El agotamiento de macrófagos reduce la patología de la enfermedad en la glomerulonefritis mediada por complejos inmunitarios dependientes del factor H
Jan 17, 2024
factor de complementoH (FH) es un regulador clave de la vía alternativa del complemento, en humanos y ratones. Anteriormente, nuestros estudios revelaron que la ausencia de FH hace que el ratón C57BL6 se vuelva susceptible aenfermedad crónica del suero(CSS) junto con un aumento en larenal enFifiltración de macrófagosen comparación con los controles. Para entender si el aumento del reclutamiento de macrófagos (Mϕs) al riñón estaba entrandoFloridaInflamación y propagación de daños, examinamos la efetc de Mϕ agotamiento con clodronato en ratones knockout para FH con CSS. Se trataron ratones FHKO de ocho semanas de edad con apoferritina (4 mg/ratón) durante 5 semanas y con vehículo (PBS) o clodronato (50 mg/kg ip, 3 veces/semana durante las últimas 3 semanas). la administración declodronato disminuyó los monocitos y Mϕs en los riñonespor>80%.
Función del riñónevaluado por BUN y la albúmina permaneció más cerca de lo normal tras el agotamiento de Mϕs. El tratamiento con clodronato evitó la alteración de las citoquinas, TNF e IL-6, y aumento de la expresión genética del factor de crecimiento del tejido conectivo (CTGF), TGF -1, metaloproteinasa de matriz-9 (MMP9),Fibronectina, laminina y colágeno en ratones FHKO con CSS (P < 0:05). El tratamiento con clodronato produjo una protección relativa contra elcomplejo inmune- patología de la enfermedad mediada por (IC-) durante CSS según la evaluación delfirmarFipatología glomerular ligeramente reducida(GN) y matriz extracelular. Nuestros resultados sugieren que la activación del complemento es uno de los mecanismos que regulan el paisaje de los macrófagos y, por lo tanto,Fibrosis. El mecanismo exacto aún está por descifrar. En resumen, nuestros datos muestran que MϕLos s desempeñan un papel fundamental en ICGN y M dependientes de FHϕ agotamientoreduce la progresión de la enfermedad.
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1. Introducción
Enfermedad renal crónica(ERC) es un problema de salud global; El 10% del cual está mediado por complejos inmunes (IC-) y ocurre en la enfermedad del suero, infecciones y enfermedades autoinmunes. [1]. El informe anual del Sistema de datos renales de EE. UU. establece queindividuos con ERC"tienen claramente un alto riesgo de muerte", con una incidencia 10-veces mayor en tres décadas en las que los pacientes afectados perdieron el 70 % de su esperanza de vida. Según el NIDDK, aproximadamente el 14% de la población adulta ha sido diagnosticada con enfermedad renal, lo que la convierte en la novena causa de muerte [2]. El riñón es muy susceptible al daño mediado por el complemento, especialmente en entornos autoinmunes e inflamatorios [3, 4].
El sistema del complemento participa en las respuestas inmunes innatas y adaptativas y proporciona una primera línea de defensa contra los microorganismos [5, 6]. Consta de tres vías de activación, que se inician de manera única y están compuestas por más de 30 proteínas plasmáticas y asociadas a células [7]. La vía alternativa está constantemente en alerta y está regulada por proteínas como el factor H del complemento (FH). La FH es una proteína circulante sintetizada principalmente por el hígado [8]. Los ratones con deficiencia de FH (fh-/-) tratados con apoferritina desarrollan enfermedad del suero crónica (CSS) que conduce a glomerulonefritis proliferativa (GN) difusa dentro de las 5 semanas posteriores al tratamiento, mientras que los ratones de camada C57BL/6 que tienen suficiente factor H (FH) tienen poca inflamación glomerular [9]. La infiltración de macrófagos F4/80+ se produce en el riñón y se observa alrededor de los depósitos de CI en los ratones fh-/-. La activación del complemento genera anafilatoxinas, C3a y C5a, que participan en el tráfico de Mϕs al sitio de inflamación. La inhibición de la señalización de C5a/C5aR1 redujo la Mϕs en el riñón [10]. En esta configuración,lesión renalse asocia con infiltración renal, pero los mecanismos que pueden estar involucrados en causarlesión renalsiguen siendo desconocidos.
Figura 1: La FH altera los genes marcadores de macrófagos en el riñón de ratones con ICGN dependiente de FH. PCR cuantitativa en tiempo real para CD204 y CD206 utilizando ARNm aislado de los riñones después de 5 semanas de solución salina o apoferritina. La expresión está normalizada a GAPDH (n=6/grupo). ∗P < 0:01. Los gráficos representan el cambio de genes en ratones fh-/- tratados con apoferritina (n=6) en comparación con ratones fh-/- tratados con solución salina (n=6).
