Sistemas microfisiológicos para recapitular el eje intestino-riñón

Laura Giordano,^1,3Silvia María Mihaila,^1,3Hossein Eslami Amirabadi,^1,2y Rosalinde Masereeuw

CrónicoriñónLa enfermedad renal crónica (ERC) aparece típicamente junto con otras comorbilidades, destacando la fisiopatología compleja subyacente que se cree que está muy modulada por el intestino bidireccional.riñóndiafonía Al combinar los avances en ingeniería de tejidos, fabricación, microfluídica y biosensores, los sistemas microfisiológicos (MPS) han surgido como enfoques prometedores para emular la interconexión in vitro de múltiples órganos, al tiempo que abordan las limitaciones de los modelos animales. Imitar los estados (patológicos) fisiológicos del eje intestino-riñón in vitro requiere un MPS que pueda simular no solo esta diafonía bidireccional directa, sino también las contribuciones de otros participantes fisiológicos, como el hígado y el sistema inmunitario. Discutimos los desarrollos recientes en el campo que potencialmente podrían conducir al modelado in vitro del eje intestino-riñón en la ERC.

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Enfermedad renal crónica: un trastorno metabólico con señalización interorgánica e interorgánica interrumpida

Crónicoriñón(ERC) es la más extendidariñónenfermedad y se caracteriza por la pérdida gradual de la función de los órganos con el tiempo, lo que afecta la capacidad de filtrar los productos de desecho metabólicos de la sangre (Cuadro 1). Los riñones tienen muchas funciones altamente especializadas, como la filtración de sangre y la secreción activa para la eliminación de desechos metabólicos, la reabsorción de nutrientes esenciales, el mantenimiento del volumen sanguíneo y la homeostasis electrolítica, y la actividad metabólica y endocrina [1].

Se cree que la fisiopatología compleja y enigmática de la ERC está modulada porriñóndiafonía con múltiples órganos y sistemas, particularmente a través de la comunicación interorgánica bidireccional con el tracto gastrointestinal, denominada eje intestino-riñón[2]. El intestino humano alberga una comunidad compleja de microbios que viven en una relación comensal con su huésped [3] y brindan contribuciones significativas y únicas al metaboloma humano (consulte el Glosario). En simbiosis, la absorción intestinal asegura la captación de metabolitos microbianos beneficiosos, mientras que los riñones mantienen la homeostasis al excretar productos finales metabólicos potencialmente tóxicos. Por el contrario, la insuficiencia renal provoca la acumulación de metabolitos derivados de la microbiota intestinal (es decir, toxinas urémicas) que conducen al desarrollo del síndrome urémico. Esta complicación contribuye a la disbiosis intestinal que afecta negativamente las vías inflamatorias, endocrinas y neurológicas involucradas en el inicio y la progresión de la ERC (Cuadro 2 y Figura 1) [4]. En general, la ERC puede verse como un trastorno metabólico que refleja la interrupción del flujo entre órganos e interorganismos de metabolitos y moléculas de señalización acompañada de una sobreactivación del sistema inmunitario (Figura 2). En consecuencia, el papel central de la señalización remota intestino-riñón a través de toxinas urémicas [5] plantea la necesidad de caracterizar aún más el metaboloma intestinal en la ERC.

Tradicionalmente,riñónla investigación de enfermedades se ha basado en gran medida en estudios clínicos [6] y en animales [7] que ofrecen un control limitado sobre los parámetros experimentales y tienen una alta variabilidad entre especies. Debido a la falta de modelos experimentales in vitro adecuados, actualmente existe una necesidad imperiosa de sistemas de cultivo celular que puedan capturar los diferentes aspectos de la función de los órganos in vivo mediante el uso de microambientes de cultivo altamente controlados y especializados, incluidos andamios 3D y microfluidos [8]. ]. Dados los avances en el cultivo multicelular y la biofabricación, la integración de funciones de monitoreo en tiempo real y el control independiente de los parámetros experimentales, la captura de las complejidades de la fisiología humana in vitro ciertamente está a la vista. Brindamos una descripción general completa de los avances más emblemáticos y recientes en el campo de los modelos in vitro 3D y destacamos su relevancia para el desarrollo de un sistema de eje bidireccional intestino-riñón 3D. También discutimos los principales obstáculos que implican, cómo superarlos y ofrecemos nuevos conocimientos sobre la dirección actual de este campo en el contexto de la ERC.

