Predicción y verificación del mecanismo de la desértica de Cistanche en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal ⅰ
Nov 15, 2024
ABSTRACTO
OBJETIVOInvestigar el mecanismo deDeserticola de Cistanche en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal(EII).
MétodosEl activocomponentes de C. deserticolafueron proyectados en función de TCMSP y informes de literatura. Los objetivos de los ingredientes activos se obtuvieron a través de la plataforma de predicción de objetivos suizos. Luego, los objetivos de la enfermedad se obtuvieron buscando en genera genética y bases de datos OMIM. Se construyeron la red PPI y la red de "fármaco-compuesto-enfermedad-objetivo". Se seleccionaron los componentes centrales y los objetivos centrales. Se realizaron análisis de enriquecimiento de GO y KEGG, y la verificación de acoplamiento molecular se realizó para objetivos centrales y componentes centrales. El modelo de ratones IBD se estableció y se dividió en el grupo modelo, grupo de control positivo (dexametasona, 0. 4 mg/kg) yC. deserticolaGrupo de extracción (1 0 0, 2 0 0, 4 0 0 mg/kg); Se estableció un grupo de control en blanco, con 8 ratones en cada grupo. Cada grupo recibió medicamentos relevantes, una vez al día, durante 7 días consecutivos. Se calcularon la puntuación del índice de actividad de la enfermedad (DAI) y la longitud del colon, y se observó la morfología patológica del colon de ratones. Los niveles de factores inflamatorios [interleucina -6 (il -6), IL1, IL -10, se detectaron mieloperoxidasa (MPO), factor de necrosis tumoral- (TNF-)] en el tejido colon, y las expresiones proteicas de los objetivos centrales. Resultados Se obtuvieron un total de 39 ingredientes activos y 232 objetivos potenciales de C. deserticola en el tratamiento de la EII. El tratamiento de la EII con C. deserticola podría estar relacionado con componentes centrales como la quercetina, la talilactona, el isoterol y el cistanosido H, y los objetivos centrales como TNF, AKT1, STAT3, EGFR y SRC. El análisis de la vía GO y KEGG predijo que los procesos biológicos de C. deserticola en el tratamiento de la EII se relacionaron principalmente con la fosforilación de proteínas y la regulación negativa de la apoptosis, que involucra principalmente PI3K/AKT y las vías de señalización de resistencia a la tirosina quinasa quinasa de EGFR. Los resultados del acoplamiento molecular mostraron que la energía de unión entre los componentes centrales y el objetivo del núcleo de C. deserticola fue inferior a －4.7 kJ/mol. Los resultados del experimento en animales mostraron que después de la intervención con extracto de C. deserticola, el peso corporal y la longitud del colon de los ratones aumentaron significativamente (P ＜ 0. 0 5 o P ＜ 0. 01), mientras que DAI disminuyó significativamente (P ＜ 0.05 o P ＜ 0.01). La congestión y el edema de la mucosa de colon se redujeron significativamente, y la puntuación patológica del tejido del colon disminuyó significativamente (P ＜ 0.05 o P ＜ 0.01); the levels of IL-6, IL-1 , MPO and TNF- , as well as the protein expressions of PI3K, phosphorylated PI3K (p-PI3K), EGFR, TNF- , STAT3, phosphorylated STAT3 (p-STAT3), AKT1, phosphorylated AKT1 (p-AKT1) and El SRC en el tejido del colon se redujo significativamente (P ＜ 0.05 o P ＜ 0.01), mientras que el nivel de IL -10 aumentó significativamente en el grupo modelo (P ＜ 0.01). Conclusiones C. Deserticola puede aliviar la EII regulando la vía de señalización SRC/EGFR/PI3K/AKT.
Palabras clave Deserticola Cistanche; enfermedad inflamatoria intestinal; Farmacología de la red; Maceo molecular; verificación experimental
Nuevo suplemento oral de Herb Cistanche para estreñimiento
Servicio de apoyo de Wecistanche: el mayor exportador de Cistanche en China:
Correo electrónico: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950
La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es un término general para enfermedades inflamatorias crónicas, inespecíficas del tracto gastrointestinal, incluidos dos subtipos: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa [1]. La EII es una de las enfermedades comunes y difíciles del sistema digestivo en mi país, y también es el foco, el punto caliente y la dificultad de la investigación básica y el diagnóstico clínico y el tratamiento de las enfermedades del sistema digestivo. En los últimos 20 años, la incidencia de EII en mi país ha aumentado año tras año, y se espera que alcance los 150, 000 para 2025, clasificándose primero en Asia [2].