Los monocitos (Mo) generados por células hematopoyéticas [11] migran a través del endotelio hacia los tejidos, donde se diferencian en Mϕs. Marcadores como los receptores F4/80, CD11b, CD68 y Fc pueden identificar los Mϕ. Los Mϕ están implicados de manera crítica en la lesión, reparación y fibrosis renal en diferentes modelos experimentales de enfermedad renal [12, 13]. Recientemente, nuestros estudios demostraron que la lesión renal en la ICGN dependiente de FH está asociada con la infiltración renal de Mϕs. Además, estudios previos han demostrado que la inhibición de la infiltración renal de Mϕ reduce la presión arterial y previene la lesión glomerular y la fibrosis en varios modelos animales de nefropatía [14, 15]. Sin embargo, hasta donde sabemos, no se ha abordado el impacto del agotamiento de Mϕ durante la lesión renal asociada con la ICGN dependiente de FH. Por lo tanto, el presente estudio examinó el papel de Mϕs en la lesión renal asociada con la ICGN dependiente de FH utilizando clodronato de liposomas. El clodronato (ácido clodrónico) es un bifosfonato que se metaboliza a un análogo de ATP no hidrolizable [16]. Nuestros experimentos muestran que las Mϕ desempeñan un papel clave en la pérdida de la función renal en un entorno de activación no regulada del complemento. Por lo tanto, reducir Mϕs o indicarle a Mϕs que asuma un fenotipo de reparación podría reducir la patología de la enfermedad y puede explotarse terapéuticamente.
2. Materiales y métodos
2.1. Animales experimentales.
La cepa de ratón fh-/- fue generada y amablemente proporcionada por los Dres. Matthew Pickering y Marina Botto (Imperial College of London) y retrocruzamos continuamente la cepa C57BL/6 en nuestro laboratorio durante más de 10 generaciones. Los ratones Littermate FH suficientes sirvieron como controles (n=8/grupo). El genotipado se realizó mediante enfoques basados en PCR. Los ratones se mantuvieron a una temperatura de 20 a 22 grados C en un ciclo de iluminación de 12 h de luz a 12 h de oscuridad, en jaulas estériles y ventiladas con comida y agua ad lib. Los comités institucionales de uso y cuidado de animales de la Universidad de Chicago y la Universidad de Buffalo aprobaron todos los estudios.
2.2. Protocolo de enfermedad crónica del suero.
Se indujo CSS en ratones fH-/- o de tipo salvaje de 6 a 8 semanas con administración intraperitoneal diaria de 4 mg de apoferritina de bazo de caballo (Calzyme Laboratories) sin adyuvante [10, 17, 18] durante 5 semanas. Los controles de compañeros de camada recibieron inyecciones intraperitoneales de vehículo salino al mismo tiempo.
2.3. Evaluaciones de la función renal.
Las concentraciones de nitrógeno ureico en sangre (BUN) se determinaron con un autoanalizador Beckman (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Las concentraciones de albúmina urinaria se midieron con un kit ELISA de albúmina de ratón (Byl Laboratories, Montgomery, TX) y se normalizaron a creatinina urinaria medida colorimétricamente (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) como se describió anteriormente [19].
Figura 2: El clodronato reduce cada vez más los macrófagos renales en ratones con ICGN dependiente de FH. Se muestran los perfiles de citometría de flujo de monocitos F4/80+/Mϕs en los días 0, 2, 4 y 7, de forma representativa. La expresión de las células F4/80+ se determinó mediante citometría de flujo. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo V10. Las células F4/80+ se reducen significativamente en cada momento, alcanzando menos del 10 % en el día 7. Cada momento n=6.
2.4. Histología.
Los riñones se incluyeron en parafina y se fijaron con malina, y se generaron secciones de cuatro micrómetros. Las secciones se tiñeron con ácido periódico-Schiff y fueron examinadas por un patólogo renal (AC) de forma ciega. Para cada diapositiva, la glomerulonefritis proliferativa y la glomeruloesclerosis se clasificaron de 0 a 4 como se describió anteriormente [20]. Para la microscopía de inmunofluorescencia, el tejido renal se congeló rápidamente en 2-metilbutano preenfriado en hielo seco. Se procesaron secciones de criostato de cuatro micrones para tinción por inmunofluorescencia (IF). Las secciones se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con C3 anti-ratón conjugado con Alexa (Cappel) y IgG anti-ratón Alexa 555. Se proporcionó de forma ciega una puntuación semicuantitativa de la intensidad de la tinción y la distribución de 0 a 4, como se describió anteriormente [19].
2.5. qRT-PCR.
Se recogieron los riñones y se extrajo el ARN total de los tejidos utilizando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE. UU.). El ADNc se sintetizó utilizando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). qRT-PCR se realizó utilizando la mezcla maestra de PCR Power SYBR Green en el detector de secuencia ABI 7700 (Applied Biosystems). La amplificación por PCR se realizó en un volumen total de 25 ul que contenía 12,5 ul de 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul de agua libre de nucleasas, 5 ul de ADNc y 1,25 ul de los cebadores apropiados (IDT). Todos los cebadores de qPCR (Tabla 1) se diseñaron utilizando el software Primer3 (Instituto Whitehead de Investigación Biomédica) para garantizar la especificidad y la sensibilidad. Para cuantificar los niveles de ARNm, normalizamos la expresión de los genes diana a gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa. Los niveles relativos de expresión de ARNm se calcularon utilizando el método 2 - ΔΔCt y se normalizaron a los niveles de expresión de GAPDH.
2.6. Estadísticas.
Todos los resultados son medias ± DE de al menos {{0}} ratones en cada grupo. Se utilizó una prueba de dos colas no apareada (datos con distribución normal) o la prueba U de Mann-Whitney (datos sin distribución normal) para comparar 2 grupos con GraphPad Prism 5.0. La significancia estadística se expresa de la siguiente manera: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; y ns: no significativo.
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