Perfil de metabolitos y actividad antienvejecimiento del arroz koji fermentado con Aspergillus Oryzae y Aspergillus Cristatus: un estudio comparativo

Abstracto:Arrozkoji, utilizado como iniciador para maximizar los beneficios de la fermentación, produce productos finales versátiles según los microbios del inóculo utilizado. Aquí, realizamos perfiles de metabolitos paracomparar arrozkojifermentado con dos importantes hongos filamentosos,Aspergillus oryzaeyA. cristatus, durante 8 días. Los análisis multivariados mostraron distintos patrones de metabolitos primarios y secundarios en los dosKoji. El arroz koji fermentado conA. oryzae(RAO) mostróaumentó -actividad glucosidasa y mayor contenido de derivados de azúcar que el fermentado conA. cristatus (RAC). RAC mostrómejorado -Actividad glucosidasa y aumento del contenido de flavonoides ylisofosfolípidos, en comparación con RAO. En general, en la etapa final de fermentación (8 días), laantioxidanteactividades y efectos anti-envejecimientofueron mayores en RAC que en RAO, correspondientes a the aumentadometabolitoscomoflavonoidesy derivados de auroglaucina en RAC. Esta metabolómica comparativaEl enfoque se puede aplicar enoptimización de la produccióny análisis de control de calidad dekojiproductos

Palabras clave: arroz koji; microbio; fermentación en estado sólido;efecto antienvejecimiento; actividad antioxidante

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1. Introducción

La fermentación, que tiene una historia de miles de años, se reconoce cada vez más como un método para mejorar la nutrición y las bioactividades de los productos alimenticios, además de procesarlos y conservarlos [1]. El arroz koji se elabora mediante fermentación en estado sólido utilizando granos de arroz al vapor inoculados con microorganismos para secretar enzimas y producir metabolitos beneficiosos. En los últimos años, varios intentos de crear condiciones de fermentación delicadas han llevado a una eficacia de fermentación avanzada y una mejor palatabilidad de los alimentos [2,3]. Debido a sus ventajas, el arroz koji encuentra aplicaciones en campos industriales como alimentos y bebidas fermentados y cosméticos [4–6].

Especies de oxígeno reactivas(ROS) se generan en condiciones oestrés oxidativoy son subproductos del metabolismo aeróbico. Estosradicales librespuede inducir la degradación de biomoléculas, lo que resulta en daños oxidativos, como inflamación y aceleración del proceso de envejecimiento de la piel [7]. Para desarrollar un equilibrio entre la producción y eliminación de ROS, los secuestrantes de ROS, conocidos como antioxidantes, juegan un papel importante en el alivio del estrés oxidativo y se obtienen principalmente de fuentes naturales [8]. Estos radicales libres están involucrados en el proceso de envejecimiento, y eliminarlos mediante la ingesta de antioxidantes de fuentes naturales es crucial para retrasar el envejecimiento [9]. En los últimos años, muchos estudios han informado que el arroz koji puede mejorar las actividades antioxidantes potenciales de las materias primas mediante la mejora del sustrato de fermentación [10,11].

La matriz extracelular de la piel (MEC) consta de fibras de colágeno y elastina, que promueven la elasticidad de la piel para restaurar y mantener su forma y estado originales [12]. La destrucción de la ECM dérmica es un indicador de envejecimiento. Ocurre debido a la regulación al alza de la metaloproteinasa de la matriz que degrada el colágeno-1 (MMP-1), también conocida como colagenasa. Por lo tanto, los estudios de varios fitoquímicos que pueden retrasar el proceso de envejecimiento de la piel al estimular la síntesis de colágeno y elastina e inhibir la MMP-1 están aumentando [13–16]. Seo et al. mostró que el salvado de arroz fermentado afecta el colágeno de los fibroblastos de la piel, el factor inflamatorio (IL-a) y las MMP-1 [17]. Por lo tanto, varios compuestos que se encuentran en el arroz, como los flavonoides y los ácidos fenólicos, tienen actividad antioxidante, y el koji de arroz fermentado tiene el potencial de mejorar el fotoenvejecimiento de la piel por la radiación UV [18]. Aspergillus, un hongo fifilamentoso, es un microbio de inóculo típico para producir muchos metabolitos beneficiosos, como azúcares simples, ácidos grasos y aminoácidos del koji en Asia. En particular, Aspergillus oryzae es el microorganismo más común utilizado en la producción de koji debido a su seguridad garantizada y varias enzimas, como amilasa, proteasa y peptidasa [19].

