Los metanálisis identifican la metilación del ADN asociada con la función y el daño renal

edmund.chen@wecistanche.com

Crónicoenfermedad del riñones una carga importante para la salud pública. La proporción elevada de albúmina a creatinina en orina es una medida deDaño en el riñón,y se usa para diagnosticar y estadificarenfermedad del riñon. Ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de regulación relacionados conFunción del riñóny la enfermedad, llevamos a cabo un estudio de asociación de todo el epigenoma basado en la sangre para la tasa de filtración glomerular estimada (n=33,605) y la relación albúmina-creatinina urinaria (n=15,068) y detectamos 69 y siete sitios CpG donde la metilación del ADN se asoció con el rasgo respectivo. La mayoría de estos hallazgos mostraron asociaciones direccionalmente consistentes con los resultados clínicos respectivos de la enfermedad crónica.enfermedad del riñony albuminuria moderadamente aumentada. Asociaciones de la metilación del ADN conFunción del riñón, como CpGs en JAZF1, PELI1 y CHD2 fueron validados entejido renal. La metilación en PHRF1, LDB2, CSRNP1 e IRF5 indicó efectos causales enFunción del riñón. Los análisis de enriquecimiento revelaron vías relacionadas con la hemostasia y la migración de células sanguíneas para la tasa de filtración glomerular estimada, y la activación y respuesta de las células inmunitarias para los CpG asociados con la relación albúmina-creatinina urinaria.

Palabras clave:enfermedad del riñon; Daño en el riñón; Función del riñón; tejido renal; estructura renal

crónicoenfermedad del riñon(ERC) es una importante carga para la salud pública. Afecta a más del 10 por ciento de los adultos en todo el mundo y a más del 40 por ciento de las personas mayores de 70 años1,2. La ERC es una de las principales causas de muerte en todo el mundo3 y es uno de los principales contribuyentes a la morbilidad y mortalidad cardiovascular2,4,5. La ERC se define como la presencia sostenida de anormalidades deriñónestructura o función. losFunción del riñónlas medidas más utilizadas son la tasa de filtración glomerular, generalmente estimada a partir de las concentraciones de creatinina sérica (eGFR), y la relación albúmina-creatinina urinaria (UACR)6. El UACR elevado es una medida deDaño en el riñón, utilizado para diagnosticar y estadificar CKD7, y está asociado con diabetes e hipertensiónenfermedad del riñon8. Incluso una UACR moderadamente elevada es un factor de riesgo de enfermedades cardiovasculares, independientemente de otrasFunción del riñón markers such as eGFR9. Familial aggregation studies of CKD and eGFR revealed a substantial heritable component of up to 54%9–11. Only a small part of this heritability is attributed to classical monogenic diseases. Rather, CKD susceptibility is influenced by DNA sequence variants in many genes, environmental factors, and their interactions. Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified common variants at >400 loci genéticos que están asociados conFunción del riñón10,12,13. Las variantes del índice en los locus conocidos asociados con la TFGe explican aproximadamente el 8,9 % de la variación de la TFGe12.Un metanálisis reciente de GWAS de eGFR integró regiones de cromatina abierta con pequeños conjuntos de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)10. Los resultados de este estudio respaldan la importancia de la regulación transcripcional alterada como mecanismo que contribuye a la ERC. Para investigar la metilación del ADN, con respecto aFunción del riñón, se han llevado a cabo estudios de asociación de todo el epigenoma (EWAS) de eGFR y CKD. Como regulador clave de la transcripción que se puede evaluar de manera rentable y de alto rendimiento, la metilación del ADN se ha estudiado en sitios CpG (CpG) con resolución de base única. Anteriormente, realizamos un EWAS que incluyó a 4859 adultos de dos estudios basados ​​en la población e identificamos 18 sitios validados con metilación diferencial en sangre completa asociados con eGFR14. Aunque este estudio reveló información sobre los mecanismos reguladores de genes deriñónfunción, los CpG asociados explicaron solo el 1,2 por ciento de la variación de eGFR. Otros estudios previos se centraron en pacientes con ERC y/o pacientes con diabetes o pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, o estaban limitados por el pequeño tamaño de la muestra, la falta de replicación, la falta de ajuste para posibles factores de confusión o una combinación de estos14–19. Otros estudios se centraron en los patrones de metilación del ADN de diabéticosenfermedad del riñon(DKD) pacientes20–22.

LA CITANCHE MEJORARÁ LA ENFERMEDAD RENAL/RENAL

Aquí, llevamos a cabo un EWAS deFunción del riñónrasgos para identificar CpG adicionales relacionados con mecanismos reguladores de genes de importancia potencial para la ERC. Ampliamos el antiguo EWAS para eGFR y CKD aumentando sustancialmente el tamaño de la muestra a 33 605 personas. Además, incluimos UACR y albuminuria moderadamente aumentada (microalbuminuria) como rasgos adicionales. Los EWAS se realizaron en estudios predominantemente basados ​​en la población ajustando por sexo, edad, diabetes, hipertensión, índice de masa corporal (IMC), tabaquismo y las proporciones más abundantes de glóbulos blancos. Reproducimos nuestros resultados de EWAS en muestras separadas, relacionamos los sitios CpG con los niveles de expresión génica en diferentes tejidos, aplicamos los hallazgos a los resultados clínicos y evaluamos la causalidad entre la metilación del ADN yFunción del riñón(Fig. 1 complementaria).

Resultados

Características de la muestra del estudio. En esta investigación, 36 estudios con un total de 33.605 participantes contribuyeron a EWAS de eGFR y 15.068 a EWAS de UACR. Sus características agrupadas se muestran en la Tabla 1, y las descripciones de los estudios individuales se proporcionan en los Datos complementarios 1 y 2.

EWAS de eGFR y UACR.Investigamos la asociación deriñónrasgos con metilación del ADN en sangre a hasta 441 870 CpG, la superposición de CpG cubierta por Illumina MethylationnEPIC BeadChip y Illumina HumanMethylation450 BeadChip array, que se utilizaron para la medición en todos los estudios menos uno (Datos complementarios 3). Todos los estudios realizaron una limpieza de datos de matriz y aplicaron scripts desarrollados centralmente para la preparación de lariñónvalores de rasgos, que posteriormente se relacionaron con la metilación del ADN utilizando modelos de regresión lineal ajustados por covariables con valores de metilación como variable dependiente siguiendo protocolos de estudio preespecificados (ver Métodos). Observamos poca o ninguna inflación en el EWAS específico del estudio (eGFR inflación media=1.00, UACR inflación media=1.00, Datos complementarios 1 y 2). En un EWAS transétnico ajustado por múltiples variables, 69 CpG se asociaron significativamente con eGFR y se replicaron (Fig. 1A, Datos complementarios 4, ver Métodos), incluidos los informados previamente14. Los sitios replicados mostraron un patrón claro de metilación más baja (60 CpG, Pbinom=2.2E-10; Fig. 1A).

Fig. 1 Resultados EWAS de eGFR y UACR. Gráficos de Chicago de los resultados del estudio de asociación de todo el epigenoma (EWAS) para la tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) (A) y la relación albúmina-creatinina urinaria (UACR) (B) utilizando la muestra combinada de descubrimiento y replicación. Los sitios están ordenados por su posición cromosómica en el eje x, con su valor P –log10 de la prueba de Wald de asociación proporcionada en el eje y. Los CpG correlacionados positivamente con el rasgo se trazan en la parte superior, los sitios con correlación negativa en la parte inferior. Las líneas horizontales punteadas representan el nivel de significancia (valor P < 1.1e−7).="" los="" nuevos="" sitios="" replicados="" están="" coloreados="" en="" naranja,="" los="" sitios="" replicados="" conocidos="" están="" coloreados="" en="" turquesa="" y="" los="" sitios="" que="" se="" asociaron="" adicionalmente="" con="" el="" rasgo="" binario="" respectivo="">enfermedad del riñon[CKD]/microalbuminuria [MA]) están marcados con una cruz.

