Muchos Estudios Han Confirmado Que Las Enfermedades Alérgicas Son El Resultado No Solo De La Activación Inmune Innata 2

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3. Discusión

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE más DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunológica anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por referencia. Además, también se redujo la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

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El citoplasma de los mastocitos que se encuentran en los tejidos está lleno de partículas grandes y densas de mediadores inflamatorios preformados[28]. El proceso de liberación de estos mediadores de los gránulos secretores en los mastocitos se denomina desgranulación. Dado que la inhibición de la desgranulación de los mastocitos puede regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos [29,30]. Nuestros resultados muestran que la referencia tiene un efecto muy bueno en la desgranulación de los mastocitos independientemente del uso de antígeno, estimulador de receptor o ionóforo. Esto demuestra que la referencia es un potencial agente antialérgico (Figura 2).

Todos los gránulos almacenados previamente, los mediadores recién sintetizados e incluso los gránulos y sus componentes pueden usarse como indicadores de activación de MC [31]. Además, el método estándar es la medición de la concentración de Ca4t intracelular. La mayoría de los secretagogos de MC (p. ej., antígeno, compuesto 48/80) que se han usado generalmente en el laboratorio provocaron un aumento en la concentración de Ca2+ intracelular. De hecho, el aumento de la concentración de Ca2+ intracelular también puede desencadenar la desgranulación de MC. Por lo general, el aumento de Ca4t intracelular se induce mediante la activación de MC con compuestos, como bombas de tapsigargina (bloquean específicamente Sarco/Ca2 endoplásmico más ATPasa, SERCA) e ionóforos (es decir, ionomicina y A23187) [32,33]. Por lo tanto, en la activación de MC dependiente de Ca2t, la medición del influjo de Ca2t también se considera un método para determinar las condiciones de activación de MC. En la investigación de MC, Fura-2 se usa ampliamente para la determinación de los cambios intracelulares de Ca2 plus. En nuestros experimentos, encontramos que la intensidad de fluorescencia de los mastocitos activados se suprimió significativamente después de ser tratados con referencia (Figura 3). Informes anteriores indicaron que el aumento en la concentración de Ca4t intracelular estaba de acuerdo con la liberación de histamina [34]. Por tanto, inferimos que la liberación de histamina también será inhibida por el tratamiento de referencia. Se justifican más experimentos para verificar esta hipótesis.

Los mastocitos tienen salidas funcionales significativamente diferentes.dosis de cistanche redditEstos incluyen la desgranulación, la formación de precursores de ácido araquidónico, la quimiotaxis y la producción de citocinas, y todos dependen en cierta medida de las señales de calcio, independientemente de los estimulantes [32]. El MC activado libera citocinas, que son los principales mediadores de alergias y enfermedades inflamatorias [ 35]. La producción de citoquinas por parte de los mastocitos activados es el resultado de la inducción de la transcripción del gen de citoquinas en estas células. La estimulación de los mastocitos conduce a la activación de NF-kB y AP-1 y la producción de muchas citoquinas [36]. Las vías de señalización en cascada de MAPK juegan un papel esencial en la regulación de la expresión de citoquinas. La activación de estas vías a través de la activación de PKC por PI da como resultado la activación de varios genes, incluidos los genes de citocinas inflamatorias como IL-1, IL-6 y TNF [37]. Nuestros estudios recientes han demostrado que la referencia puede inhibir las citocinas liberadas por la activación de los queratinocitos. Al mismo tiempo, también encontramos que la vía de activación de MAPK también se inhibirá con el tratamiento de referencia [18]. En nuestro estudio actual, mostramos que la referencia también puede reducir la expresión de citocinas a través de la inhibición de la activación de MAPK en los mastocitos (Figuras 4 y 5). La activación de NFkB también se reduce debido a la inhibición de la activación de MAPK (Figura 6).

