinflamatorio y viceversa, nuestro esfuerzo futuro será comprender si alterar el paisaje de las Mϕ sin agotarlas podría alterar la patología de la enfermedad.

Los Mϕ desempeñan un papel importante en el inicio y mantenimiento de la fibrosis y también participan en la supresión, resolución y reversión de la fibrosis [28]. Nuestros resultados muestran una mayor expresión de los marcadores CD204+ y CD206+ Mϕ, lo que sugiere su mayor presencia en este entorno. Dado que estos Mϕ son una fuente importante de moléculas profibróticas, nuestros resultados que muestran un aumento en TGF -1 así como en MMP9 sugieren que estos Mϕ podrían estar contribuyendo directa e indirectamente a los procesos fibróticos en la ICGN mediada por FH a través de diferentes mecanismos ( 1,3,8,44). TGF -1 puede alterar la fibrosis mediante la regulación de citocinas. Además, el TGF -1 modula la biosíntesis y expresión de C3 y del factor B en monocitos [29], y la alteración del complemento en las células inmunitarias y renales puede facilitar la fibrosis tisular [30]. Sin embargo, es necesario descifrar las interacciones exactas entre los macrófagos y el complemento, los mecanismos implicados, sus funciones y la compartimentación de los tejidos [31]. Nuestros estudios mostraron una expresión reducida de laminina en ratones empobrecidos en Mϕs en comparación con ratones con suficiente Mϕ. Para comprender mejor cómo la FH regula el proceso fibrótico, necesitamos identificar los subconjuntos de Mϕ específicos que están presentes en la ICGN mediada por FH y dilucidar las contribuciones de cada subconjunto de población. Estos estudios son importantes ya que las terapias complementarias se han convertido en una realidad clínica. Se han desarrollado y se siguen desarrollando inhibidores contra diferentes objetivos en la cascada del complemento que bloquearán los pasos posteriores en las vías de activación. Actualmente, uno de los inhibidores del complemento en uso clínico es el anticuerpo anti-C5, Eculizumab [32]. Por lo tanto, identificar los componentes patógenos del complemento en la enfermedad y complementarlos con la regulación de la población Mϕs no es un punto trivial.

Figura 7: Deposición de laminina enRiñones deficientes en FHcon ICGN se reduce por el agotamiento de Mϕs. (a) qRT-PCR para TGFB, MMP9 y laminina delARNm de riñónaislado de ratones después de 5 semanas de solución salina y apoferritina y 3 semanas de clodronato. La expresión está normalizada a GAPDH (n=6/grupo). ( b ) Fotomicrografías IF representativas para la tinción con laminina en los riñones de los mismos grupos de ratones. ∗P < 0:01.

En resumen, aquí estudiamos el papel de Mϕs en el modelo ICGN dependiente de FH. Los resultados también se pueden aplicar en entornos de activación no regulada del complemento con complejos inmunes como los observados en diferentes enfermedades como la nefritis lúpica, la nefropatía por IgA y la nefropatía membranosa. Mostramos la importancia tanto de la regulación del complemento por FH como del estado de Mϕs en la enfermedad. Por lo tanto, la focalización farmacológica de la cascada del complemento y el estado de Mϕs en la GN mediada por IC tiene relevancia clínica potencial.

Referencias

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