En el metanálisis, se observaron los valores de P más bajos para las asociaciones de eGFR conocidas, incluidas cg17944885 (ZNF788,=−1.75E−04, valor de P=8.7E−41), cg23597162 (JAZF1 ,=−1,48E−04, valor P=3,2E−24) y cg06158227 (ZSCAN29,=−1,08E−04, valor P=8 .7E−20)14, seguido de un nuevo hallazgo en cg20777437 (CDCP2,=−8.28E−05, valor P=1.1E−17). Los 69 CpG asociados a eGFR replicados por sí solos explicaron el 15,7 por ciento de la variación de eGFR en una muestra de estudio separada de 1888 participantes (ver Métodos). Al agregar todas las covariables (sexo, edad, diabetes, hipertensión, IMC, tabaquismo y proporciones de glóbulos blancos) al modelo de asociación, la proporción total de variación explicada en eGFR aumentó al 36,3 %, con una variación del 2,4 % atribuida a los 69 CpG. independientemente de las otras covariables.

En el análisis transétnico de UACR, siete CpG se asociaron y replicaron significativamente (Fig. 1B, Datos complementarios 5, ver Métodos). De los hallazgos, cg18181703 (SOCS3,=−2.58E−03, valor P=2.6E−13) y cg02711608 (SLC1A5,=−1.63 E-03, valor P=9.9E-13) tuvo los valores P de asociación de metanálisis más pequeños. En seis de los siete CpG, la metilación más baja se asoció con una UACR más alta. Debido a la cantidad de sitios replicados, el poder de la prueba binomial fue limitado (6 CpG, pbinom=0.13; Fig. 1B). Los CpG replicados explicaron el 3,9 por ciento y el modelo completo el 14,6 por ciento de la variación en los niveles de UACR, con un 0,07 por ciento atribuido a los CpG independientemente de las otras covariables.

Hubo una pequeña superposición entre el EWAS replicado y los loci GWAS informados anteriormente para eGFR (superposición=10 de 69; Datos complementarios 4) y UACR (superposición=1 de 7; Datos complementarios 5). No hubo superposición de CpG replicados entre eGFR y UACR, lo que indica perfiles de metilación de ADN específicos de rasgos en sangre. Incluso entre las 967 y 270 asociaciones sugestivas (valor P < 1e−05)="" de="" un="" metanálisis="" combinado="" de="" muestra="" de="" descubrimiento="" y="" replicación="" para="" egfr="" y="" uacr,="" respectivamente,="" solo="" 10="" sitios="" se="" superpusieron="" entre="" ambos="" rasgos.="" los="" resultados="" detallados="" de="" estos="" metanálisis="" para="" todas="" las="" asociaciones="" sugestivas="" se="" proporcionan="" en="" los="" datos="" complementarios="" 6="" (egfr)="" y="" 7="">Heterogeneidad de ascendencia y solidez de los hallazgos. Para evaluar si los resultados de la asociación en eGFR y UACR podrían ser impulsados ​​por una ascendencia específica, realizamos un metanálisis EWAS estratificado por ascendencia de muestras de ascendencia europea (EA) y ascendencia afroamericana (AA) con resultados de múltiples estudios que contribuyen a estos dos etnias Comparación de los resultados de asociación de los CpGs replicados en muestras de EA (Negar=23,671; nUACR=9806) con las muestras de AA (neGFR =

5019; nUACR = 1921) showed similar effect sizes (reGFR = 0.87, rUACR = 0.74). The effect directions of almost all replicated CpGs were concordant between the ancestries (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The only exception was the UACR association cg22304262 in SLC1A5 which, however, was not significant in AA (P-value = 0.39, Supplementary Fig. 2). This association, as well as the CpGs at JAZF1 and RPS10P7 for eGFR, showed significant heterogeneity (eGFR: P-value < 0.05/69, UACR: P-value < 0.05/7) between EA and AA association results (Fig. 2, Supplementary Data 4 and 5). The presence of common SNPs (minor allele frequency >{{0}}.05) en o dentro de 50 pb de los 69 CpG replicados se evaluó para evaluar si la presencia de SNP podría afectar la unión de la sonda. Se ubicaron cuatro sondas cerca de un SNP común (Datos complementarios 4; cg10960375-rs113564504; cg11544657-rs2083577; cg01817897-rs142643977; cg06930757-rs112223111), que, sin embargo, no se asociaron con ningún rasgo GWAS según el recurso PhenoScanner V2 (consultado el 12/02/2021, pGWAS < 5e−8,="" incluidos="" snp="" proxy="" con="" eur="" r²=""> 0,8)23. Esto indica que es poco probable que los resultados de EWAS se confundan con un rasgo común que se sabe que se relaciona conFunción del riñónpor la variación de la secuencia de ADN cercana. Se encontró que los SNP internos de la sonda que estaban a más de cinco bases del extremo 3' de la sonda tenían consecuencias insignificantes24.

Relación con ERC y microalbuminuria.De los 69 CpG asociados con eGFR, 53 también se asociaron con ERC prevalente en un metanálisis de 25,609 personas que incluyeron 2376 casos con una dirección de efecto consistente (valor P <0). 05/69;="" datos="" complementarios="" 4,="" figura="" complementaria="" 3a).="" la="" correlación="" entre="" la="" tfge="" y="" los="" efectos="" de="" la="" erc="" fue="" alta="" (r="−0,93;" fig.="" 3a).="" en="" una="" cohorte="" independiente="" de="" 551="" pacientes="" con="" erc,="" 65="" cpg="" fueron="" direccionalmente="" consistentes="" con="" el="" metanálisis="" de="" egfr="" y="" cinco="" replicaron="" (valor="" p="">< 0.05/69,="" r="0.77;" figura="" complementaria="" 4,="" datos="" complementarios="" 4,="" ver="" métodos).="" en="" la="" misma="" cohorte,="" los="" cpg="" asociados="" con="" egfr="" cg18194850="" (valor="" p="1.6E-5)" y="" cg07242931="" (valor="" p="2.3E-5)" también="" se="" asociaron="" con="" el="" tiempo="">insuficiencia renalo agudolesión renal(Datos complementarios 8, ver Métodos). Los siete CpG asociados con UACR también se asociaron significativamente con microalbuminuria en una muestra de 7279 individuos, incluidos 1186 casos con la misma dirección del efecto que para UACR (valor P < 0.05/7,="" r="" {{7}="" }.98;="" fig.="" 3b,="" datos="" suplementarios="" 5,="" fig.="" suplementaria="">

Correlación con la expresión génica. Para obtener información sobre los posibles mecanismos funcionales de los CpG asociados con eGFR y UACR, probamos la correlación de sus niveles de metilación de ADN con los niveles de ARNm de genes codificados en cis en sangre total y en monocitos sanguíneos (consulte Métodos, Datos complementarios 9 ). El conocido cg17944885 asociado a eGFR en el cromosoma 19 cerca de ZNF788 se asoció con el transcrito codificado por la proteína 439 con dedos de zinc distantes de 240 kb (ZNF439, Tabla 2). Además, la metilación de cg04864179 en el factor regulador de interferón 5 (IRF5) se asoció con las transcripciones de ARNm codificadas por IRF5 y la transportina 3 cercana (TNPO3) (Fig. 5A complementaria). De las asociaciones UACR, los dos CpG replicados cg02711608 y cg22304262 en el miembro 5 de la familia de transportadores de soluto 1 (SLC1A5) revelaron asociaciones significativas con los niveles de ARNm de SLC1A5, y cg23570810 en la proteína transmembrana inducida por interferón 1 (IFITM1) con sus transcripciones en cis (Tabla 2). Todos los resultados del análisis de expresión génica se proporcionan en Datos complementarios 9.