En general, se cree que la susceptibilidad genética, los factores ambientales, la disfunción inmune, los cambios en la flora intestinal y la función de barrera de la mucosa intestinal deteriorada son las principales causas de la ocurrencia y el desarrollo de la EII [3]. El tratamiento clínico de la EII se basa principalmente en la terapia farmacológica, principalmente que incluye ácido aminosalicílico, antibióticos, corticosteroides e inmunosupresores [4]. Sin embargo, los medicamentos anteriores son propensos a causar múltiples reacciones adversas, y los pacientes desarrollarán tolerancia después del uso a largo plazo, y son propensos a recaer después de detener el medicamento [5].
Como un recurso superior tradicional en mi país, la medicina china tiene las ventajas de clara eficacia, baja tasa de recurrencia y pocas reacciones adversas en el tratamiento de enfermedades crónicas. Cistanche Deserticola, también conocido como el "Ginseng del desierto", se deriva de los tallos carnosos secos con hojas escamosas de Cistanche Deserticola yc Ma o Cistanche Tubulosa
(Schenk) Wight, una planta de la familia Oobanchaceae. Es un recurso medicinal único y ventajoso en Xinjiang. Contiene principalmente ingredientes activos como glucósidos feniletanoides y terpenos. Tiene los efectos de tonificar el riñón y el fortalecimiento de Yang, humedeciendo los intestinos y aliviar el estreñimiento, y se usa ampliamente en el tratamiento de enfermedades intestinales [6-7]. Los glucósidos feniletanoides son los componentes indicadores para la identificación y la determinación del contenido de la desértica de Cistanche como se especifica en la edición 2020 de la farmacopea china (Parte I)
Cistanche para intestino inflamatorio
(principalmente equinacósido y verbascosido) [8]. Los estudios han demostrado que el equinacósido puede mejorar la colitis en ratones al promover la proliferación de células epiteliales intestinales e inhibir la apoptosis celular [9]; El verbascósido puede ralentizar la progresión de la colitis en ratas como un carroñero de radicales libres [10]; Los glucósidos totales de la desértica de Cistanche pueden prevenir y tratar la EII inhibiendo la expresión de factores inflamatorios [11]. Sin embargo, no hay estudios sobre qué componentes químicos en la desértica de Cistanche juegan un papel terapéutico en la EII a través de los cuales los objetivos y las vías de señal.
Con este fin, este estudio tiene la intención de predecir el mecanismo de acción potencial de la desertificación de Cistanche en el tratamiento de la EII a través de la farmacología de la red combinada con la tecnología de acoplamiento molecular, y verificar los resultados predichos por la farmacodinámica, para que la farmacodinámica, a fin de aclarar sistemáticamente el mecanismo molecular de la deserticola de Cistanche, en el tratamiento de la IBD, en el orden para proporcionar una base teórica sistemática.
1 materiales
1.1 animales experimentales
Los animales utilizados en este estudio fueron ratones C57BL/6 de grado SPF masculino, un total de 48, comprado en el Centro de Experimentos Animales de la Universidad de Medicina Xinjiang, pesando 18-20 G, con un número de licencia de producción animal experimental de SCXK (new) 2023-0004 y un número de licencia experimental de uso animal de SYXK (nuevo) {2023-0001. Los ratones se mantuvieron en un entorno con una temperatura de (22 ± 2) grados, una humedad relativa de 50%-70%y una iluminación de ciclo 12-} H. Este estudio cumple estrictamente con el bienestar animal y los requisitos éticos del Comité Experimental de Ética Animal de la Universidad de Medicina de Xinjiang (número de aprobación 20210301-177).
1.2 Medicamentos y reactivos principales
Extracto de Cistanche (Ce; pureza mayor o igual al 85%, equinacósido mayor o igual al 40%, verbascosido mayor o igual al 16%; número de lote 20230103) se adquirió de Xinjiang HetianDichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd.;
Base de Cistanche Hetian Dicheng Cistanche de Wecistanche
Base de Cistanche Hetian Dicheng Cistanche de Wecistanche
Extracto de Dicheng Cistanche de Wecistanche.