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Varios estudios han informado que una variedad de citoquinas en pacientes con EA están elevadas, lo que lleva a una disfunción de la barrera cutánea, incluidas las citoquinas secretadas por los queratinocitos y las citoquinas derivadas de Th2- [38,39]. Además, se informa que estas citoquinas secretadas también pueden regular a la baja las expresiones de las proteínas de unión estrecha (T]) y los genes de diferenciación terminal, incluida la filagrina (FLG), la loricrina (LOR) y la involucrina (IVL) [39,40 La expresión de ](pro)filagrina está disminuida en la EA y se asocia inversamente con la triptasa MC y la IL-6[41]. IL-1 media la inflamación crónica en ratones con una barrera cutánea alterada [35]. En un estudio anterior, se informó que las expresiones de FLG, IVL y LOR se redujeron después de la aplicación de DNCB en la piel dorsal de ratones NC/Nga [42,43]. En el presente estudio, las expresiones de FLG, IVL y LOR se redujeron considerablemente en la piel dorsal del grupo control, lo que indicaba que la barrera epidérmica estaba deteriorada. La administración de referencia recuperó significativamente las expresiones disminuidas de FLG, IVL y LOR después del tratamiento con DNCB, mientras que la administración de referencia aumentó ligeramente las expresiones de IVL y LOR en comparación con el grupo de control (Figura 8). Se sabe que el compuesto 48/80 es un activador eficaz de los mastocitos de la piel. La respuesta de la piel estimulada por el compuesto 48/80 puede inducir un comportamiento de rascado al liberar histamina de los mastocitos [44]. La histamina liberada por los mastocitos activados juega un papel importante en el aumento de la permeabilidad vascular provocado por el compuesto 48/80. Durante el prurito humano, también se considera la liberación de histamina de los mastocitos a través de varios estímulos. ered para ser un mediador importante. Por lo tanto, la inhibición de la desgranulación de los mastocitos es un paso importante en la regulación de la liberación de histamina durante el rascado. En este compuesto de estudio, 48/80 provocó una activación eficaz de los mastocitos de la piel. Sin embargo, el pretratamiento con referencia redujo significativamente el nivel de desgranulación de los mastocitos (Figura 2).beneficios del extracto de cistancheEstos resultados indican que el efecto conductual anti-rasguño de referencia puede deberse a la reducción de la permeabilidad vascular al regular la desgranulación de los mastocitos (Figura 9).

En general, se establece que los pacientes con EA sufren disfunción de la barrera cutánea, inflamación de la piel o ambas, por lo que es difícil encontrar métodos de tratamiento apropiados. Por lo tanto, generalmente se recomienda la terapia combinada. Nuestra investigación reciente ha demostrado que nunca tiene función inmunomoduladora y capacidad de reparación de barrera. Por lo tanto, una característica importante de referencia en el tratamiento de la DA en el futuro es el mantenimiento de la función de la piel y la mejora de la hidratación de la piel y la reparación de la barrera. Reference también puede reducir el comportamiento de rascado inducido por alérgenos e irritantes. Además, la marcha atópica es una enfermedad relacionada con un fenómeno que ocurre y progresa paso a paso. La dermatitis atópica a menudo se observa en la infancia. La alergia alimentaria a menudo ocurre después de 1-2años de edad. La rinitis alérgica a menudo puede comenzar antes y después de la escuela. Los síntomas del asma aparecen en diferentes momentos, pero la mayoría de ellos son posteriores a la rinitis alérgica. Después de la niñez, la dermatitis atópica y ciertas alergias alimentarias pueden mejorar o desaparecer. La rinitis alérgica y el asma no son fáciles de curar[45,46]. Por tanto, son fenómenos comórbidos en las enfermedades. Los productos naturales incluidos los de referencia tienen el potencial terapéutico de la comorbilidad, y su efectividad en enfermedades relacionadas merece ser estudiada en el futuro.

4. Materiales y Métodos

4.1.Células de leucemia basófila de rata

Las células de leucemia basófila de rata (RBL-2H3) fueron un regalo de TLHwang, Universidad Chang Gung, Taoyuan, Taiwán. Las células RBL-2H3 son mastocitos de la mucosa que se utilizan para estudiar la desgranulación inducida por antígenos o ionóforos de calcio, el Ca4t intracelular y la transducción de señales [29]. Las células se cultivaron en EMEM que contenía 10 por ciento de FBS, con penicilina y estreptomicina a 37 grados, 5 por ciento de CO2. El medio de Dulbecco modificado por Iscove (IM) y el suero bovino fetal (FBS) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, Nueva York, NY, EE. UU.).