Efectos en el tejido renal.Evaluar si los efectos de metilación observados en la sangre se traducen entejido renal,aplicamos un modelo de regresión para probar las asociaciones de los CpG replicados para una asociación significativa (tasa de descubrimiento falso (FDR) <0.05) y dirección consistente con eGFR yriñónfibrosis, respectivamente, en 506 microdiseccionadostejido renalmuestras En estas muestras,riñón-La metilación del ADN basada en tejidos de CpG asociados a eGFR replicados cg23597162 en JAZF1, cg26099045 cerca de PELI1 y cg12644285 en CHD2 se asoció significativamente con eGFR con la misma dirección de efecto que en la sangre (Figura complementaria 6A, Tabla 2, Datos complementarios 10) . Además, el mismo CpG en PELI1 y seis adicionales

(cg20146909 en LRRC8D, cg25767870 cerca de FAM46C, cg16618493 en ZBTB7B, cg10632966 cerca de RPEL1, cg01068906 en NOD2 y cg03297731 en GDPD3) se asociaron con fibrosis en elriñónmuestras de tejido con direcciones de efecto consistentes (es decir, inversas) (Fig. 6B complementaria, Tabla 2). De los sitios UACR replicados, los niveles de metilación del ADN enriñónEl tejido de cg00008629 en PTBP3 y cg24859433 cerca de IER3 se asoció con fibrosis y mostró la misma dirección de efecto (Fig. 6D complementaria, Tabla 2). De acuerdo con los hallazgos de EWAS, no se encontró una asociación significativa de los CpG asociados con UACR con eGFR en los donantes de muestras de riñón (Figura complementaria 6C, Datos complementarios 10).

Efectos causales entre la metilación del ADN yFunción del riñónrasgos. Para evaluar si elFunción del riñónlos rasgos afectan causalmente a la metilación del ADN o viceversa, realizamos un análisis de aleatorización mendeliana (MR) bidireccional de dos muestras de los CpG significativamente asociados. El análisis de MR de dirección directa sugirió que los CpGs cg02304370 (PHRF1), cg04460609 (LDB2), cg00501876 (CSRNP1) y cg04864179 (IRF5) influyen causalmente en los niveles de eGFR (Tabla 3). Las estimaciones de heredabilidad de estos cuatro CpG variaron entre los tres conjuntos de datos de poblaciones de ascendencia europea, pero fueron consistentemente más altas que la heredabilidad media en todos los CpG evaluados en cada uno de los tres estudios: 0,34 (eGFR CpG causal) frente a 0,16 (matriz HM450K) basado en Hannon et al.25, 0,55 vs 0,19 para Dongen et al.26 y 0,51 vs 0,19 para McRae et al.27. No se identificaron asociaciones causales significativas para ningún CpG asociado con UACR. Para la RM inversa, el único efecto significativo fue el de eGFR en cg23597162 (JAZF1) al usar el método de varianza inversa primaria. Sin embargo, no se identificaron/observaron efectos significativos en los múltiples análisis de sensibilidad de RM inversa. Los análisis de exclusión no mostraron ninguna indicación de que los resultados de la RM pudieran ser impulsados ​​por un solo SNP. Además, al excluir los SNP que se asociaron con la diabetes mellitus tipo 2 como un factor de riesgo importante paraenfermedad del riñonno dio lugar a resultados diferentes. Los resultados de todos los análisis de RM primarios y de sensibilidad se muestran en los Datos complementarios 11 y 12 y en la Fig. 7 complementaria. Los análisis de sensibilidad respaldan los hallazgos principales de los resultados de RM directos significativos (FDR <0.05, consulte="" métodos)="" con="" estimaciones="" de="" efectos="" consistentes="" en="" la="" dirección,="" lo="" que="" indica="" relaciones="" potencialmente="" causales="" entre="" la="" metilación="" del="" adn="" y="" la="" tfge,="" pero="" no="" al="">

Unión del factor de transcripción, análisis de marca de histonas y enriquecimiento de rutas. Realizamos análisis del sitio de unión del factor de transcripción, la marca de histonas y el enriquecimiento de la ruta basados ​​en los 967 CpG que mostraron una asociación sugestiva con eGFR (Pvalue < 1e−05;="" datos="" complementarios="" 6)="" y="" los="" 270="" cpg="" que="" mostraron="" asociaciones="" sugestivas="" con="" uacr="" (p-value="">< 1e−5;="" datos="" complementarios="" 7)="" en="" el="" metanálisis="" para="" maximizar="" el="" poder="" estadístico="" de="" los="" análisis="" de="" enriquecimiento="" (ver="" métodos)="" 14="" primero,="" evaluamos="" si="" los="" cpg="" asociados="" a="" egfr="" se="" asignaban="" preferentemente="" a="" los="" sitios="" de="" unión="" de="" 169="" factores="" de="" transcripción="" (tf)="" según="" la="" cromatina="" datos="" de="" secuenciación="" de="" adn="" de="" inmunoprecipitación="" (chip-seq)="" del="" proyecto="" encode="" que="" se="" agregaron="" mediante="" llamadas="" de="" consenso="" en="" 91="" tipos="" de="" células="" humanas="" (161="" pistas="" tf)="" y="" se="" complementaron="" con="">riñónpistas basadas en tejidos (ver Métodos). Después de la corrección de múltiples pruebas para 169 TF, ocho TF mostraron un enriquecimiento significativo para los CpG asociados con eGFR (FDR < 0="" .05;="" fig.="" 4a,="" datos="" complementarios="" 13),="" incluido="" cebpb="" (valor="" p="1)." 75e-06,="" pista="" de="" tejido="" cruzado)="" y="" ep300="" (valor="" p="7.49E-09," pista="" de="" tejido="" cruzado).="" esto="" es="" consistente="" con="" el="" hallazgo="" de="" chu="" et="" al.14="" en="" un="" subconjunto="" más="" pequeño="" de="" 4859="" participantes="" de="" los="" 33="" 605="" participantes="" analizados="" aquí.="" los="" cpg="" asociados="" a="" uacr="" se="" enriquecieron="" en="" sitios="" de="" unión="" de="" 56="" tf="" (fig.="" 4b,="" datos="" complementarios="" 14)="" con="" la="" asociación="" más="" fuerte="" para="" polr2a="" (valor="" p="6" .93e-19),="" fos="" (valor="" p="" {{32="" }}.28e−12)="" y="" ep300="" (valor="" p="">

RiñónLos CpG asociados a la función se enriquecieron ampliamente para varias marcas de histonas, con 82 de 195 combinaciones de tipos de células de marcas de histonas significativas (FDR q < 0="" .05)="" para="" egfr="" (fig.="" 4c,="" datos="" complementarios="" 15)="" y="" 79="" de="" 195="" para="" uacr="" (fig.="" 4d,="" datos="" complementarios="" 16).="" la="" modificación="" de="" histona="" h3k4me1,="" una="" marca="" concentrada="" en="" potenciadores="" activos="" y="" cebados,="" se="" enriqueció="" para="" todos="" los="" tipos="" de="" células="" para="" cpg="" asociados="" con="" uacr="" y="" casi="" todos="" los="" tipos="" de="" células="" para="" cpg="" asociados="" con="" egfr.="" mientras="" que="" los="" cpg="" asociados="" con="" uacr="" mostraron="" un="" enriquecimiento="" para="" la="" marca="" del="" promotor="" h3k4me3="" en="" 34="" tipos="" de="" células,="" solo="" cuatro="">

los tipos mostraron enriquecimiento para los sitios asociados con eGFR. Por el contrario, la marca H3K36me3 asociada al cuerpo del gen mostró un enriquecimiento mucho más amplio para los CpG asociados con eGFR (30 tipos de células) que los CpG asociados con UACR (cinco tipos de células). A diferencia de H3K3me1/3 y H3K36me3, que se han relacionado con genes activos (potenciadores, promotores activos, transcripción activa), H3K9me3 y H3K27me3, que generalmente se asocian con heterocromatina constitutiva y facultativa28–31, no se enriquecieron significativamente para UACR- CpG asociados en cualquier tipo de célula probado (Fig. 4D, Datos complementarios 16). Enriquecimiento de genes implicados porFunción del riñónLos CpG asociados se evaluaron en las bases de datos Gene Ontology (GO), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) y Reactome (ver Métodos) 32–35. Se observó un enriquecimiento significativo para 27 términos (25 GO, un KEGG, un Reactome; Datos complementarios 17, Fig. 5A) para eGFR, y 91 términos (87 GO, cuatro Reactome; Datos complementarios 18, Fig. 5B) para UACR (Fig. .5B). Las vías relacionadas con la migración específica del tipo de glóbulos blancos, la traducción del ARNm, la hemostasia y la coagulación, así como la respuesta a la insulina, mostraron un enriquecimiento significativo para los CpG asociados con eGFRa (FDR < 0.05;="" fig.="" 5a).="" las="" vías="" con="" los="" valores="" p="" de="" enriquecimiento="" más="" bajos="" para="" los="" sitios="" asociados="" con="" uacr="" estaban="" dominadas="" por="" la="" activación="" y="" respuesta="" de="" las="" células="" inmunitarias="" y="" las="" vías="" relacionadas="" con="" el="" interferón="" (fig.="" 5b).="" las="" vías="" adicionales="" que="" se="" enriquecieron="" incluyeron="" la="" migración="" de="" glóbulos="" blancos,="" como="" para="" los="" resultados="" de="" egfr="" (datos="" complementarios="">