Servicio de apoyo de Wecistanche
Correo electrónico: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950
dextran sulfato sodio (DSS, peso molecular relativo 36, 000-50, 000, número de lotes C16013701) se adquirió de Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; El kit de detección cualitativa de sangre oculta fecal (número de lotes ML1095013) se adquirió de Shanghai Elisa Biotechnology Co., Ltd.; La sustancia de referencia de dexametasona (pureza mayor o igual al 98%, el número de lotes 54231207002) se adquirió de Beijing Solebaugh Technology Co., Ltd.; factor de necrosis tumoral- (tnf-), interleukin 6 (interleukin -6, il -6), il -10, il -1, mieloperoxidasa (MPO) enzimas enzimas inmunosorbentes kits (batch n. 88-7064, 88-7105, 88-7013, EMMPO) se compraron de Invitrogen, USA; rabbit TNF- , protein kinase B1 (AKT1), phosphorylated AKT1 (p-AKT1), signal transduction and activator of transcription 3 (STAT3), phosphorylated STAT3 (p-STAT3), epidermal growth factor receptor (EGFR), non-receptor tyrosine kinase (SRC), phosphoinositide 3 kinase (phosphoinositide 3- quinasa (PI3K), PI3K (P-PI3K) fosforilado y anticuerpos secundarios de cabra con peroxidasa marcado con peroxidasa Gbb1156562. GB112343, GB112544, GB11525 y GB23303, respectivamente) se compraron de Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd.
1.3 Instrumentos principales
Los instrumentos principales utilizados en este estudio incluyen el lector de microplacas de longitud de onda completa de Multiskan GO (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), RM2016 Pathology Slicer (Leica Instruments, Shanghai), Gel.doc.xr Gel Electroforesis Sistema de análisis de imágenes e Instrumento de transferencia de proteínas trans-transparentes (Bio-Rad, EE. UU.).
2 métodos
2.1 Análisis de farmacología de red
2.1.1 Predicción de ingredientes y objetivos activos
The active ingredients of Cistanche deserticola were screened using the TCMSP platform (http://lsp.nwu.edu.cn/) (with oral availability ≥30% and drug-like properties ≥0.18 as screening conditions) [12], and the active ingredients of Cistanche deserticola with anti-IBD effects reported in the literature were supplemented. The Swiss Target Prediction platform was used to search for the active ingredient targets of Cistanche deserticola (probability parameter>0), y después de eliminar los duplicados, se obtuvieron los objetivos de ingredientes activos de la desértica de Cistanche. Utilizando la "enfermedad inflamatoria intestinal" como término de búsqueda, los objetivos de la enfermedad se recolectaron de la base de datos GeneCards (http://www.genecards.org/) y la base de datos OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim), y se obtuvieron objetivos potenciales después de la eliminación.
2.1.2 Diagrama de Venn Drawing y construcción de la red interactiva "Drug-ingrediente-target-enfermedad"
La herramienta de análisis en línea de Venny 2.1 se utilizó para intersectar los objetivos de ingredientes activos de la desértica de Cistanche con objetivos potenciales para obtener los objetivos potenciales de la desértica de Cistanche para el tratamiento de la EII. El software Cytoscape 3.9.1 se utilizó para construir un diagrama de red de niveles múltiples de "fármaco-antecedientes-enfermedad-objetivo" y realizar análisis topológicos. Los 4 componentes principales con el valor de mayor grado se seleccionaron como componentes centrales de la desértica de Cistanche para el tratamiento de la EII.
2.1.3 Dibujo de la red de interacción proteína-proteína
The potential targets of Cistanche deserticola for the treatment of IBD were imported into the STRING database (http://string-db.org/), the species was limited to "Homo sapiens", the interaction score was limited to >0. 4, se dibujó la red de interacción proteína-proteína (PPI) y se calculó el valor de grado de cada objetivo. Los objetivos con los 5 mejores valores de grado se tomaron como objetivos centrales.
2.1.4 Análisis de enriquecimiento de función y vía de objetivos potenciales
Los objetivos potenciales de Cistanche Deserticola para el tratamiento de la EII se importaron a la base de datos David (https://david.ncifcrf.gov) para la ontología genética (GO) y la enciclopedia de Kyoto de genes y genomas (KEGG) Análisis de Patina, y visualizado utilizando el uso de la plataforma de microescience en línea en línea de la microesciencia en línea en línea (https://www.bioinformatics.com.cn/). El grado de enriquecimiento se midió por el número de objetivos y el valor -lgp de las vías correspondientes enriquecidas; Las 10 entradas principales en el análisis GO se seleccionaron para dibujar un gráfico de barras, y las 20 vías superiores en el análisis KEGG se seleccionaron para dibujar un gráfico de burbujas.