Aspergillus cristatus se usa en la fermentación del té, como el té de ladrillo Fuzhuan, que tiene probióticos y protege contra el fotoenvejecimiento inducido por los rayos UVB [20,21]. También se ha informado que mejora la actividad antioxidante de varias otras materias primas [22,23]. Actualmente, cada vez se dedican más esfuerzos a mejorar la calidad de los iniciadores de fermentación [4,24]. Estudios previos han mostrado un estudio metabólico comparativo de Aspergillus y Bacillus, ampliamente utilizado en el arroz koji [25]. Sin embargo, existe escasez de información sobre las diferencias metabolómicas entre los mismos géneros pero diferentes especies de hongos. Para seleccionar microbios óptimos que puedan introducirse en el mercado de la salud con aplicaciones nutracéuticas y cosmecéuticas, es necesario comprender de forma exhaustiva el metabolismo de diferentes microbios del inóculo comparando su bioactividad y metabolitos.

En este estudio, perfilamos los metabolitos del arroz koji fermentado con diferentes Aspergillus spp. (A. cristatus y A. oryzae) en términos de metabolómica para comparar el metabolismo de los dos hongos fifilamentosos. También medimos la actividad enzimática, la actividad antioxidante y la expresión de ARN de los factores antienvejecimiento de la piel (colágeno, elastina y MMP-1) para comparar los dos koji. Además, realizamos un análisis de correlación para sugerir posibles metabolitos candidatos que contribuyan a la actividad antioxidante y los efectos antienvejecimiento de la piel. Un análisis exhaustivo del perfil de metabolitos basado en MS para comparar los dos inóculos de koji estableció una relación entre las actividades enzimáticas, los metabolomas y las bioactividades. Aquí, presentamos un modelo del estado metabólico general, correlacionado con las bioactividades de los dos inóculos diferentes de koji.

2. Resultados

2.1. Perfiles Metabólicos para Arroz Koji Fermentado con Diferentes Aspergillus spp.

Se compararon diferentes metabolomas de muestras de koji de arroz inoculadas con A. cristatus o A. oryzae mediante análisis multivariado según los conjuntos de datos de GC-MS y LC-MS. El gráfico de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) obtenido de UHPLC–LTQ–Orbitrap MS/MS y GC–TOF–MS reveló una variación total del 40,9 % (PC1, 22,01 %; PC2, 18,89 %) y del 52,88 % (PC1, 34,70 por ciento; PC2, 18,18 por ciento), respectivamente (Figura 1A,B). Ambos resultados de PCA indicaron que el punto de inicio de la fermentación estaba ensamblado, pero en consecuencia distinguido por diferentes hongos de inoculación según los diferentes tiempos de fermentación. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales (PLS-DA) aclaró patrones estadísticos iguales a la distribución de metabolitos en PCA (Figura complementaria S1A, B).

Como se muestra en el PCA obtenido de los análisis UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS (Figura 1A), existen diferencias significativas en el octavo día, y ambas muestras de ocho días se sometieron a un análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS -DA), que mostró una clara separación por el componente 1 de OPLS, que representa 86.11 por ciento de la variación en los datos (Figura complementaria S1C). Los 31 metabolitos se seleccionaron a partir de datos de UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS/MS, que se considera uno de los principales contribuyentes a la discrepancia en los kojis de arroz de octavo día fermentados con dos microbios de inóculo diferentes en función de su importancia variable en los valores de proyección (VIP > 1 .{{10}}) y valores p (p < 0.05) del análisis OPLS-DA (Tabla complementaria S1). Estos metabolitos incluyeron 2 ácidos carboxílicos, 5 ácidos fenólicos, 7 flavonoides, 2 ácidos grasos de cadena larga, 11 lisofosfolípidos y anc4 hidroquinonas. Los metabolitos se identificaron tentativamente comparando la literatura publicada (peso molecular, fórmula molecular, tiempo de retención, patrones de fragmentos de masa y absorbancias UV) y datos de una biblioteca interna.