Relación con asociaciones EWAS conocidas con otros rasgos. Dado el enriquecimiento observado de las vías relacionadas con la respuesta inmunitaria, los resultados de la metilación del ADN, incluidos los CpG cerca de los genes de la vía del interferón, y el hecho de que el estado de la metilación del ADN se evaluó predominantemente en los leucocitos, evaluamos si nuestros hallazgos pueden deberse a los efectos de confusión de la respuesta inmunitaria o el estado de inflamación. Por lo tanto, realizamos una búsqueda de los CpG replicados en un EWAS grande en niveles de proteína C reactiva (PCR) sérica de alta sensibilidad36. Solo dos CpG, que también se asociaron con la metilación del ADN y la eGFR entejido renal,cg09610644 en BDH1 y cg12644285 en CHD2, estaban entre los sitios asociados a CRP. Por lo tanto, parece poco probable una confusión general de nuestros resultados a través del estado inflamatorio estimado por PCR.

Algunos de losFunción del riñónLos CpG asociados identificados en este estudio están asociados con varios otros rasgos basados ​​en EWAS publicados. Veintiún sitios de eGFR se asociaron con la presión arterial, el consumo de alcohol, el IMC, el sexo, el receptor 2 del factor de necrosis tumoral soluble y/o el tabaquismo, y cinco sitios de UACR se asociaron previamente con el consumo de alcohol, el tabaquismo, el IMC, el nivel educativo, -glutamil transferasa, receptor 2 del factor de necrosis tumoral soluble, diabetes mellitus tipo 2 y/o varios metabolitos séricos (Tabla 2, Datos complementarios 19). Tres de estos CpG (todos sitios UACR) se asociaron con más de dos rasgos, a saber, cg02711608 en SLC1A5 (con -glutamil transferasa, -glutamiltreonina, IMC, consumo de alcohol), cg18181703 en SOCS3 (con diabetes mellitus tipo 2, tabaquismo, IMC , receptor 2 del factor de necrosis tumoral soluble) y cg24859433 cerca de IER3 (con tabaquismo, nivel educativo, 4-vinilfenol_sulfato). La Fig. 5B complementaria ejemplifica un CpG, cg26099045, que se correlacionó con eGFR y fibrosis entejido renalen nuestro análisis, y adicionalmente asociado con sexo y tabaquismo en EWAS previos. Finalmente, cg17944885 en ZNF788 también se asoció con eGFR en una muestra de pacientes con DKD22.

Discusión

En este EWAS deFunción del riñón, identificamos y replicamos los niveles de metilación del ADN en sangre de 69 CpG asociados con eGFR. De estos, 60 sitios no se informaron previamente, al igual que los siete CpG identificados en asociación con UACR. La mayoría de los CpG asociados con eGFR y UACR también se asociaron significativamente con sus resultados clínicos, es decir, CKD y microalbuminuria, y por lo tanto pueden tener el potencial para la estratificación de individuos en riesgo. La variación de eGFR atribuida a estos 69 CpG fue del 2,4 %, el doble de la de un EWAS14 anterior, y es comparable a la variación explicada por 29 SNP descubiertos por GWAS que incluían un tamaño de muestra tres veces mayor para el descubrimiento de locus37,38. Esto sugiere que la metilación diferencial del ADN en los CpG individuales cuantificados a partir de la sangre explica más la variación de la TFGe que los SNP comunes individuales en un tamaño de muestra determinado. Para UACR, parece que se requieren tamaños de muestra más grandes en comparación con eGFR para revelar una cantidad similar de CpG asociados a rasgos. Dado que la albúmina y la creatinina para el cálculo de UACR se miden en la orina en lugar de la cuantificación de la creatinina del suero para la estimación de la TFG, esta diferencia no es inesperada y está en línea con las observaciones de GWAS de estos rasgos10,13. Además, la variación genética parece afectar laFunción del riñónrasgos a través de vías diferentes a los cambios en la metilación del ADN. Esto está respaldado por la baja superposición entre los sitios EWAS y GWAS replicados para eGFR y UACR.

Este metanálisis EWAS incluyó muestras de diferentes poblaciones y etnias. Observamos una alta correlación de las estimaciones del efecto obtenidas de la gran submuestra de individuos EA con los efectos estimados en los individuos AA (Fig. 2). A pesar de la inclusión de datos de un número sustancial de personas de ascendencia no EA, los resultados generales del EWAS transétnico podrían estar impulsados ​​por datos de personas de ascendencia EA, que representaron el 70 por ciento (eGFR) / 65 por ciento (UACR) de nuestro estudio (Datos complementarios 3 y 4). Para abordar esta limitación, se necesitan análisis futuros con una mayor proporción de muestras no EA para una evaluación confiable y detallada de la heterogeneidad entre ascendencia. El potencial para traducir los conocimientos de EWAS de rasgos cuantitativos en la mayoría de los estudios basados ​​en la población a personas con la enfermedad se ilustra por el hecho de que las estimaciones del efecto en 65 de 69 CpG asociadas a eGFR se observaron en la misma dirección en una cohorte de 551 pacientes con ERC. apuntando hacia mecanismos aplicables a través de una amplia gama de niveles de eGFR (Fig. 3). Es más,

cg07242931 en MAN1C1 y cg18194850 en SUCLG2 no solo se asoció con eGFR, sino que predijo el tiempo parainsuficiencia renalo agudolesión renal(Datos Complementarios 8). Un GWAS en diabéticos sugirió más evidencia de una participación de SUCLG2, que codifica la subunidad - de la succinil-CoA sintetasa, en la enfermedad renal.enfermedad del riñonen indios americanos (SNP=rs4453858, valor P=2E−6)39. La variación genética en este gen también se asoció con los niveles urinarios de succinil-carnitina (C4DC, SNP=rs115560420, P-value=7E−15)40. C4DC es un producto metabólico del ciclo del ácido tricarboxílico, que se cataliza bajo la participación de la succinil-CoA sintetasa y niveles más altos de C4DC en sangre asociados con una eGFR41 más baja. Sin embargo, una búsqueda en los resultados de loci de rasgos cuantitativos de metilación (meQTL) de GoDMC (http://www.godmc.org.uk)42 no reveló una asociación significativa de estos dos SNP con cg18194850, lo que sugiere que no hay un vínculo directo entre estos SNP. y el sitio CpG.