Modelos microfisiológicos para desentrañar interconexiones de órganos complejos

El advenimiento de los sistemas sociológicos de micrografía (MPS), también conocidos como órganos en chips (OOC), ha creado nuevas posibilidades para estudiar los procesos fisiológicos involucrados en órganos individuales y la diafonía entre órganos. Está surgiendo una variedad de MPS múltiples diferentes que respaldan un enfoque de 'fisioma en un chip' para simular las unidades funcionales de los órganos, así como la diafonía entre ellos, en lugar de tratar de reproducir los órganos completos. Desde un punto de vista técnico, los MPS a menudo consisten en canales de microfluidos únicos o múltiples con dimensiones transversales de cientos de micrómetros en los que se (re)circulan pequeños volúmenes (de nanolitros a microlitros). Al garantizar un contacto estrecho entre las células, estos volúmenes permiten capturar la interacción dinámica célula-célula al tiempo que garantizan un consumo mínimo de reactivos y una dilución del compuesto [9,10]. El flujo laminar agregado puede suministrar continuamente a las células nutrientes frescos y oxígeno al mismo tiempo que elimina los productos de desecho, y puede generar gradientes químicos y mecánicos espaciotemporales precisos en su vecindad [11]. El aislamiento físico de diferentes tejidos análogos se logra mediante la compartimentación en microcanales separados por finas membranas porosas o capas de matriz extracelular (MEC) [12].

La creación de la plataforma lung-on-a-chip, en la que se combinaron tensión mecánica y múltiples tipos de células para imitar la respiración del pulmón, fue pionera en el desarrollo de MPS de inspiración biológica [13]. Desde entonces, el progreso en el manejo de microfluidos ha hecho posible conectar diferentes modelos de órganos y controlar su diafonía dentro de uno o varios dispositivos [14,15]. Los últimos desarrollos en el campo nos impulsan a discutir estos avances en relación con el modelado del intestino.riñóneje en CKD y explore los requisitos de MPS para apoyar la comunicación entre órganos, teniendo también en cuenta el enfoque sinérgico de combinarlos dentro de modelos silico.

En camino a replicar el eje intestino-riñón usando MPS

Se han establecido varios sistemas gut-on-a-chip mediante la integración de microfluidos, ingeniería de tejidos y sistemas microelectromecánicos. Entre las configuraciones más representativas, el gut-on-a-chip del Instituto Wyss (EE. UU.) emuló con éxito el microambiente intestinal humano dinámico a través de la aplicación de fuerzas mecánicas similares a la peristalsis y fluidos fisiológicamente relevantes, y estos apoyaron la diferenciación celular en vellosidades. - y estructuras similares a criptas, la formación de una monocapa epitelial gruesa y una función celular mejorada (Figura 3A) [16–19]. Recientemente, las características topológicas han surgido como fundamentales en la dirección de la función celular, pero solo unos pocos estudios han intentado replicar la arquitectura de cripta-vellosidad en sistemas microfluídicos que ahora se pueden obtener fácilmente a través de estereolitografía 3D de alta resolución [20], fotolitografía [21 ] y micromoldeado de hidrogeles reticulados [22]. En la actualidad, la imitación de las estructuras similares a los túbulos intestinales se ha abordado mediante el cultivo de células intestinales en el lado apical de un sistema de membrana de fibra hueca perfusible [23,24] o en la luz de los microcanales [25]. La adición de un revestimiento de ECM y una pieza apical unidireccional dio como resultado un fenotipo de túbulo intestinal maduro con estructuras similares a vellosidades. La exposición a la toxina A secretada por Clostridium difficile, un factor de virulencia natural de los habitantes del intestino y disruptor de la barrera intestinal en la disbiosis, o al metabolito derivado de la microbiota intestinal, el p-cresol, resultó en una mayor permeabilidad de la barrera [23,24]. Al mismo tiempo, el p-cresol se convirtió en p-cresil sulfato y p-cresil glucurónido, los metabolitos finales que se acumulan en el plasma durante la progresión de la ERC, probablemente a través del metabolismo mediado por el citocromo P450- seguido de la conjugación, destacando así la contribución de el intestino a la biotransformación de metabolitos derivados de la microbiota intestinal en toxinas urémicas [23].