Figura 1. Gráfica de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) de los conjuntos de datos (A) UHPLC-LTO-Orbitrap-MS/MS y (B) GC-TOF-MS de arroz koi fermentado con Aspergillus cristatus o A. oryzne. (símbolos rellenos , A. cristatus; símbolos vacíos, A. oryzne, O, 0 día; , , 2 días; V, V, 4 días; 6 días; , 8 días).

2.1.1. Metabolomas Temporales para Arroz Koji con Diferentes Aspergillus spp. Inoculación Según Tiempo de Fermentación

Las vías metabólicas del koji de arroz que dependen de diferentes microbios de inoculación se representaron mediante un mapa de calor para visualizar los patrones de cambio de metabolitos de acuerdo con los tiempos de fermentación (Figura 2). El color en un gradiente de azul a rojo representa la abundancia relativa media normalizada de cada metabolito en cada condición experimental. Las tendencias de la mayoría de los metabolitos en el arroz koji fermentado con A. cristatus (RAC) y A. oryzaeRAO) mostraron un patrón de aumento gradual con el tiempo de fermentación. Los metabolitos asociados con el metabolismo de los carbohidratos en su mayoría representaron un patrón creciente a excepción de la glucosa, la xilosa, la sacarosa y la maltosa, que son azúcares. Además, los flavonoides de ácido fenólico y los contenidos de hidroquinona aumentaron con el tiempo de fermentación, a excepción del ácido ferúlico. Entre los ácidos grasos, la mayoría de los metabolitos mostraron un patrón creciente mientras que el ácido pimélico mostró una disminución. Los lisofosfolípidos presentaron patrones dispares con diferentes tiempos de fermentación y hongos de inoculación.

Figura 2. Esquema de la vía metabólica y niveles relativos de metabolitos en arroz koji fermentado con Aspergillus cristatus o A. oryzae. La vía se adaptó de la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) y se modificó. Los cuadrados de colores representan los cambios de pliegue (de azul a rojo) normalizados por el promedio de todos los valores para cada metabolito.

2.1.2. Disparidad relativa en el nivel de metabolitos discriminantes en arroz koji fermentado por A. cristatus o A. oryzae

Como se muestra en la Figura 2, los contenidos de metabolitos primarios y secundarios exhibieron diferentes patrones de acuerdo con diferentes hongos de inoculación. En el caso de la glucosa, que es el centro del metabolismo de los carbohidratos, los patrones de A. cristatus koji mostraron una disminución, mientras que A. one koji mostró patrones decrecientes en el punto de fermentación inicial pero aumentó gradualmente hasta el punto de fermentación final. Además, los alcoholes de azúcar fueron más altos en RAO que en RAC. En particular, los derivados de auroglaucina se mejoraron significativamente solo en RAC porque son un compuesto de pigmento único producido por A. cristatus. Además, la mayoría de los flavonoides aumentaron significativamente en RAC en comparación con RAO, excepto 3,8-dimetilherbacetina. Entre los ácidos fenólicos, el ácido ferúlico y el ácido benzoico aumentaron en ambas muestras, pero el ácido dihidroxibenzoico, el ácido cafeoilquínico y el ácido vanílico aumentaron solo en RAC. Los lisofosfolípidos aumentaron en RAC, pero se observó una tendencia contrastante en RAO. Los ácidos grasos mostraron mayores patrones de aumento de RAO que en AC

2.2. Comparación de Producción Enzimática y Bioactividad en Arroz Koji Fermentado con Diferentes Microorganismos

Para comparar los fenotipos de RAC y RAO, evaluamos la actividad enzimática y los efectos antienvejecimiento en las células de la piel, la actividad antioxidante, el contenido total de flavonoides (TFC) y el contenido total de fenoles (IPC) (Figura 3). La producción de enzimas de ambos koji aumentó con el tiempo de fermentación, excepto la a-amilasa en RAO. Curiosamente, el contenido de a-glucosidasa fue dos veces mayor en RAO que en RAC con 10.12 y 3.52 unidades respectivamente; en cambio, el contenido de B-glucosidasa fue superior en RAC que en RAO con 19,{{20}}5 unidades y 5,49 unidades respectivamente de acuerdo con los tiempos de fermentación. El fenotipo funcional del koji (actividad antioxidante y factor antienvejecimiento de la piel) indicó que el koji de arroz con A. cristatus tenía actividades antioxidantes más altas en ABTS, DPPH y FRAP en el tiempo de fermentación final (8 días) con 1.{ {24}}5, 0.40, 0.66 TEAC (capacidad antioxidante equivalente de Trolox) respectivamente. Además, el contenido de flavonoides fue mayor en RAC que en RAO con 0,07 NE (equivalente de naringina) y 0,01 NE respectivamente. Mientras que el contenido de fenol total fue mayor en RAO que en RAC con 0.32 EGA (ácido gálico equivalente) y 0.28 EGA respectivamente. Los resultados de los factores antienvejecimiento de la piel (elastina, colágeno y MMP-1) indicaron que al final de la fermentación. Nivel de expresión de ACRNA con 7,77 y 13,76 y nivel de expresión de ARN de MMP-1 relativo más bajo con 2,35 en comparación con B-actina. Mientras tanto, RAO mostró un aumento gradual en la expresión de ARN de elastina y colágeno después de la fermentación.

Figura 3. Comparación de producción de enzimas (A), factor antienvejecimiento de la piel (B) y actividad antioxidante, contenido total de flavonoides) y contenido fenólico total (IPC) (C) en arroz koji fermentado con diferentes Aspergillus spp. (color negro, A. cristatus color blanco, A. oryzne). Las actividades enzimáticas son actividad de a-amilasa, actividad de B-glucosidasa y actividad de a-glucosidasa (A). El nivel relativo de expresión de ARNm se mide para lo siguiente: colágeno (COL1A1), elastina (ELN) y metaloproteinasa de matriz-1 (MMP-1) ​​(B). Las actividades antioxidantes representadas son ABTS, eliminación de radicales DPPH, FRAP, contenido total de mavonoides y contenido fenólico total (C). Se identificaron diferencias significativas entre diferentes microbios de inoculación mediante la prueba t (* p < {{10}}.05, ** p < 0.01).

Para determinar los metabolitos que potencialmente contribuyeron a la bioactividad, se realizó un análisis de correlación entre los metabolitos del koji fermentado y las bioactividades (Suplemento, Figura S2). En general, el mapa de coeficientes de correlación de Pearson mostró que el RAC tenía una mayor correlación con las bioactividades que el RAO. En RAC, los ácidos orgánicos, los flavonoides, los lisofosfolípidos, los ácidos grasos, la hidroquinona y los derivados del azúcar mostraron una alta correlación positiva con las bioactividades. Para RAO, los ácidos orgánicos, los flavonoides y los ácidos grasos y los derivados del azúcar indicaron una correlación positiva con las bioactividades. Los metabolitos que tenían un valor de coeficiente de correlación de Pearson superior a 0.5 están representados en un mapa de red (Figura 4) En ambos productos de koji, los ácidos orgánicos, los ácidos grasos, los flavonoides y los derivados del azúcar fueron contribuyentes potenciales de bioactividades . La expresión de ARN de elastina se asoció con metabolitos de RAC, mientras que la expresión de ARN de colágeno se asoció con metabolitos de RAO. Además, TFC mostró una correlación con RAC. Además, los lisofosfolípidos y la hidroquinona contribuyeron fuertemente a la actividad antioxidante de RAC.

Figura 4. Los metabolitos que tienen un valor del coeficiente de correlación de Pearson superior a 0.5 están representados por un mapa de red en arroz koji fermentado con (A) Aspergillus cristatus o (B) A. oryzne. Los símbolos de los recuadros representan bioactividades (color gris, actividad antioxidante TPC y TFC; color negro, efecto antienvejecimiento de la piel sobre las células) y los símbolos de colores indican los metabolitos (mismas series se distinguieron por diferente color y forma: o, hidroquinona: orgánica ácidos: , ácidos grasos, flavonoides; lisofosfolípidos; o, azúcar y derivados del azúcar; desconocido).

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