Dado que la metilación del ADN es un importante regulador de la expresión génica, evaluamos la correlación de los sitios de metilación del ADN asociados a los rasgos con los niveles de ARNm de los genes en cis. Genes cuyos niveles de ARNm se correlacionaron significativamente conFunción del riñónlos sitios de metilación del ADN asociados estaban relacionados con las vías del interferón (tanto para eGFR como para UACR). Aunque estos hallazgos concuerdan con los resultados de enriquecimiento de la ruta para UACR (Fig. 5B, Datos complementarios 18), el número de correlaciones significativas entre los CpG asociados con UACR y los niveles de transcripción es bastante bajo. Esto no sorprende considerando el tamaño de muestra relativamente pequeño de 1915 individuos disponibles para este análisis y la cobertura limitada del recurso transcriptómico. Curiosamente, entre los hallazgos significativos para UACR, dos CpG en el miembro 5 de la familia de transportadores de soluto 1 (SLC1A5) se asociaron con la expresión génica diferencial y también con la presión arterial. Por lo tanto, la metilación del ADN en SLC1A5, que codifica un transportador de aminoácidos neutros dependiente de sodio, podría ser un elemento adicional que contribuya a la correlación conocida entre UACR y la presión arterial.

Las transcripciones significativas expresadas diferencialmente no siempre fueron codificadas por el gen más cercano (cg17944885 cerca de ZNF788), o un sitio CpG se correlacionó con múltiples genes en cis (cg04864179 en IRF5). En particular, es notable la correlación de la metilación del ADN en cg04864179 con los niveles de transcripción de IRF5. Teniendo en cuenta el resultado de RM significativo de este CpG con eGFR, la metilación del ADN en IRF5 podría influir causalmente en eGFR mediada por su expresión génica. Teniendo en cuenta la transformación de rasgos de las asociaciones genéticas subyacentes (ver Métodos), observamos que un aumento en la metilación del ADN de diez desviaciones estándar resultó en un 3,2 por ciento más de eGFR. Aunque este efecto estimado es muy pequeño, una influencia causal de los patrones de metilación en las células sanguíneas en la ERC también fue respaldada por RM basada en resumen con un conjunto de datos de meQTL diferente en un estudio reciente, donde el efecto causal fue direccionalmente consistente con nuestros resultados22. Al aplicar la colocalización de múltiples rasgos, también demostraron que los efectos genéticos de este locus en la eGFR estaban mediados por la metilación de IRF5 y la expresión génica en la sangre. Además, se demostró la colocalización de la expresión del gen IRF5 con eGFR en los compartimentos tubular y glomerular deriñóntejido43. Sin embargo, al interpretar el efecto causal observado en nuestro estudio, debe tenerse en cuenta que los análisis de RM para CpG cg04864179 mostraron una heterogeneidad significativa (p < 0,05)="" entre="" los="" instrumentos="" (datos="" complementarios="" 11="" y="" figura="" complementaria="" 7="">

IRF5 codifica un miembro de la familia del factor regulador de interferón (IRF). El grupo de miembros de la familia IRF contiene factores de transcripción con diferentes funciones, como la modulación de la actividad, el crecimiento y la diferenciación del sistema inmunitario, así como el control de la expresión génica para la respuesta del interferón a las infecciones virales. IRF5 puede influir en la respuesta de las células inmunitarias. Múltiples estudios respaldan que los cambios en la metilación de IRF5 podrían afectarFunción del riñóna través de vías inmunitarias: los SNP en IRF5 están asociados con LES a través de cambios en la expresión de IRF5 en monocitos sanguíneos44–46. El LES es una enfermedad autoinmune caracterizada por una activación de la vía del IFN que puede afectar elriñonescomo nefritis lúpica47. Inhibición de la hiperactivación de IRF5 en un modelo de ratón de LES protegido del inicio y la gravedad de la nefritis lúpica, y mejoradoFunción del riñóny patología48,49. Aunque nuestro EWAS no se centró en el estudio de pacientes con LES, los pequeños efectos de la metilación de IRF5 en los resultados relacionados con el riñón, mediados al menos parcialmente por su expresión y las vías subsiguientes de IFN, podrían detectarse como efectos en la TFGe en la población general.

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Varios de los CpG asociados con eGFR para los cuales se cuantificó la metilación del ADN de las células sanguíneas también se asociaron con eGFR yriñónfibrosis cuando se cuantificó la metilación del ADN a partir deriñóntejido, aunque el tamaño de la muestra fue sustancialmente más pequeño en comparación con el conjunto de datos EWAS. Esto sugiere que al menos algunos de los hallazgos obtenidos de la sangre se pueden traducir a un tejido diana específico de rasgo adicional. Aquí, sangre yriñónson los dos principales tejidos diana específicos del rasgo, ya que elfuncióndelriñónes la filtración de la sangre para eliminar los desechos. Análisis de enriquecimiento de laFunción del riñónlos CpG asociados indicaron un papel central en la regulación transcripcional. Encontramos un enriquecimiento generalizado de H3K4me1/3 y H3K36me3. H3K4me1/ 3 está vinculado a potenciadores activados y activados, así como a promotores activos, y H3K36me3 está estrechamente relacionado con regiones transcritas del genoma50. El papel de la regulación transcripcional está respaldado por la señal de enriquecimiento del factor de transcripción más fuerte de los CpG asociados con UACR, que es POLR2A, la subunidad más grande de la enzima principal que sintetiza el ARNm en eucariotas.

Las posibles limitaciones relacionadas con los análisis de MR incluyen que no se disponía de instrumentos válidos para todos los CpG para el MR directo. Dado que todos los instrumentos de un CpG se seleccionaron de regiones cis, es decir, de la misma región genética, es probable que todos los instrumentos de un CpG sean válidos o inválidos, lo que limita el número de métodos de RM diferentes que se pueden aplicar para probar el robustez de los resultados51. El MR inverso tenía un poder limitado debido al pequeño tamaño de muestra disponible para la estimación de las asociaciones de metilación de SNP-ADN. Los estudios de meQTL más grandes, como el GoDMC, no pudieron almacenar los resultados de asociación para todos los SNP (es decir, por encima de un límite de valor P de asociación determinado) debido a razones técnicas y, por lo tanto, no se pudieron utilizar para la RM inversa de dos muestras. Por lo tanto, los hallazgos no significativos deben interpretarse con cuidado. Además, es difícil interpretar el tamaño del efecto causal, ya que las asociaciones genéticas subyacentes se calculan en la escala de desviación estándar de los niveles de metilación del ADN. Otra limitación potencial del estudio es que eGFR, CKD y UACR son fenotipos estimados a partir de diferentes parámetros subyacentes y tienen influencias multifactoriales. Por lo tanto, realizamos varios análisis para asegurarnos de que nuestros resultados de EWAS no fueran impulsados ​​por factores de confusión conocidos, incluida la diabetes tipo 2, un posible factor de confusión de la relación entre DNAm yFunción del riñón. Primero, las asociaciones EWAS en cada cohorte se ajustaron por factores de confusión para eliminar sus efectos dentro de una cohorte. En segundo lugar, los EWAS se realizaron en cada cohorte por separado y luego se metanalizaron, lo que corresponde a un ajuste, por ejemplo, para la prevalencia de diabetes en las cohortes. Finalmente, verificamos las asociaciones de nuestros CpG replicados dentro de los estudios EWAS de diabetes publicados. De todas nuestras asociaciones de CpG replicadas, solo la CpG cg18181703 asociada a UACR en SOCS3 mostró una asociación con la diabetes tipo 2. Esta CpG también se asoció con el tabaquismo, el IMC y los niveles en sangre del receptor soluble del factor de necrosis tumoral 2. Teniendo en cuenta que nuestro EWAS también se ajustó para el tabaquismo y el IMC, asumimos que los efectos de cg18181703 en UACR están en menos parcialmente independiente de la diabetes tipo 2, el IMC y el tabaquismo. Si bien controlamos varios de estos factores conocidos, otros factores, como las covariables no medidas, no pudieron ajustarse explícitamente en los análisis y pueden influir en los hallazgos.

