Estudio mecanicista de la bebida Xian Fang Huo Ming a base de Cistanche en el tratamiento de la prostatitis crónica: farmacología de red integrada y validación experimental dirigida a la vía PI3K/Akt/NF-κB
Oct 27, 2025
2. Métodos
2.1 Farmacología de red y análisis de acoplamiento molecular
2.1.1 Identificación de componentes activos y objetivos de enfermedades
Utilizando la base de datos TCMSP, los compuestos activos de la bebida Xian Fang Huo Ming (XFHY) a base de Cistanche se evaluaron con criterios ADME: biodisponibilidad oral (OB) mayor o igual al 30 % y semejanza con el fármaco (DL) mayor o igual a 0,18. Los objetivos potenciales de estos compuestos se identificaron utilizando SwissTargetPrediction (probabilidad mayor o igual a 0,1). Se construyó una red "hierba-compuesto-objetivo" utilizando Cytoscape 3.9.1, y los cinco compuestos principales se identificaron según el grado de centralidad. Al mismo tiempo, se recopilaron objetivos de enfermedades relacionadas con CP/CPPS de GeneCards, OMIM y DisGeNET utilizando palabras clave como "prostatitis crónica" y "prostatitis".
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2.1.2 Identificación de objetivos de intersección
La intersección entre los objetivos compuestos XFHY y los objetivos de la enfermedad CP/CPPS se determinó utilizando el software Venny 2.1 para generar un diagrama de Venn, identificando objetivos terapéuticos potenciales clave.
2.1.3 Construcción de la red PPI
Los objetivos de intersección se importaron a la base de datos STRING (especie: Homo sapiens; puntuación de interacción> 0,9). La red de interacción proteína-proteína (PPI) resultante se importó a Cytoscape y los objetivos principales se identificaron utilizando CytoHubba en función de parámetros de topología de la red, como el grado, la intermediación y la cercanía.
2.1.4 Construcción de la red "Hierba-Compuesto-Objetivo-Vía"
Utilizando Cytoscape 3.9.1, se construyó un modelo de red para visualizar la relación entre XFHY, sus compuestos activos, objetivos y vías de señalización. Se analizaron los parámetros de la red para determinar los nodos clave.
2.1.5 Análisis de enriquecimiento GO y KEGG
Los objetivos de intersección se cargaron en la base de datos DAVID para el análisis de enriquecimiento de vías de Gene Ontology (GO) y Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (P <0,05). Los resultados se visualizaron mediante herramientas bioinformáticas.
2.1.6 Acoplamiento molecular
Los cinco compuestos principales (p. ej., quercetina, kaempferol) se utilizaron como ligandos y los diez objetivos principales de la red PPI como receptores. Las estructuras de proteínas se obtuvieron del Protein Data Bank (PDB), se preprocesaron con AutoDockTools 1.5.6 (incluida la deshidratación, la hidrogenación y la adición de carga) y se convirtieron al formato PDBQT. Las estructuras de ligando en formato MOL2 se obtuvieron de TCMSP y se convirtieron de manera similar. El acoplamiento molecular se realizó utilizando AutoDock y las afinidades de unión se visualizaron utilizando GraphPad Prism 8.
2.2 Experimento con animales
2.2.1 Establecimiento del modelo
Se utilizó un método de inducción química para modelar CP/CPPS. Las ratas fueron anestesiadas con pentobarbital sódico al 3% (50 mg/kg). Se realizó una incisión en la línea media en la parte inferior del abdomen y se inyectaron 80 μl de λ-carragenano al 3% en cada lóbulo lateral de la próstata (160 μl en total). Las ratas operadas de forma simulada recibieron inyecciones de solución salina. Los cuidados postoperatorios incluyeron la aplicación de antibióticos tópicos. El día 7, el éxito del modelado se confirmó mediante un examen macroscópico e histológico de la próstata (edema, congestión, degeneración epitelial e infiltración inflamatoria).
2.2.2 Agrupación y Tratamiento
Setenta ratas SD macho se dividieron aleatoriamente en siete grupos (n=10):
controles normales
Operación simulada
Control de modelo
Grupos XFHY de dosis baja, media y alta
grupo tamsulosina
Las dosis se calcularon basándose en la dosis equivalente humana (7,29 g/kg/día). XFHY se administró mediante sonda oral a 0,3645 g/ml (baja) y 1,458 g/ml (alta). La tamsulosina se administró a 0,0018 mg/kg. Todos los tratamientos tuvieron una duración de 28 días, iniciándose 8 días después del modelado.
2.2.3 Evaluación Histopatológica
Los lóbulos prostáticos izquierdos se fijaron en paraformaldehído al 4%, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Los cambios histológicos se evaluaron bajo microscopía óptica.