La complejidad y diversidad del epitelio intestinal se puede recapitular de manera confiable mediante el uso de organoides de tejido humano en 3D [26,27]. Sin embargo, su uso ha demostrado ser un desafío porque su configuración cerrada de afuera hacia adentro dificulta los estudios de transporte y la exposición a bacterias comensales y patógenas. Sin embargo, Thorne y colaboradores demostraron que, a través de la disociación enzimática de los organoides, las células intestinales primarias podían autoorganizarse y segregarse de novo en regiones indiferenciadas o diferenciadas, formando compartimentos similares a nichos [28]. Mediante la integración de un endotelio microvascular separado cultivado bajo deformación cíclica y homóloga independiente, se evaluaron las propiedades de absorción de estas células [29,30]. Recientemente, se demostró que la inclusión de dominios de cripta-vellosidades en un epitelio en forma de tubo con lumen perfusible mantiene características de patrones celulares estereotípicos con potencial autorregenerativo [31].

El estudio in vitro de las interacciones huésped-microbiota se ha visto obstaculizado por la incapacidad de los modelos convencionales para mantener una microbiota compleja viable durante varios días. Aunque a menudo se ha pasado por alto la contribución de la capa de moco a las interacciones huésped-microbioma, recientemente se demostró que la integración de una capa de moco espesa, que actúa como una barrera fisiológica entre las bacterias y el epitelio intestinal, podría retrasar el daño de la barrera y la permeabilidad paracelular. [32,33]. En consecuencia, el sofisticado modelo de microfluidos, HuMiX, permitió el cocultivo directo de bacterias anaerobias y células intestinales mediante la incorporación de una capa de moco funcional, así como estimulación mecánica y pulsátil (Figura 3B) [34].

La mayoría de la microbiota intestinal son anaerobios obligados que requieren<0.5% o2="" growth="" conditions="" that="" are="" difficult="" to="" represent="" in="" vitro="" [19,35].="" this="" limitation="" was="" overcome="" by="" engineering="" mpss="" that="" incorporate="" physiologic="" oxygen="" gradients="" and="" support="" the="" dynamic="" interaction="" between="" intestinal="" and="" vascular="" endothelial="" layers.="" the="" chip="" consisted="" of="" an="" upper="" anaerobic="" epithelial="" chamber="" and="" a="" lower="" aerobic="" endothelial="" chamber,="" separated="" by="" a="" polydimethylsiloxane="" (pdms)="" membrane.="" through="" a="" radial="" oxygen="" gradient="" generated="" by="" the="" system,="" intestinal="" cells="" were="" oxygenated="" whereas="" anaerobic="" conditions="" allowed="" microbiota="" growth,="" as="" assessed="" by="" real-time="" monitoring="" via="" integrated="" noninvasive="" oxygen="" sensors="" [19,36].="" similar="" physiological="" hypoxia="" conditions="" were="" achieved="" by="" zhang="" and="" coworkers="" who="" cocultured="" oxygen="" super-sensitive="" bacterial="" species="" using="" a="" differently="" designed="" mps,="" the="" gumi="" (figure="" 3c)="" [37].="" this="" platform="" induced="" a="" steep="" oxygen="" gradient="" through="" the="" addition="" of="" a="" long-term="" continuous="" fellow="" of="" anoxic="" apical="" medium="" and="" aerobic="" basal="" media.="" the="" use="" of="" polysulfone,="" which="" unlike="" pdms="" is="" an="" oxygen-impermeable="" material,="" prevented="" any="" oxygen="">

El desarrollo deriñónLos sistemas en un chip también han sido un desafío debido a la falta de células funcionales para recapitular in vitro la estructura multicelular y la complejidad funcional dentro de la nefrona. En consecuencia, en relación con el dispositivo gut-on-a-chip, el desarrollo deriñón-on-a-chip se está quedando atrás hasta cierto punto. Hasta la fecha, se han desarrollado modelos de la fisiología glomerular, del túbulo proximal y del túbulo distal, pero queda por lograr la integración de todos los componentes en una nefrona en un chip completa [38]. Para ser fisiológicamente relevante, además de la complejidad celular, un biomiméticoriñón-on-a-chip debe integrar (i) las interacciones célula-célula, como las que se dan entre los podocitos o las células epiteliales del túbulo proximal y el endotelio (micro)vascular, (ii) los gradientes de presión osmótica y electroquímica transcelular que impulsan los fluidos y los metabolitos a través del espacio intersticial, (iii) compañero líquido, y (iv) la disposición estructural de los túbulos renales, así como (v) funciones metabólicas y endocrinas celulares [38].