Se necesitan más estudios EWAS con tamaños de muestra aumentados y con metilación del ADN cuantificada a partir de tejidos adicionales, así como análisis funcionales para ampliar nuestro conocimiento sobre los mecanismos reguladores deFunción del riñóny, en última instancia, mejorar la predicción y el tratamiento deriñónenfermedad. Esto es cierto específicamente para UACR, dado el menor número de asociaciones CpG significativas observadas. En resumen, este metanálisis EWAS a gran escala amplió sustancialmente el número de CpG asociadas de forma reproducible con eGFR y CKD y reveló siete asociaciones para UACR y microalbuminuria. La metilación del ADN en estos sitios explicó una gran proporción de la variación de eGFR, y la metilación diferencial en cuatro CpG mostró evidencia de una posible relación causal con eGFR. Caracterización integral de CpG replicados entre pacientes con ERC, entejido renal,para la expresión génica diferencial y para las vías enriquecidas y las marcas epigenéticas proporcionan información sobreFunción del riñón-regulación transcripcional asociada.

Métodos

Visión general.Establecimos un metanálisis colaborativo basado en un modelo de datos distributivos y procedimientos de control de calidad. Para maximizar la estandarización del fenotipo entre los estudios, se crearon y proporcionaron un plan de análisis y un script de línea de comandos (https://github.com/generic-Freiburg/Skagen-pheno/tree/ckdgen-ewas-pheno) a todos los estudios participantes ( predominantemente estudios basados ​​en la población; Datos complementarios 1 y 2). Los archivos de resumen generados automáticamente se comprobaron de forma centralizada. Tras la aprobación del fenotipo, los estudios ejecutaron su EWAS y cargaron los resultados y agregaron información sobre la metilación del ADN en un servidor central. El control de calidad de EWAS se realizó con scripts personalizados para evaluar la inflación, los controles positivos, la distribución de las sondas CpG y comparar entre estudios las distribuciones generales de los tamaños del efecto, los errores estándar y los valores de p. Todos los protocolos de estudio fueron aprobados por los respectivos comités de ética locales. Todos los participantes en todos los estudios dieron su consentimiento informado por escrito.

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Definición de fenotipo.Los valores de creatinina obtenidos con el ensayo de Jaffé antes de 2009 se calibraron multiplicándolos por 0,9552. Los estudios estimaron la TFG con el ChronicEnfermedad del riñonEcuación de Epidemiology Collaboration (CKD-EPI)53. La TFGe se winsorizó a 15 y 200 ml min−1 por 1,73 m2. La ERC se definió como una TFGe inferior a 60 ml min−1 por 1,73 m2. Los valores de UACR medidos en mg/g se transformaron logarítmicamente antes de todos los análisis. La microalbuminuria se definió como 1 para UACR > 30 mg/g y como 0 para valores de UACR < 10="">

Cuantificación y control de calidad de la metilación del ADN.Para la cuantificación de la metilación del ADN, se extrajo ADN genómico de sangre periférica. Los niveles de metilación del ADN se cuantificaron utilizando la matriz Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC), la matriz Illumina Infinium HumanMethylation450K BeadChip (HM450K) o la matriz Illumina Infinium HumanMethylation27 BeadChip (HM27K). El preprocesamiento de los datos de metilación del ADN se realizó de acuerdo con los protocolos de estudio individuales, incluida la corrección de fondo, la normalización cuantil, el filtrado de sondas, el filtrado de muestras, la coincidencia de SNP con las ubicaciones de las sondas de control de SNP, el filtrado de valores atípicos y la corrección del tipo de ensayo (Datos complementarios 3). El nivel de metilación en cada sitio se representó y analizó como valor. Se anotaron las sondas CpG que se superponen con los SNP. Cada estudio calculó la media y la desviación estándar de cada sitio de CpG y estas estadísticas resumidas se compararon entre estudios en busca de diferencias sistemáticas entre los CpG y se les dio seguimiento con analistas de estudios individuales.

Evaluación de covariables.La metilación del ADN y las covariables se midieron en la misma visita/tiempo. La diabetes prevalente se definió como glucosa plasmática en ayunas mayor o igual a 126 mg/dl, glucosa plasmática sin ayuno mayor o igual a 200 mg/dl, tratamiento para la diabetes o autoinforme de un diagnóstico de diabetes. La hipertensión prevalente se definió como presión arterial sistólica mayor o igual a 140 mm Hg, presión arterial diastólica mayor o igual a 90 mm Hg o tratamiento para la hipertensión. Si la presión arterial medida no estaba disponible, la hipertensión se definió por autoinforme. El estado actual de tabaquismo se definió utilizando información autoinformada. El IMC (kg/m2) se calculó utilizando medidas de peso y altura evaluadas en cada estudio. La edad se incluyó como valor continuo en los modelos de asociación. La estructura de la población en los estudios no familiares se ajustó por componentes genéticos principales (PC). Las proporciones de los tipos de glóbulos blancos se estimaron en función de la metilación del ADN54. Las covariables técnicas adicionales incluyeron la sonda de control PCs55, el centro de estudio, el lote de procesamiento, la ID de la matriz de sentido y la posición del sentido.

Métodos estadísticos y metanálisis. Para garantizar una potencia comparable entre los sitios analizados, solo se incluyeron en los análisis las CpG autosómicas medidas tanto por EPIC como por HM450K. Cada estudio realizó análisis de regresión lineal separados por grupos de ascendencia. Para evaluar la solidez de los resultados de EWAS, los análisis se limitaron a estudios y submuestras de individuos de ascendencia europea. Los valores de metilación del ADN se modelaron como variables dependientes, siendo el rasgo valores continuos de eGFR o UACR o variables binarias de CKD o microalbuminuria: metilación del ADN ~ rasgo más sexo más edad más PC genéticos más proporciones de glóbulos blancos más covariables técnicas más diabetes más hipertensión más IMC más tabaquismo actual Los participantes necesitaban información completa para todas las variables y estadísticas de resumen del estudio y se incluyeron solo si se disponía de un mínimo de 50 participantes para eGFR/UACR y 50 casos/controles para CKD/microalbuminuria, respectivamente. Cada EWAS específico del estudio se ajustó por inflación antes del metanálisis mediante el enfoque BACON si la inflación estimada era mayor o igual a uno (Figura complementaria 8)56. Los estudios se dividieron en descubrimiento y replicación por orden cronológico de contribución al metanálisis del Consorcio CKDGen (Datos complementarios 1 y 2). Se realizó un metanálisis ponderado de varianza inversa de efectos fijos tal como se implementó en el paquete R 'metafor' (versión 2.1-0) para estudios de descubrimiento, estudios de replicación y para las estimaciones del efecto resultante del descubrimiento y la replicación. Los CpG se excluyeron si menos de la mitad del tamaño de muestra respectivo estaba disponible en el descubrimiento o la replicación o si la estimación de heterogeneidad de I2 era superior al 95 por ciento. La replicación exitosa de un CpG asociado se definió como la dirección consistente de las estimaciones del efecto entre el descubrimiento (neGFR disc=22,347, nUACR disc=11,458) y la replicación (neGFR repl=11,258 , nUACR repl=3610) metanálisis, una significancia ajustada por Bonferroni del valor P del descubrimiento (pdisc)<1.1e−7 (#cpgs="" egfr="441,870," #cpgs="" uacr="441,854)," nominal="" significance="" of="" the="" replication="" p-value="" (prepl)=""><0.05, and="" a="" combined="" discovery="" and="" replication="" p-value="" (pcomb)=""><>

Análisis de expresión génica.los efectos de laFunción del riñónSe probaron los CpG asociados a rasgos en busca de asociaciones con la expresión génica en sangre utilizando dos conjuntos de datos: (1) niveles de ARNm de monocitos de 1202 participantes del estudio MESA, y (2) ARNm de sangre total de 713 individuos del estudio Estudio KORA F4 57,58. Como paso inicial, se realizó una búsqueda de los niveles de metilación de CpG con los niveles de ARNm disponibles en los resultados de asociación del estudio MESA. Para esta búsqueda, estaban disponibles los resultados de la asociación con un valor P < 1e{{10}}.="" el="" análisis="" se="" describió="" en="" detalle="" en="" kennedy="" et="" al.59.="" brevemente,="" la="" expresión="" génica="" se="" evaluó="" con="" illumina="" humanht-12="" v3.0="" y="" v4.0="" expression="" beadchips,="" y="" la="" metilación="" del="" adn="" con="" la="" matriz="" illumina="" hm450k.="" los="" valores="" de="" expresión="" se="" normalizaron="" utilizando="" la="" transformación="" de="" estabilización="" de="" la="" varianza.="" 13.933="" transcripciones="" de="" las="" matrices="" v3.0="" y="" v4.0,="" que="" se="" expresaron="" significativamente="" por="" encima="" de="" los="" niveles="" de="" fondo="" (valor="" p="" de="" detección="">< 0,01)="" en="" al="" menos="" el="" 5="" %="" de="" los="" sujetos.="" los="" análisis="" de="" asociación="" en="" mesa="" se="" realizaron="" como="" un="" modelo="" mixto="" lineal="" utilizando="" valores="" de="" expresión="" génica="" transformados="" logarítmicamente="" como="" variable="" dependiente,="" valores="" beta="" de="" metilación="" del="" adn="" como="" variable="" independiente="" con="" la="" edad,="" el="" sexo,="" el="" origen="" étnico="" y="" el="" centro="" de="" estudio="" agregados="" como="" covariables="" en="" el="" modelo.="" se="" realizó="" una="" segunda="" prueba="" de="" asociación="" en="" el="" conjunto="" de="" datos="" kora="" f4.="" la="" asociación="" del="" nivel="" de="" metilación="" en="" los="" cpg="" replicados="" con="" los="" niveles="" de="" expresión="" génica="" de="" los="" genes="" dentro="" de="" una="" vecindad="" de="" ±500="" kb="" se="" calculó="" utilizando="" los="" niveles="" de="" arnm="" transformados="" logarítmicamente2-obtenidos="" de="" la="" matriz="" de="" expresión="" génica="" illumina="" human="" ht-12v3.="" los="" valores="" de="" expresión="" génica="" se="" sometieron="" a="" regresión="" sobre="" los="" valores="" beta="" de="" metilación="" del="" adn="" ajustados="" por="" sexo="" y="" edad.="" antes="" del="" análisis,="" los="" factores="" técnicos,="" así="" como="" las="" proporciones="" de="" los="" tipos="" de="" células="" sanguíneas,="" se="" extrajeron="" de="" los="" niveles="" de="" metilación="" del="" arnm="" y="" el="" adn,="" y="" sus="" residuos="" se="" incluyeron="" en="" el="" modelo="" de="" asociación="" final.="" los="" controles="" de="" anotación="" y="" control="" de="" calidad="" de="" las="" sondas="" de="" expresión="" génica="" se="" basaron="" en="" la="" tabla="" proporcionada="" por="" schurmann="" et="" al.60.="" asociaciones="" de="" expresión="" del="" gen="" cpg="" en="" la="" sangre="" que="" estaban="" disponibles="" en="" los="" resultados="" de="" mesa="" y="" tenían="" un="" valor="" p="" de=""><0.05 in="" kora="" f4="" with="" consistent="" effect="" direction="" were="" considered="" as="" significant.="" all="" gene="" expression="" probes="" passed="" the="" annotation-based="" quality="" control="">

Metilación del ADN en tejido renal.Los análisis que utilizan la metilación del ADN entejido renalcon eGFR y fibrosis se realizaron utilizando datos de 506 microdiseccionadostejido renalmuestras utilizando Illumina EPIC BeadChip. Las muestras de tejido renal se recolectaron por separado y son distintas de las muestras de sangre que se analizaron en el metanálisis EWAS. Estas muestras se recolectaron de porciones no afectadas de nefrectomías tumorales y se prepararon como se describió antes 61. En resumen, se usó el software SeSAMe62 para realizar el preprocesamiento y el control de calidad, incluida la detección basada en baja intensidad, la corrección de sangrado en la sustracción de fondo, la corrección de sesgo de colorante no lineal, control para la conversión de bisulfito, cálculo de valores beta y estimación de la fracción de leucocitos. Los valores beta de CpG asociados con eGFR y UACR y la información clínica se extrajeron para el análisis de asociación. Se aplicó un modelo de regresión para probar las asociaciones de betas de metilación del ADN de los CpG finales como variables dependientes con eGFR y niveles de fibrosis, respectivamente, como variables independientes ajustadas por sexo, edad, PC genéticos (1–5), estado de diabetes, estado de hipertensión , IMC, ID de matriz de sentrix, posición de sentrix y control de conversión de bisulfito y fracción leucocitaria estimada.

Investigaciones específicas de sondas de eGFR en pacientes con ERC. La asociación de las 69 CpG validadas y asociadas a eGFR de la población general con eGFR en el German ChronicEnfermedad del riñon (GCKD) study was evaluated after correcting for the number of evaluated sites, and statistical significance was defined as Pvalue < 7.2E−4 (0.05/69). The GCKD study is a prospective observational study of patients with CKD63. Briefly, 5217 adult patients under nephrological care provided written informed consent and were enrolled from 2010 to 2012. Inclusion criteria were eGFR between 30 and 60 ml min−1 per 1.73 m2 or an eGFR of >60 ml min−1 per 1.73 m2 with UACR > 300 mg g−1 (or a urinary protein–creatinine ratio of >500 mg g−1). El seguimiento de los pacientes para los criterios de valoración clínicos aún está en curso. Los criterios de valoración del estudio se registran continuamente de forma estandarizada según las cartas de alta hospitalaria y los certificados de defunción e incluyen eventos relacionados con los riñones y la muerte. El diseño del estudio y la población de estudio reclutada se describen con más detalle en publicaciones anteriores63,64. El estudio GCKD fue aprobado por los comités de ética locales y registrado en el registro nacional de estudios clínicos (DRKS 00003971). Un subconjunto de 559 pacientes con ERC atribuida a lupus eritematoso sistémico, nefropatía membranosa, glomeruloesclerosis focal y segmentaria o enfermedad poliquística autosómica dominante.enfermedad del riñonse seleccionó para la cuantificación de la metilación del ADN y se midió con la matriz Infinium MethylationEPIC BeadChip (EPIC). La asociación con eGFR se evaluó de manera análoga al análisis principal (consulte Métodos estadísticos y metanálisis), además del ajuste por tabaquismo, que se codificó 0/1/2 para los fumadores actuales/exfumadores/nunca. Evaluar la asociación de la metilación del ADN con el tiempo parainsuficiencia renaldesde el ingreso al estudio, se ajustaron modelos de regresión de Cox para cada CpG, y de manera análoga para un criterio de valoración combinado deinsuficiencia renaly agudolesión renalAdemás del predictor de metilación del ADN, los modelos se ajustaron por edad, sexo y subtipo de ERC. El modelo de regresión de Cox proporciona estimaciones de la razón de riesgo (HR) específica de la causa en presencia de eventos competitivos, es decir, cualquier otra muerte excepto la muerte relacionada con el riñón. Además, se llevaron a cabo análisis de riesgos de subdistribución para evaluar los posibles efectos indirectos a través del evento competitivo. La suposición de riesgos proporcionales se evaluó con base en los residuos de Schoenfeld escalados. La evaluación gráfica de los dos CpG asociados no reveló evidencia de violaciones importantes (Fig. 9 complementaria).

Gráficos de asociación regional y anotación. Los gráficos para la Fig. 5 complementaria se crearon utilizando los paquetes 'Gviz' 65 y 'rtracklayer' 66 R. Se incluyeron en el gráfico un máximo de 40 sitios dentro de 50,000 pb aguas arriba o aguas abajo del sitio CpG de interés. Si el intervalo contenía más de 40 sitios, la región graficada se reducía a la distancia del sitio más lejano más 10,000 pb. La sección RefSeq Genes se basa en la pista UCSC NCBI RefSeq con símbolos genéticos del paquete R 'org.Hs.eg.db', la sección CpG Islands se basa en la pista UCSC CpG Islands, la sección Roadmap chromHMM se basó en el Las hojas de ruta 15- indican el modelo chromHMM del fetoriñónepigenome (Roadmap Epigenome ID: E086)67 y la sección de SNP comunes se basa en la pista de SNP comunes de UCSC (151)68. Por último, el gráfico de correlación de CpG en la parte inferior de la figura se basa en los datos de las muestras de metilación del ADN del estudio KORA F4 utilizando la matriz Illumina HumanMethylation450 BeadChip, con los sitios que faltan en color gris claro.