4.2.Ensayo MTT

El ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolio (MTT) se usa para medir la actividad metabólica de las células. Se sembraron células RBL-2H3 en una placa de cultivo de 24-pocillos a 5 × 10 más/pocillo. Después de 24 h de tratamiento con el fármaco, se agregaron 30 μl de MTI por pozo y se colocaron en una incubadora de células a 37 grados durante 2-4 h, luego se disolvieron cristales de formazán púrpura con DMSO. Se usó un lector ELISA para medir la intensidad de absorbancia a una longitud de onda de 550 nm como prueba de viabilidad celular.

4.3.Medición del nivel de Ca2 plus intracelular

[Ca2t] I se midió con fura-2 como se describió anteriormente [47]. Las células RBL-2H3 se resuspendieron en IMDM que contenía Fura 2-AM 5 uM y CaClz 1,2 mM a 37 grados para 30 minutos. Después de la carga de Fura-2, los queratinocitos se sedimentaron y se resuspendieron en DMEM fresco. Se transfirió una alícuota (2 ml) a una cubeta agitada que contenía CaCl2 1,2 mM. Se analizó la fluorescencia de Fura-2-Ca a las longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm (longitud de onda de emisión, 505 nm) en un PerkinElmer LS{{19 }} espectrofluorómetro (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Los datos se registraron a intervalos de 5 s[47].

4.4. Reacción cuantitativa en cadena de polímeros (qPCR)

Se plantaron células RBL{{0}}H3 en una placa de cultivo de 3,5 cm. Después de que las células crecieran hasta el 90 por ciento de su capacidad, se cultivaron en un estado estático durante 24 h. Después de pretratar las células con referencia durante 20 min, se estimularon con TNF-a/IFN-y durante 1 o 24 h, respectivamente. Se rasparon las células, se centrifugaron (16,000xg, 10 min, 4 grados) y se extrajo el sobrenadante. El ARN se purificó utilizando un kit de aislamiento de ARN total (GeneDirex@, Vegas, NV, EE. UU.). De acuerdo con el procedimiento operativo del script cDNA Synthesis Kit (BIO-RAD), los reactivos se agregaron en orden y se operaron de acuerdo con las condiciones indicadas para convertir el ARN en cDNA. Además, se utilizó PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Se añadieron y mezclaron uniformemente un total de 7,5 ul de ddH20, 2 ul de ADNc, 0,25 ul de cebadores directos e inversos y 10 ul de SYBR GREEN. Las secuencias de los cebadores se muestran en las Tablas 1 y 2. Luego, se cuantificó el ARN utilizando el sistema de PCR en tiempo real ABI StepOnePlusTM.

4.5. Ensayo de transferencia Western

La transferencia Western se utiliza para analizar los cambios de varias proteínas en las células. Se sembraron células RBL{{0}}H3 en una placa de cultivo de 3,5 cm. Después de que las células crecieran hasta el 90 por ciento y se privaran de alimento durante 24 h, se pretrataron con referencia durante 20 min y luego se estimularon con TNF-a o IFN-y durante 30 min o 1 h, respectivamente. Después de raspar, se pulverizaron por ultrasonidos y se centrifugaron (13.200 rpm, 10 min, 4 grados). Después de la centrifugación, se tomó el sobrenadante y se cuantificó la proteína con un kit de ensayo de proteínas Pierce (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS al 10 por ciento y luego se sometió a electroporación con membrana de PVDF. Una vez completada la transferencia, la membrana de PVDF se puso en una solución TBS-T (solución salina tamponada con Tris/tween 20 al 0,05 %) que contenía leche desnatada en polvo al 5 % y se agitó durante 1 hora para evitar la unión no específica. Luego, se usó TBS-T para lavar 3 veces, 10 min cada vez. Luego, se agregaron los anticuerpos primarios (dilución 1:1000) y se colocaron a 4 grados durante la noche y luego se lavaron 3 veces con TBS-T cada 10 min. Después de agregar anticuerpos secundarios (diluidos 1:1000) durante 1 h, la membrana de PVDF se lavó 3 veces con TBS-T durante 10 min cada vez. Finalmente, se agregó el revelador y la membrana se colocó en un sistema de extracción de luminiscencia química (BIOSTEP Celvin") para disparar.