El túbulo proximal juega un papel crucial en la excreción de desechos metabólicos y la reabsorción de biomoléculas y, por lo tanto, ha sido un foco importante de interés en el desarrollo de in vitroriñón-Sistemas en un chip que recapitulan en vivoriñóntejido. El desarrollo de funcionesriñónLos túbulos que utilizan células del túbulo proximal con fibras huecas biofuncionalizadas permitieron a Jansen y sus colaboradores estudiar la eliminación secretora de los metabolitos derivados de la microbiota intestinal. Este sistema permitió a los investigadores demostrar cómo, a través de la detección y señalización remotas, las células del túbulo proximal detectan niveles elevados de sulfato de indoxil y, en consecuencia, ajustan la expresión de los transportadores responsables de su excreción en un intento por mantener estables los niveles de metabolitos y la homeostasis [39].

Las interacciones endotelio-espacio intersticial-epitelio gobiernan el intercambio continuo de solutos entre los compartimentos circulatorio y urinario. Lin y sus colaboradores desarrollaron con éxito un túbulo proximal vascularizado en 3D perfusible que fue capaz de simular, a través del intercambio de solutos entre el túbulo y la vasculatura, la función de reabsorción activa delriñón[40]. Este modelo permite la cantidad para la certificación de la captación de albúmina renal y la reabsorción de glucosa a lo largo del tiempo, lo que ofrece una herramienta prometedora para investigar las funciones fisiológicas y farmacológicas de los riñones. Además de un intercambio de solutos, elriñónEl espacio intersticial también se considera fundamental para el desarrollo deriñónfifibrosis, un sello distintivo de la ERC. Se cree que esto es causado por la cicatrización del espacio intersticial del túbulo como resultado de la activación de miofibroblastos intersticiales y la posterior deposición de ECM. Sin embargo, solo unos pocos estudios han reportado su integración en sistemas 3D in vitro. Moll y colaboradores [41] informaron sobre la validación de un modelo de microambiente de túbulos/intersticio 3D simple y altamente reproducible para el estudio de la fifibrosis renal en un sistema in vitro fisiológicamente relevante. Este estudio utilizó cisplatino para imitar con éxito la lesión tubular aguda. La replicación in vitro del microambiente del túbulo/intersticio renal se logró utilizando fibroblastos dérmicos humanos en lugar de fibroblastos renales porque los primeros expresan niveles bajos de marcadores fibróticos en condiciones basales. Sin embargo, a pesar de esta limitación, el sistema demostró que las células epiteliales juegan un papel central en el desencadenamiento de la activación y diferenciación de los miofifibroblastos. Moll y colaboradores intentaron repetir este estudio usando fibroblastos renales primarios pero encontraron una gran variabilidad en los resultados. Dada la importancia del espacio intersticial en la ERC, serán necesarios más estudios 3D in vitro para dilucidar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad.

losriñonestambién activan la 25(OH)vitamina D por hidroxilación en la posición 1, lo que da como resultado 1,25(OH)2vitamina D, una hormona esencial que a menudo es deficiente entre los pacientes con ERC y que puede afectar la composición de la microbiota intestinal y la integridad de la barrera. Recientemente, una representación en chip del metabolismo hepático yriñónla activación de la vitamina D se desarrolló mediante la perfusión de un medio que contenía vitamina D en un chip de microfluidos, lo que sugiere que las interacciones metabólicas interorgánicas complejas son altamente alcanzables utilizando tecnologías MPS [42].

En la ERC, se supone que la reducción en la producción de ácidos grasos de cadena corta (SCFA), complementada por el aumento simultáneo en la producción de toxinas urémicas y su acumulación sistémica [4], impulsa la condición inflamatoria crónica que es típica de la ERC [4,43]. ]. De hecho, los SCFA, en particular el butirato, tienen efectos nefroprotectores y protectores intestinales [4,44], y los altos niveles de butirato se han asociado con la integridad de la barrera intestinal y la mejora de la inmunidad intestinal como resultado de sus propiedades antiinflamatorias [45]. Sin embargo, esto fue contradicho recientemente por Trapecar y colaboradores quienes, en un enfoque psicomimético, demostraron que los SCFA pueden exacerbar una respuesta inflamatoria en un modelo de intestino-hígado. Al conectar dos placas neumáticas que representan por separado el intestino y el hígado, las células T CD4 plus y las células auxiliares T inflamatorias tipo 17 (Th17) podrían circular dentro y entre los dos compartimentos. Los efectos opuestos de los SCFA podrían correlacionarse con el grado de inflamación, con un estado inflamatorio elevado que produce un efecto más nocivo [46].