La varianza se explica por la metilación del ADN.El porcentaje de variación fenotípica explicada por las 69 CpG replicadas asociadas con eGFR se estimó utilizando datos de 1888 participantes del estudio KORA FF4, los siete años de seguimiento del estudio KORA F457,58. El KORA FF4 no formó parte del metanálisis EWAS. Sin embargo, 988 individuos incluidos en el análisis de varianza explicada se superpusieron con los participantes KORA F4 del EWAS. En este conjunto de datos, la varianza explicada por todos los CpG independientemente de las covariables se estimó como la diferencia en el R2 del modelo base que incluye los CpG y el que no los tiene. El modelo base se definió comoriñónrasgo ~sexo más edad más proporciones de glóbulos blancos más diabetes más hipertensión más IMC más tabaquismo actual conriñónrasgo que representa eGFR y UACR. Para dos CpG asociados a eGFR (cg06008406, cg20004659), no había datos disponibles en el conjunto de datos KORA FF4.

Análisis de aleatorización mendeliana bidireccional.En la RM directa, utilizando el paquete R 'TwoSampleMR'69, investigamos los posibles efectos causales de la metilación del ADN en los CpG replicados en la eGFR y la UACR. MR utiliza instrumentos genéticos para minimizar el sesgo debido a la confusión y la causalidad inversa70. Los instrumentos genéticos para la metilación del ADN (meQTL) estaban disponibles para 47 y cinco CpG para eGFR y UACR, respectivamente, según lo identificado previamente por GoDMC en hasta 27,750 individuos42. Los datos de GWAS de resumen de ascendencia europea sobre eGFR10 y UACR13 se utilizaron como los datos de resultado respectivos. Se aplicaron filtros para la inclusión de meQTL (pSNP < 1e-5="" con="" metilación="" del="" adn="" en="" una="" región="" cis="" de="" ±="" 500="" kb,="" desequilibrio="" de="" enlace="" r2="">< 0,2="" dentro="" de="" una="" región="" de="" 1="" mb,="" filtrado="" steiger,="" maf=""> 0,05). Realizamos MR ponderada de varianza inversa, así como análisis de sensibilidad de MR (modo simple, modo ponderado, mediana ponderada y MR Egger), o triangulación mediante la estimación de la relación de Wald en caso de que solo se dispusiera de un único instrumento por sitio CpG71–73. Las estimaciones del efecto obtenidas de MR dependen de las unidades de los conjuntos de datos subyacentes y, en este caso, corresponden a un cambio por unidad en una desviación estándar de los niveles de metilación en la eGFR transformada en logaritmo natural y la desviación estándar de la UACR transformada en logaritmo natural. respectivamente. En la RM inversa, examinamos los posibles efectos causales deFunción del riñónrasgos en la metilación del ADN, utilizando los SNP significativos en todo el genoma de GWAS transétnicos en eGFR10 y UACR13 como instrumentos genéticos para eGFR y UACR, respectivamente. Para maximizar la potencia de los datos de resultados, realizamos un metanálisis de puntuación z de las asociaciones SNP-CpG de los estudios KORA F4 (n=1662) ​​y FHS (n=3868). Las estimaciones del efecto combinado y sus errores estándar del meQTL incluido en el MR se estimaron a partir del tamaño de la muestra, la frecuencia alélica y la puntuación z74. Se aplicaron filtros para la inclusión de SNP (valor P < 5e−8="">riñónrasgo, valor de P unilateral < 0.05="" con="" nitrógeno="" ureico="" en="" sangre="" para="" instrumentos="" de="" egfr,="" valor="" de="" p="" de="" heterogeneidad="" de="" ascendencia="" mayor="" o="" igual="" que="" 0.0="" 1,="" filtrado="" steiger,="" maf=""> 0.05). Realizamos MR ponderada de varianza inversa con efectos aleatorios multiplicativos (porque se disponía de un número suficientemente alto de instrumentos de diferentes loci por rasgo)51 y análisis de sensibilidad de MR (modo simple, modo ponderado, mediana ponderada y MR Egger)71–73. Como análisis de sensibilidad adicional que aborda variantes pleiotrópicas, excluimos un total de 35 instrumentos que estaban asociados con diabetes mellitus tipo 2 en un GWAS75 reciente que incluía 898 130 personas: once SNP que tenían un valor de P de asociación < 5e−8="" con="" diabetes,="" y="" 24="" instrumentos="" adicionales="" instrumentos="" que="" estaban="" en="" desequilibrio="" de="" ligamiento="" (r2=""> 0,2 dentro de un panel de referencia de 1 Mb, 1000 G EUR) con tal SNP asociado a la diabetes. El desequilibrio de ligamiento se evaluó a través de LDlink76. Para el MR inverso, las estimaciones del efecto proporcionan el cambio por unidad en la eGFR transformada en logaritmo natural y la desviación estándar de la UACR transformada en logaritmo natural, respectivamente, en una desviación estándar de los niveles de metilación del ADN. Se aplicó un ajuste de prueba múltiple de valor P según Benjamini-Hochberg FDR < 0,05="" por="" rasgo="" renal,="" y="" para="" la="" rm="" directa="" e="" inversa="" por="" separado77.="" los="" valores="" p="" de="" heterogeneidad="" se="" obtuvieron="" a="" partir="" de="" las="" estadísticas="">

Análisis de enriquecimiento.Para informar los posibles efectos funcionales de los CpG asociados, evaluamos el enriquecimiento de estos CpG en sitios de modificación de histonas o ADNasa I (H3K4me1, H3K4me3, H3K9me3, H3K27me3), conjuntos de genes basados ​​en términos GO y vías en las bases de datos KEGG y Reactome32 –35. Los análisis de enriquecimiento de TFBS se realizaron como se describió previamente en detalle14. Brevemente, las pruebas de enriquecimiento se evaluaron utilizando eForge78 usando permutación con coincidencia para la localización de la región de la isla de genes y CpG al tomar muestras. Los datos se obtuvieron de los proyectos ENCODE (125 muestras) o Roadmap Epigenomics (299 muestras) generados por el método Hotspot67,79,80. Los CpG que se asociaron con eGFR y UACR, respectivamente, en el valor P < 1e−05="" en="" el="" metanálisis="" se="" usaron="" como="" entrada="" (datos="" complementarios="" 6="" y="" 7),="" y="" 10,000="" corridas="" de="" remuestreo,="" un="" filtro="" de="" proximidad="" activo="" y="" fdr="" considerado=""><0.05 como="" significativo="" (datos="" complementarios="" 13="" y="" 14).="" los="" análisis="" de="" enriquecimiento="" de="" marcas="" de="" histonas="" se="" realizaron="" de="" manera="" análoga="" (datos="" complementarios="" 15="" y="" 16).="" el="" enriquecimiento="" en="" conjuntos="" de="" genes="" o="" rutas="" se="" evaluó="" utilizando="" el="" paquete="" metilgsa="" y="" r="" versión="" 3.6.181.="" el="" método="" de="" prueba="" de="" enriquecimiento="" fue="" methylglm="" implementando="" una="" regresión="" logística="" ajustando="" el="" número="" de="" sondas="" por="" gen="" y="" el="" fondo="" autosómico="" que="" se="" superpone="" a="" las="" matrices="" 450k="" y="" epic.="" se="" probaron="" conjuntos="" de="" genes="" o="" vías="" con="" 100–500="" genes="" (configuración="" predeterminada).="" consideramos="" que="" un="" conjunto="" de="" genes="" o="" una="" vía="" se="" enriquecen="" significativamente="" en="" fdr="">< 0,05,="" corrigiendo="" múltiples="" pruebas="" dentro="" de="" cada="" base="" de="" datos="" utilizando="" el="" método="" de="" benjamini="" y="" hochberg="" (datos="" complementarios="" 17="" y="">