4.6.Dinitroclorobenceno(2,4-Dinitroclorobenceno, DNCB) Inflamación de la piel similar a la dermatitis atópica inducida en ratones

En primer lugar, los ratones se dividieron en cuatro grupos: grupo control, grupo DNCB (grupo negativo), grupo de referencia (3 mg/kg y 10 mg/kg) con grupo DNCB y dexametasona (0,2 mg/kg) con Grupo DNCB (grupo positivo). La dexametasona es una hormona corticosteroide que puede reducir la hinchazón y las reacciones alérgicas. En este experimento in vivo, tanto la referencia como la dexametasona se disolvieron en DMSO, mientras que el DNCB se disolvió en etanol al 75 por ciento mediante choque ultrasónico. El primero se administró por inyección intraperitoneal, y para el segundo, se aplicaron 100 μL en la piel de la espalda y 20 μL en la oreja derecha. Tres días antes del experimento, los ratones fueron anestesiados y se eliminó el vello de la espalda, y se incrustó un pequeño imán de medición (SCT-MAG-TF) en la parte posterior de las patas traseras del ratón.cistanche genghis khanDespués de tres días de reposo, se comprobó que los ratones se encontraban en buenas condiciones físicas y que la piel de la zona de depilación dorsal era normal, y se inició el experimento. Durante el experimento, se tomaron fotografías para registrar los cambios de apariencia de la piel. La primera etapa ({{0}} días) fue el período de la dermatitis atópica alérgica. Después de medir los valores básicos de los ratones en el grupo DNCB, la referencia (3 y 10 mg/kg) y el grupo experimental DNCB, y el grupo experimental 0,2 mg/kg de dexametasona y DNCB, se aplicó uniformemente 1 por ciento de DNCB en la piel de la espalda y oreja derecha. Al quinto día se inyectaron por vía intraperitoneal los fármacos de referencia y dexametasona. La segunda etapa (del día 5 al día 14) fue la reinducción de la dermatitis atópica.prolongación de la vida de la cistancheEn los 3 grupos experimentales,0.5 por ciento de DNCB se untó uniformemente en la piel de la espalda y la oreja derecha de los ratones. Al día siguiente, se tomaron y registraron los valores fisiológicos de la piel y fotografías. Después de sacrificar a los ratones con un exceso de dióxido de carbono (CO2) el día 15, se eliminó el tejido de la piel dorsal para el análisis experimental posterior.

4.7 Compuesto 48/80-comportamiento de rascado inducido en ratones BALB/c

Se cortó el pelo de la piel del dorso del ratón y se inyectaron 20 μl de solución del compuesto 48/80 por vía intracutánea. En su lugar, los ratones de control recibieron inyecciones de solución salina. Inmediatamente después de la inyección, se colocó al animal en una jaula de observación (diámetro 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokio, Japón) y se detectó y evaluó automática y objetivamente el comportamiento de rascado del ratón. El comportamiento de rayado se midió durante 60 min. MicroAct utiliza los siguientes parámetros de análisis para detectar ondas correspondientes al comportamiento de rascado continuo de los ratones: umbral, 0,05 V; intervalo de eventos, 0,05 s; duración mínima, 0,25 s; frecuencia máxima, 30 Hz; frecuencia mínima, 5Hz. 4.8.Análisis estadístico

Se utilizó el software Sigma-Plot (Versión 10.0) para el análisis estadístico.cistanche nueva zelandaLos datos se expresan como media ± SEM, con (*) y (#) como notas. La significación estadística de los datos se analizó mediante pruebas t de Student de dos colas no apareadas. Los valores de p inferiores a 0.05 y 0,01 se consideraron significativos.

5. Conclusiones

En este estudio, determinamos que la referencia inhibe eficazmente la desgranulación de los mastocitos y reduce la expresión de citocinas proinflamatorias, lo que puede reducir los síntomas similares a los de la dermatitis atópica, restaurar la barrera cutánea y reducir el rascado de la piel. Además, hemos demostrado que la referencia no solo puede actuar sobre los queratinocitos de la piel, sino que también afecta la activación de los mastocitos. Tiene más potencial de aplicación en enfermedades alérgicas e inflamatorias de la piel.

Este artículo está extraído de Int. J. Mol. ciencia 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms