El metanálisis de los resultados de cuantificación de NAD(P)(H) muestra variabilidad en los tejidos de mamíferos Ⅱ

El efecto de la recolección de tejido pre mortem versus post mortem en los niveles de NAD (P) (H).

Predijimos que puede haber alguna diferencia observable en el estado redox de NAD (P) (H) que depende de los procedimientos de recolección de tejido. Para responder a esta pregunta, examinamos el efecto de los procedimientos de recolección de tejidos pre y post mortem en el estado redox de NAD (P) (H). Para este análisis, comparamos valores de tejidos de hígado de rata dado el mayor número de estudios que definen su protocolo de sacrificio. Cuando se divulgaron, todos los estudios revisados ​​indicaron que las muestras de tejido se mantuvieron en frío y se extrajeron inmediatamente en hielo o se congelaron a -80 grados antes de las mediciones de NAD(P)(H). Este análisis determinó que no había una diferencia significativa en las concentraciones de NAD plus en el hígado de rata (Fig. 6a) entre los tejidos extraídos antes o después de la eutanasia. Sin embargo, los niveles de NADH informados en el hígado de rata son significativamente más altos en las muestras post mortem (Fig. 6b). No se observaron diferencias en los niveles totales de NAD(H) (Fig. 6c), pero la relación NAD más/NADH fue menor en los tejidos recolectados después de la eutanasia (Fig. 6d), lo cual es consistente con la variación observada en los niveles de NADH. Los resultados de NADP plus, NADPH y la relación NADP plus / NADPH en hígado de rata agrupados por punto de tiempo de recolección de tejido se muestran en la Fig. 9 complementaria; sin embargo, la cantidad insuficiente de muestras post-mortem no nos permite interpretar el efecto del punto de tiempo de recolección del tejido en los niveles de NADP(H). En el hígado de ratón, no hubo diferencia entre los niveles de NAD plus pre y post mortem, sin embargo, el número de estudios de informes fue limitado (Fig. 6e). NoNADH,NADP más, oNADPHdatos post-mortem enhígado de ratónestaba disponible para la comparación.

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Discusión

Muchos estudios recientes han demostrado que la regulación de NAD(P)(H) es esencial para la homeostasis celular y el estado redox. Los datos obtenidos de roedores han llevado a estudios que examinan los niveles de NAD plus en sangre humana, como un indicador menos invasivo de los niveles de NAD plus en todo el cuerpo. Estudios clínicos recientes demostraron que los niveles de NAD plus se redujeron en estados de enfermedad23,47 y se elevaron después de las estrategias de refuerzo de NAD plus23,44,48,49. Realizamos un metanálisis de todos los estudios publicados entre 1946 y el 20 de junio de 2021, que contenían datos cuantitativos de los niveles de NAD(P)(H) en especies de mamíferos con un enfoque especial en ratones, ratas y humanos, ya que representan los más importantes. especies estudiadas en el campo biomédico. Este análisis se realizó en parte para determinar el nivel estándar medio de las concentraciones de NAD(P)(H) en tejidos de mamíferos normales dada la variación bien conocida de estas medidas entre los estudios. Esperamos que estos datos se puedan usar para estimular protocolos estandarizados en el campo de la investigación NAD plus y para promover el uso de niveles de NAD (P) (H) y proporciones redox como biomarcadores confiables para enfermedades y regímenes de tratamiento.

A pesar de la considerable variabilidad en las medidas entre los tejidos de los roedores, este metanálisis mostró niveles medios similares de NAD plus en todos los tejidos, con algunas excepciones. Curiosamente, el músculo esquelético del ratón exhibió niveles medios de NAD plus más bajos (Fig. 2a) que otros tejidos altamente metabólicos (es decir, hígado, riñón, corazón y cerebro). Esto puede indicar diferentes estados redox de NAD(H) en el músculo esquelético o puede indicar problemas mayores con la extracción de metabolitos en los tejidos fibrosos. Sin embargo, estas observaciones no pudieron verificarse en humanos debido a la falta de muestras de tejido más allá de la sangre y el músculo.

Existen muchos factores potenciales que podrían afectar la precisión de las mediciones fisiológicas de NAD(P)(H) en muestras de tejido. Cuando se informó, todos los estudios describieron tejidos recolectados y sumergidos directamente en nitrógeno líquido, o mantenidos en hielo antes de congelarlos o procesarlos para preservar las fracciones sensibles al calor (NAD plus y NADP plus). El efecto del pH en las diversas fracciones de NAD(P)(H), como la naturaleza ácido-lábil de las formas reducidas de NAD(P)H, ha llevado al uso de solventes de extracción con pH neutro en la mayoría de los estudios. . Sin embargo, dada la rápida interconversión de los metabolitos reducidos y oxidados y el efecto de la anoxia en el NAD(H)50–53, también es importante garantizar la extracción rápida de los metabolitos tisulares y los procedimientos apropiados para apagar el NAD(P)(H) celular. )-redox/enzimas de consumo, como a través de la desproteinización. En este sentido, nuestro análisis de la recolección de tejido pre versus post mortem indica que el análisis post mortem favorece la reducción de NAD plus. La reducción de NAD plus tisular se ha descrito previamente in vivo en el cerebro, el corazón y el hígado de ratas expuestas a una atmósfera hipóxica prolongada de 2.5-h54, un entorno que puede recapitularse parcialmente mediante períodos prolongados de sacrifique la recolección de tejido antes de la congelación rápida. Esto puede indicar que la extracción de tejidos bajo anestesia o la priorización de la recolección inmediata de tejidos destinados a ser utilizados para el análisis de metabolitos después del sacrificio deben realizarse para obtener mediciones representativas de NAD(P)(H).

También existe la posibilidad de que varios métodos de cuantificación, cada uno con limitaciones diferentes, contribuyan a la variabilidad intraestudio general de las mediciones de NAD(P)(H). En las últimas dos décadas, los métodos más utilizados fueron los ensayos de ciclos enzimáticos, LC-MS y HPLC. Cada uno de estos métodos se ve afectado por las técnicas de extracción de metabolitos, los parámetros de cuantificación y la implementación de controles de calidad adecuados. Usando LC-MS, Lu et al. han demostrado que la interconversión entre las formas reducida y oxidada de los metabolitos de NAD(P)(H) se produce a diferentes velocidades en varios tampones de extracción o disolventes con la mezcla de acetonitrilo:metanol:agua con 0.1 M ácido fórmico que produce la recuperación más alta con la menor cantidad de interconversiones31. Sin embargo, cuando se utiliza LC-MS, esta interconversión se puede controlar entre muestras individuales de un estudio añadiendo controles internos como los isótopos NAD(P)(H), lo cual es una ventaja de la técnica LC-MS sobre la de HPLC y la enzima. ensayos de ciclismo31,33,55. No obstante, incluso con técnicas LC-MS bien controladas, varios factores pueden interferir con la señal medida, incluidos los efectos de matriz y las variaciones en la eficiencia de ionización. Por ejemplo, algunos estudios utilizan extractos de levadura marcados con 13C como estándares internos en la metabolómica basada en LC-MS. Sin embargo, añadir a la matriz de metabolitos de la muestra extraída una matriz de metabolitos de extracto de levadura marcada con 13C puede tener varias consecuencias, como la supresión de iones, que reduce la señal de los metabolitos marcados y/o no marcados, y puede provocar errores en la cuantificación absoluta si no detectada por una evaluación exhaustiva de la calidad56. Además, aunque las técnicas de LC-MS teóricamente permiten la medición de múltiples metabolitos de NAD(P)(H) en un experimento, aún existen limitaciones ya que se deben ejecutar diluciones óptimas si los metabolitos de interés tienen grandes diferencias en las concentraciones. Por lo tanto, a pesar de sus ventajas sobre los ensayos de ciclos enzimáticos más simples, la complejidad de los métodos LC-MS impone la necesidad de una optimización exhaustiva. Recientemente, se han desarrollado nuevos métodos analíticos, como NAD más biosensores y espectrometría de masas basada en imágenes, pero aún no hay suficientes datos cuantitativos generados a partir de estas técnicas para incluir en un metanálisis. Aunque, un estudio incluido en nuestro metanálisis usó un biosensor bioluminiscente basado en papel para medir los niveles de NAD plus en hígado de ratón y otros tipos de muestras57. Este estudio se incluyó en el grupo de ensayos bioluminiscentes debido al método similar de detección (Fig. 1a).

Métodos

Extracción de datos.

Los datos numéricos de los metabolitos de NAD(P)(H) se obtuvieron directamente de los artículos o se extrajeron de las figuras de los artículos mediante un software de extracción de datos semiautomático (WebPlotDigitizer58). Además, cuando correspondía, se registraron los puntos de tiempo de muestreo de tejido en relación con el sacrificio y/o los métodos de muestreo de tejido/sangre (es decir, método de anestesia y/o eutanasia, manejo del tejido y temperatura de almacenamiento). Para modelos animales, se registraron la especie, las características (p. ej., cepa, genotipo, edad y peso) y las condiciones ambientales (p. ej., ciclo de sueño, tipo de dieta, frecuencia de alimentación y estado de alimentación en relación con el muestreo de tejido). Además, para todos los estudios, se extrajeron los tratamientos (por ejemplo, tratamientos farmacológicos, cirugías, irradiación, inducción de tumores y otros procedimientos aplicados a los sujetos del estudio) y toda la información del grupo de estudio (por ejemplo, grupos de tratamiento o enfermedad y controles correspondientes). Finalmente, el método de cuantificación de NAD(P)(H) (p. ej., ensayos enzimáticos, basados ​​en espectrometría de masas, HPLC, RMN, bioluminiscencia) y las especificaciones de la publicación (es decir, título de la publicación, código de referencia [DOI, Medline UI, PMID] o hipervínculo y año de publicación) (Material complementario 2).

Análisis de los datos. Antes del análisis, todas las concentraciones se convirtieron a nmol/g de tejido o nmol/g de proteínas para muestras de tejido o nmol/ml para fracciones de sangre. Debido al bajo número de resultados normalizados al contenido de proteínas, solo mostramos resultados normalizados al peso del tejido y al volumen de sangre. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism versión 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, California, EE. UU.,Disponibilidad de datosTodos los datos extraídos y analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y su suplemento.archivos de informacionRecibido: 29 de abril de 2022; Aceptado: 7 febrero 2023

Referencias

10. Amor, NR et al. La NAD quinasa controla la biosíntesis de NADP animal y se modula a través de mecanismos dependientes de calmodulina evolutivamente divergentes. proc. nacional Academia ciencia 112, 1386–1391 (2015).

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