Información mecanicista sobre la neuroprotección inducida por diosmina y la mejora de la memoria en un modelo de rata con ácido intracerebroventricular-quinolínico: resurrección de funciones mitocondriales y antioxidantes, parte 1

La neurodegeneración es el evento final después de una cascada de mecanismos patogénicos en varios trastornos cerebrales que conducen a pérdidas cognitivas y neurológicas. El ácido quinolínico (QA) es una excitotoxina derivada de la vía del metabolismo del triptófano y está implicada en varias dolencias, como el Alzheimer, el Parkinson, el Huntington y la psicosis.

A medida que las personas envejecen, la neurodegeneración se ha convertido gradualmente en un fenómeno común. La neurodegeneración puede tener efectos adversos en las capacidades físicas y mentales de las personas, especialmente en la memoria. Sin embargo, podemos frenar la neurodegeneración y mejorar la memoria mediante la acción.

En primer lugar, mantener una actitud positiva hacia la vida puede ayudar a aliviar la neurodegeneración. Los estudios han demostrado que una mentalidad positiva puede promover el crecimiento y la reconstrucción de las neuronas, mejorando así las funciones cognitivas de las personas. Después de todo, un estado de ánimo feliz tiene un impacto positivo en la salud del cerebro.

En segundo lugar, podemos mejorar la memoria y promover la regeneración neuronal mediante el ejercicio. El ejercicio adecuado puede estimular las neuronas del cerebro para establecer nuevas conexiones, mejorando así las capacidades cognitivas y de memoria de las personas. Además, en el caso de las personas mayores, el ejercicio también puede reducir el apetito nervioso que provoca la neurodegeneración, lo que ayuda a mantener la salud del cerebro.

Además, mantener la diversidad y el desafío de las actividades diarias también es una forma importante de mejorar la memoria. Las actividades diarias regulares y repetitivas harán que las actividades del cerebro sean muy mecánicas y monótonas. Por el contrario, las actividades diversificadas rejuvenecen el cerebro y mejoran las capacidades cognitivas y de memoria de las personas.

En resumen, aunque la neurodegeneración puede tener efectos adversos en la memoria de las personas, podemos tomar las medidas correspondientes para frenar este efecto. El pensamiento positivo, el ejercicio adecuado y diversas actividades pueden mejorar la memoria y promover la regeneración nerviosa. Valoremos y protejamos nuestros cerebros para mantenerlos sanos y jóvenes. Se puede ver que necesitamos mejorar la memoria. Cistanche puede mejorar significativamente la memoria porque también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento, que son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, Cistanche también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro obtenga suficiente nutrición y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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La diosmina (DSM) es un flavonoide natural que posee propiedades que pueden detener el curso de la progresión neurodegenerativa. En estudios anteriores, la eliminación de radicales libres, junto con las propiedades antihiperglucémicas, antiinflamatorias y vasoactivas del DSM, fueron pragmáticas. Por lo tanto, en los experimentos actuales, se investigó la actividad neuroprotectora del DSM en el prototipo de rata QA.

Se administró QA por vía intracerebroventricular (QA-ICV) en ratas el día uno, y DSM (50 y 100 mg/kg, vía intraperitoneal) desde el día 1 al 21. Memoria, marcha, funciones sensoriomotoras y biomarcadores de mutilación oxidativa. y se evaluaron las funciones mitocondriales en todo el cerebro. Los resultados mostraron un deterioro significativo del rendimiento sensoriomotor, la marcha y la memoria de trabajo y de largo plazo en ratas mediante QA-ICV. Estas anomalías de comportamiento se atenuaron significativamente con DSM (50 y 100 mg/kg) y donepezilo (fármaco estándar).

La disminución inducida por QA-ICV en la masa corporal (g), la dieta y la ingesta de agua también se atenuaron con los tratamientos con DSM o donepezilo. QA-ICV inhibió las actividades de los complejos mitocondriales I y II y provocó un aumento del estrés oxidativo y nitrosativo junto con una reducción de los antioxidantes endógenos en el cerebro. El DSM mejoró las funciones mitocondriales de forma dependiente de la dosis y disminuyó el estrés oxidativo en ratas tratadas con QA-ICV. El DSM puede ser una posible alternativa en el tratamiento de trastornos neurodegenerativos con patología de disfunción mitocondrial subyacente.

1. Introducción

La neurodegeneración progresiva con déficits cognitivos y neurológicos concomitantes son las principales manifestaciones de varias enfermedades cerebrales, como el Alzheimer (EA), el Parkinson (EP) y la enfermedad de Huntington (HD).

Disminución sináptica y deterioro de la potenciación duradera debido a la disminución de la expresión de neurotrofinas (p. ej., factores neurotróficos, calcineurina y factores de desarrollo neural), aberraciones neuroquímicas (p. ej., acetilcolina, glutamato, monoaminas y ácido c-aminobutírico), neuropéptidos (p. ej., oxitocina, sustancia P, somatostatina y orexina), y los cambios en el medio interno del cerebro conducen al deterioro de la memoria a corto y largo plazo [1].

Las vías excitatorias mediadas por receptores glutamatérgicos suelen estar asociadas a la consolidación de la memoria a largo plazo en el hipocampo y la corteza cerebral [2]. Los receptores como el N-metil D-aspartato (NMDAR) son un componente esencial de la potenciación y depresión duraderas, y la entrada de calcio a través de los NMDAR y los canales de calcio (Ca2+) dependientes de voltaje (VGCC) fortalece la sinapsis.

Sin embargo, el impulso excitador excesivo en el cerebro culmina en atrofia cerebral a través de radicales libres, citoquinas proinflamatorias y activación de vías de muerte celular [3, 4].

El ácido quinolínico (QA) es un producto de la vía de la quinurenina del metabolismo del triptófano y es un ligando endógeno de los NMDAR [5]. Aunque el triptófano es obligatorio para la biosíntesis de serotonina y triptamina, > 95% del triptófano se metaboliza a través de la vía de la quinurenina [6]. Los metabolitos de la vía de la quinurenina (p. ej., ácido quinurénico) son neuroactivos, incluido el QA, y están implicados en la esquizofrenia, la EA y la EH [7 ].

El control de calidad activa el sistema inmunológico (microglía y astrocitos), aumentando la expresión de factores quimiotácticos (p. ej., proteína quimioatrayente de monocitos-1, RANTES) e instigando los radicales libres. Un aumento en la penetrabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) previene el efecto protector contra QA, lo que predispone al cerebro a un exceso de entrada de QA. QA es un inhibidor metabólico que lo convierte en una potente neurotoxina [8].

El QA inhibe la monoaminooxidasa-B (MAO-B), la gluconeogénesis (a través de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa), la creatina quinasa, los complejos mitocondriales y la respiración celular, y disminuye los niveles de ATP [9].

El control de calidad puede aumentar el estrés oxidativo y disminuir los antioxidantes de una manera dependiente o independiente de NMDAR. La interacción QA-Fe2+ instiga los radicales libres, lo que lleva a la peroxidación lipídica y la mutilación del ADN, respaldada por un aumento de radicales hidroxilo, actividad de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) y actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) [10].

Los hallazgos clínicos también revelaron que la calidad del agua aumenta en el cerebro, la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR) de los pacientes con EA y EH [5]. Los hallazgos del pasado indican que el control de calidad puede inducir déficits cognitivos y otras anomalías del comportamiento en animales de experimentación [11].

Estudios recientes revelaron que los productos naturales podrían mejorar los síntomas de la disfunción cognitiva y mejorar el resultado terapéutico en los trastornos neurodegenerativos [12, 13]. Un glucósido flavonoide, diosmina (3′,5,7-trihidroxi-4′-metoxi flavona-7-ramnoglucósido), se encuentra frecuentemente en el pericarpio de los cítricos (Rutaceae) [14].

La diosmina (DSM) consta de un grupo disacárido (6-O-(-L-ramnopiranosil)- -D-glucopiranosilo) unido con el resto aglicona (diosmetina) a través de un enlace glicosídico y puede biosintetizarse a partir de hesperidina.

La flora intestinal transforma el glucósido DSM en un resto de aglicona, que luego se absorbe rápidamente a través del tracto gastrointestinal. En humanos, la vida media del DSM es de 26 a 43 horas cuando se administra por vía oral [15].

Es un fármaco vasoactivo que mejora la microcirculación y el drenaje linfático, y mejora la flexibilidad de las venas al atenuar el metabolismo de la noradrenalina mediante la catecol-O-metiltransferasa. El DSM anula la permeabilidad microvascular, la extravasación de leucocitos y la aparición de moléculas de adhesión, como ICAM-1y VCAM-1 [14, 15].

Varios estudios indicaron que el DSM tiene propiedades de armonización inmune y de eliminación de radicales libres en el cerebro [16, 17]. La evidencia clínica recomienda que DSMi es un fármaco bien tolerable, seguro y no tóxico [15]. En los nutracéuticos, a menudo se propone DSM (Daflon) para tratar trastornos venosos, incluidas las hemorroides y las afecciones hiperglucémicas.

Hallazgos anteriores indicaron que el DSM podría estimular la liberación de insulina de las células, el metabolismo de los carbohidratos y la expresión de los transportadores de glucosa (GLUT). Además, disminuye las complicaciones de la diabetes [15].

Atenúa la dislipidemia y la gluconeogénesis hepática [16]. En estudios anteriores, el DSM mejoró las funciones cognitivas, atenuó los síntomas de la esquizofrenia y mostró efectos neuroprotectores en animales de experimentación [16-19].

Sawmiller et al. [20], en un estudio, observaron una disminución mediada por DSM en la hiperfosforilación de amiloide y tau al atenuar la glucógeno sintasa quinasa 3 en el modelo 3 × Tg-ADmouse. Estos hallazgos significan acertadamente que el DSM tiene el potencial de mejorar las disfunciones cerebrales frente a la calidad. En este estudio, se utilizó QA para inducir demencia y otros déficits neurológicos en ratas.

El QA puede actuar como una potente neurotoxina que inhibe varias vías y mecanismos moleculares en el cerebro para inducir neurodegeneración progresiva y atrofia cerebral. La investigación contemporánea fue diseñada para explorar los resultados del DSM en el prototipo de rata QA-ICV.

2. Material y métodos

2.1. Animales experimentales.

.Esta investigación fue permitida por la AICE bajo el protocolo no. ASCB/IAEC/14/20/145. Se mantuvieron ratas albinas Wistar (de cualquier sexo, de 200 ga 250 g, de 8 a 9 meses de edad) en recintos cúbicos de polipropileno de tamaño típico bajo ajustes artificiales de temperatura (23 ± 2 grados), secuencias de luz/oscuridad de 12:12 horas, y Humedad (40 ± 10%) dentro del galpón institucional. Los roedores fueron alimentados con alimentos nutritivos estándar (Ashirwad Manufacturers, Punjab) y agua purificada a voluntad.

Todos los procedimientos con animales se realizan exclusivamente según las pautas de CPCSEA, GOI, Nueva Delhi. Los custodios y cuidadores de animales estaban cegados respecto de los diferentes regímenes terapéuticos facilitados a las cohortes de animales.

Se llevaron a cabo ensayos de investigación con animales, después de al menos una quincena de duración de familiarización. Todas las investigaciones con animales se realizaron entre 0900- y 1600- horas al día.

2.2. Medicamentos y productos químicos.

La diosmina (DSM: 520-27-4), el ácido quinolínico (QA: 89-00-9) y los analitos estándar se adquirieron de Merck (India). Dihidrógenofosfato de sodio (NaH2PO4), hidróxido de sodio (NaOH), fosfato de potasio dibásico (K2HPO4), nitrobluetetrazolio (NBT), metosulfato de fenacina (5-metilfenazinio metilsulfato), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), albúmina de suero bovino (BSA), {{ 7}}[4-(2-hidroxietil)piperazin-1-il]etanosulfónico (HEPES), 1,2-bis[2-[bis(carboximetil) amino]etoxi]etano (EGTA), riboflavina, cianuro de sodio (NaCN), natriumazida (NaN3), pirofosfato tetrasódico, peróxido de hidrógeno (H2O2), NADH disódico (DPNH), NADPH tetrasódico (sal tetrasódica reducida de coenzima II), ácido fosfórico, Reactivo de fenol (FCR) y ácido sulfosalicílico (5-SSA) de Folin y Ciocalteu (HiMedia Laboratories, Maharashtra, India); diglicina, ácido acético glacial (CH3COOH), reactivo de Ellman (3-carboxi-4-nitrofenildisulfuro, DTNB), azabenceno (C5H5N) y laurilsulfato de sodio (SLS) (LobaChemie, Mumbai, India); 4,6-Dihidroxi-2-mercaptopirimidina (2-TBA), carbonato disódico (Na2CO3) y acetato de yoduro de (2-mercaptoetil)trimetilamonio (TCI Chemicals, India); sulfato de zinc (ZnSO4), sal de Rochelle (L(+)-tartrato de sodio y potasio), diclorhidrato de 2-(1-naftilamino)etilamina, ácido nitroso y sodio (NaNO2) y p-aminobencenosulfonamida (SiscoResearch Laboratories, India). ); Se utilizó alcohol butílico (Fisher Scientific, India).

2.3. Inyección intracerebroventricular de ácido quinolínico.

Los animales se sometieron a anestesia administrándoles por vía intraperitoneal (ip) un cóctel de ketamina (90 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) utilizando agua estéril para inyección. El cuerpo fue colocado en decúbito prono sobre un cálido cojín térmico y en el soporte de un instrumento de cirugía estereotáxica se colocó la cabeza. Se hizo una incisión en el cuero cabelludo en el punto midsagital y se descubrió el cráneo retrayendo la piel.

Se eligió arbitrariamente cualquiera de los dos ventrículos laterales y, en el cráneo, se perforó el hueso parietal (coordenadas estereotáxicas -0. 8 mm anteroposterior del bregma, ±1,5 mm mediolateral de la sutura sagital media y ±3,6 mm dorsoventral de la superficie del hueso parietal ) para hacer un agujero de trépano [21].

El día uno, la solución de ácido quinolínico (QA) se constituyó recientemente (240 nmol) en PBS (Na+-K+ [PO4]2- solución salina tamponada, pH 7,4) y se inyectó gradualmente usando una microjeringa Hamilton a un caudal de 1 µl/minuto en el ventrículo cerebral izquierdo o derecho de ratas durante 5 a 6 minutos de duración con un volumen de inyección de 5 µl en vehículo ICV [22].

Después de la inoculación de todo el fármaco, la microaguja no se desalojó durante 4 a 5 minutos para permitir la difusividad del fármaco en el líquido cefalorraquídeo y frustrar su regurgitación. Se administró ICV con un volumen equivalente (10 µl) de vehículo PBS en shamrats que fueron operados de manera idéntica, sin embargo, no se inyectó QA.

Después de las inyecciones de fármacos, los orificios se restauraron utilizando un agente cementante (fosfato de zinc, PYRAX®) y se realizó la sutura de la piel. Para evitar la contaminación (crecimiento bacteriano), se aplicó Neosporin® pro re nata.

Para evadir la sepsis postoperatoria, se administró Orizolin (Zydus Cadila), una dosis de 30 mg/kg (ip). A cada rata se le proporcionó un ambiente cálido (37 ± 0,5 grados) para evitar la hipotermia posquirúrgica. A cada rata se le permitió comida semisólida (dentro de la jaula) y agua gratis después de la cirugía durante siete días y se alojó discretamente en una jaula distinta (30 × 23 × 14 cm3).

2.4. Protocolo experimental. Se inyectó DSM en dosis de 50y 100 mg/kg por peso corporal (pc) en ratas por vía intraperitoneal (ip) utilizando un vehículo de dimetilsulfóxido al 0,5% en solución salina normal (dosis-volumen 5 ml/kg) [17].

Los animales se asignaron aleatoriamente en 5 grupos en un modo simple ciego (n=5): (i) simulado (S), (ii) QA, (iii) QA + DSM50, (iv) QA + DSM100 y (v) QA. +DNP. Las ratas fueron sometidas a la administración intracerebroventricular de QA (QA-ICV) o cirugía simulada el primer día. DSM se administró durante 21 días consecutivos diariamente 120 minutos después de QA-ICV desde el primer día en adelante.

En este estudio se empleó donepezilo (DNP) como fármaco estándar y se inyectó (dosis de 3 mg/kg, ip) en ratas inyectadas con QAICV durante 21 días sucesivos. A los animales de los grupos simulados y de control de calidad se les administró vehículo ({3}} estéril. Dimetilsulfóxido al 5% en solución salina normal en dosis-volumen de 5 ml/kg) desde el día 1 al 21. Todo el estudio se realizó de acuerdo con el esquema descrito en Figura 1.2.5. Actividad locomotora.

En todos los grupos de ratas, la actividad locomotora media se documentó utilizando un dispositivo actofotómetro durante 5 minutos. Se colocó un animal separado en el actofotómetro durante 3 minutos de aclimatación. Luego se les dio a las ratas 5 minutos y los resultados se expresaron como recuentos por 5 minutos [11].

2.6. Rotarod Test. In rodents, the rotarod test typically evaluates the equilibrium and muscle synchronization facets of sensorimotor functions. .e rats were presented to acquisition trials until their ability to run reached >60 segundos en la varilla que gira a nueve rotaciones por minuto (rpm).

Después de las pruebas de adquisición, se colocó una rata separada en el eje cilíndrico y se aumentó la velocidad de revolución en un intervalo constante de 10 segundos desde 6 rpm (velocidad preliminar) a 30 rpm (velocidad final), durante 50 segundos. En los resultados se indicó la latencia de caída media (en segundos) del eje cilíndrico giratorio.

2.7. Análisis de Huella. El principio detrás del análisis de huellas en ratas es evaluar las anomalías de la marcha.

Para las huellas, las patas de rata se sumergieron en cuatro colorantes alimentarios no tóxicos de diversos colores y se les permitió correr en una pasarela inclinada (70 cm x 10 cm x 8 cm). La base de la pista estaba revestida con una lámina de celulosa de color blanco. Las ratas fueron motivadas a una sección cuesta arriba con poca luz al final de la pista para obtener huellas claras. El tinte se eliminó suavemente de cada animal usando agua tibia después de las pruebas. Se escanearon las huellas y se midió la "longitud de la zancada" utilizando una regla estándar. La longitud de la zancada se cuantificó calculando la distancia entre las ubicaciones secuenciales de la pata de rata idéntica [11].

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