2.2.4 ELISA para marcadores inflamatorios
La sangre extraída a través de la aorta abdominal se centrifugó y los niveles séricos de TNF-, IL-1 y COX-2 se midieron utilizando kits de ELISA según las instrucciones del fabricante.
2.2.5 qRT-PCR para expresión genética
El ARN total se extrajo del tejido prostático y se transcribió de forma inversa en ADNc. La PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos para PI3K, Akt y NF-κB p65. Se utilizó GAPDH como control interno. La expresión relativa se calculó utilizando el método 2^-ΔΔCt.
2.2.6 Western Blot para expresión de proteínas
La proteína se extrajo del tejido prostático congelado utilizando tampón RIPA. Después de la cuantificación, las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF y se sondaron con anticuerpos primarios contra PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt (Ser473/Thr308), NF-κB p65 y p-NF-κB p65. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP y detección ECL. Las intensidades de las bandas se cuantificaron utilizando ImageJ.
2.2.7 Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism 8 y se expresaron como media ± desviación estándar. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de LSD o la prueba de Dunnett para comparaciones de grupos múltiples. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1 Farmacología de red y acoplamiento molecular
Intersección compuesto-objetivo:912 objetivos compuestos y 2197 objetivos de enfermedades produjeron 374 objetivos superpuestos.
Principales compuestos identificados:Quercetina, kaempferol, pelargonidina, naringenina y byakangelicol, todos con conocidos efectos antiinflamatorios y antioxidantes.
Análisis del IPP:Los objetivos clave incluyeron TP53, AKT1, EGFR, TNF, IL6, STAT3, BCL2, CASP3, CCND1 y NFKB1.
Enriquecimiento GO y KEGG:Las vías enriquecidas incluyeron PI3K/Akt, MAPK, RAS y procesos biológicos relacionados con la inflamación.
Acoplamiento molecular:Se observaron fuertes afinidades de unión entre los objetivos principales y los compuestos principales (energía de unión menor o igual a -5,0 kcal/mol), lo que sugiere una alta bioactividad.
3.2 Validación experimental
3.2.1 Tinción HE
Las ratas del grupo modelo mostraron degeneración epitelial glandular, edema estromal e infiltración inflamatoria extensa. Los grupos tratados con XFHY mostraron una inflamación reducida, especialmente en los grupos de dosis media y alta.
3.2.2 Niveles de marcadores inflamatorios
En comparación con el grupo modelo, XFHY redujo significativamente los niveles séricos de TNF-, IL-1 y COX-2 (P <0,01), lo que indica eficacia antiinflamatoria.
3.2.3 Expresión genética (qPCR)
XFHY redujo significativamente los niveles de ARNm de PI3K, Akt y NF-κB p65 de manera dependiente de la dosis. Akt y p65 reducidos en dosis bajas únicamente; Los grupos de dosis media y alta mostraron una supresión más amplia.
3.2.4 Expresión de proteínas (Western Blot)
Los niveles de fosforilación de PI3K, Akt (Ser473, Thr308) y NF-κB p65 se elevaron significativamente en el grupo modelo y se redujeron en ratas tratadas con XFHY, especialmente en dosis medias y altas.
4. Discusión
Basándose en la experiencia clínica, este estudio confirma queXFHY basado en Cistanchetiene un notable efecto antiinflamatorio sobre CP/CPPS. La farmacología en red identificó compuestos activos clave, especialmentequercetina, con probadas propiedades antiinflamatorias y antioxidantes. El análisis del PPI destacó objetivos comoTNF, IL6, yAKT1, que son fundamentales para la inflamación en la prostatitis.
El análisis de KEGG sugirió la participación delPI3K/Akt/NF-κBvía de señalización ampliamente reconocida en la inflamación y la regulación inmune. XFHY puede ejercer efectos terapéuticos al inhibir esta vía, reduciendo así la expresión de citoquinas proinflamatorias.
Además, la fosforilación dual de Akt (Ser473 y Thr308) parece ser crítica para la activación de NF-κB. XFHY inhibió la fosforilación en ambos sitios, lo que sugiere una inhibición de la señalización de NF-κB a través de la supresión de Akt aguas arriba.
Conclusión
XFHY puede aliviar la CP/CPPS bloqueando la vía PI3K/Akt/NF-κB, reduciendo la expresión deIL-1 , TNF-, yCOX-2y mitigar las respuestas inflamatorias en el tejido prostático. La participación de la vía, en particular la fosforilación de Akt en Ser473 y Thr308, proporciona una posible explicación mecanicista de la eficacia de XFHY. Se necesitan más investigaciones para confirmar si PI3K/Akt/NF-κB es la vía definitiva a través de la cual XFHY ejerce su acción terapéutica.
Incompatibilidad:
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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