2.1.5 acoplamiento molecular
El software AutoDock Vina se utilizó para realizar la verificación de acoplamiento molecular en los objetivos centrales seleccionados (TNF, AKT1, STAT3, EGFR y SRC) y los componentes centrales (quercetina, sucinolona, solitosterol y Cistancheside H). Cuanto menor sea la energía libre de unión, mayor será la afinidad del componente central para unirse a la proteína del receptor [13].
2.2 Verificación del experimento de animales
2.2.1 Modelado, agrupación y administración de drogas
48 male C57BL/6 mice (6-7 weeks old) were divided into blank control group, model group, positive control group (dexamethasone, 0.4 mg/kg, the dose was calculated according to the clinical equivalent dose) and CE low, medium and high dose groups (100, 200, 400 mg/kg, the dose was set Según la referencia [14]) según el peso corporal después de 1 semana de alimentación adaptativa, con 8 ratones en cada grupo. Los ratones en el grupo de control en blanco comían y bebían agua normalmente todos los días, mientras que los ratones en el grupo modelo y el grupo de administración de medicamentos bebían una solución DSS al 3% libremente todos los días para modelar y comían libremente. Al mismo tiempo que el modelado, los ratones en cada grupo de dosis de CE se vistieron con la dosis correspondiente de CE (disuelto en agua destilada antes de su uso), los ratones en el grupo de control positivo se inyectaron intraperitonealmente con dexametasona, y los ratones en el grupo de control en blanco y el grupo modelo se gavearon con agua estéril a 0.01 ML/G cada día, una vez al día, con 7 consultores consultados. Durante el experimento, un ratón murió en cada uno de los grupos de modelos, grupo de control positivo y grupo de dosis bajas de CE. Después de la última administración, los ratones fueron ayunados durante 12 h. Después de la anestesia, se retiraron los globos oculares para recolectar sangre y tejido de colon para su uso posterior.
2.2.2 Cálculo del índice de actividad de la enfermedad y detección de la longitud del colon
Durante el experimento, el peso y las heces de los ratones se registraron todos los días. La pérdida de peso, las características fecales y la sangre en las heces de cada grupo de ratones se evaluaron de acuerdo con los criterios de puntuación [15], y se calculó el índice de actividad de la enfermedad (DAI). DAI=(puntaje de pérdida de peso + puntaje de características fecales + puntaje de sangrado de sangre o hemorragia oculta fecal) / 3. Después del experimento, la longitud del colon del ratón se midió y fotografió.
2.2.3 Observación de la patología del tejido del colon
Parte del tejido de colon de ratón se fijó con poliformaldehído al 4%, incrustado en parafina, seccionado y teñido con hematoxilina-eosina (HE). La morfología patológica del tejido de colon de ratón se observó bajo un microscopio, y la puntuación patológica se calculó de acuerdo con el grado de pérdida de células de la cripta e infiltración de células inflamatorias [16].
2.2.4 Detección de niveles de factor inflamatorio en el tejido del colon
Parte del tejido de colon de los ratones se homogeneizó en hielo, y el homogeneizado se centrifugó en 3 500 r/min durante 15 minutos a 4 grados. Se recogió el sobrenadante y los niveles de IL -10, il -6, IL -1, TNF- y MPO en suero fueron detectados por el lector de microplacas de acuerdo con las instrucciones del kit.
2.2.5 Detección de la expresión de proteína diana del núcleo en el tejido del colon
Se tomó una cantidad apropiada de tejido de colon de 3 ratones de cada grupo. La expresión de proteínas de los objetivos centrales proyectados en función de la farmacología de la red fue verificada por Western Blot. El valor gris de las bandas de proteínas se analizó mediante el software Image J. -Actina se usó como referencia interna para calcular el nivel de expresión de cada proteína.
2.3 Métodos estadísticos
SPSS 22. El software 0 se utilizó para el análisis estadístico de los datos. Los datos cuantitativos se expresaron como X ± S, y la comparación entre múltiples grupos se realizó mediante análisis de varianza unidireccional, y la comparación entre dos grupos se realizó mediante la prueba LSD-T. El nivel de prueba =0. 05.