Hasta donde sabemos, actualmente no hay MPS que aborde los efectos de los metabolitos derivados del intestino en el intestino,riñón, u otros órganos, con seguimiento concomitante de su biotransformación, en el contexto de la ERC. Ajustar el chip para recapitular fielmente la bidireccionalidad de los flujos de producción y eliminación de metabolitos será un desafío. La integración de microbiota derivada de muestras de heces de pacientes con ERC en un sistema de microfluidos intestinales nos permitiría estudiar alteraciones en el metabolismo microbiano y analizar sus efectos (in)directos en órganos remotos, una característica que no se puede lograr a través de experimentos in vivo.

Avances tecnológicos que mejoran el valor traslacional in vivo de los MPS El diseño de un MPS es un desafío y requiere un enfoque multidisciplinario. Es importante tener en cuenta que ningún MPS por sí solo puede hacerlo todo y, según la aplicación, es posible que se requieran diferentes sistemas. Las ventajas y limitaciones de los sistemas disponibles para abordar el intestino.riñónEl eje se resumen en la Tabla 1. Uno de los desafíos más comunes en el campo es diseñar un sistema que sea biológicamente complejo y lo suficientemente simple técnicamente para ser establecido en laboratorios de cultivo celular.

El grupo Ingber (Instituto Wyss, EE. UU.) ha establecido protocolos bien optimizados para el cultivo celular, la conexión de componentes microfluídicos al chip y el muestreo [16–18,47]. Aunque tecnológicamente avanzado, su sistema de microfluidos requiere una capacitación significativa de los operadores no técnicos, incluso para ensayos automáticos de microfluidos [47]. Los chips multiorgánicos sin bomba, iniciados por el laboratorio Shuler (Universidad de Cornell, EE. UU.), así como por compañías como Hesperos Inc. (Figura 3E) e InSphero, aumentan el rendimiento a expensas de un control limitado sobre la complejidad del dispositivo y del compañero [48] (https://hesperosinc.com/). Aunque limitado en la replicación de señales biofísicas, el MPS desarrollado por el laboratorio Griffith (Instituto de Tecnología de Massachusetts, EE. UU.) hace uso de protocolos más convencionales, por ejemplo, al permitir el acceso directo al análogo de tejido y al usar insertos Transwell® estándar modificados (Figura 3C, D) [37,49].

Empresas innovadoras han desarrollado plataformas multiorgánicas similares, como TissUse®. Sus bombas en chip conectan los órganos y hacen que el sistema sea menos propenso a atrapar burbujas y filtrarse. Sin embargo, estos dispositivos ofrecen un enrutamiento de microfluidos limitado, por ejemplo, falta el compañero apical en el modelo intestinal y la personalización de los modelos de tejido es difícil.

Otro desafío importante es el material del chip. El PDMS se encuentra entre los materiales más utilizados debido a su excelente permeabilidad al oxígeno, claridad óptica y propiedades de creación de prototipos. Sin embargo, la permeabilidad al oxígeno es un inconveniente cuando se cocultiva el microbioma anaerobio obligado con células intestinales [20,37]. Al probar compuestos hidrofóbicos, por ejemplo, en estudios de eficacia o toxicidad de fármacos, no se recomienda el PDMS porque absorbe moléculas hidrofóbicas pequeñas. Por lo tanto, los MPS compuestos por materiales más inertes, que evitan la unión no específica de compuestos, son los más fiables. Por ejemplo, Edington y sus colaboradores desarrollaron una plataforma microfluídica basada en poliestireno de MPS interconectados en un intento de recrear un fisioma en un chip que puede generar perfiles de distribución molecular complejos para aplicaciones avanzadas de descubrimiento de fármacos [50].

El desarrollo de plataformas con sensores integrados (oxígeno, urea, lactato o glucosa) y/o transparencia óptica ha facilitado el análisis celular no invasivo en tiempo real (Cuadro 3) [51,52]. Recientemente se ha desarrollado una plataforma con detección modular totalmente integrada. Esto opera unidades MPS de manera continua, dinámica y automatizada, e incluye sensores físicos para monitorear el microambiente extracelular, sensores bioquímicos para medir biomarcadores solubles, microscopios en miniatura para capturar cambios morfológicos y una placa de enrutamiento de microfluidos para enrutar fluidos en un momento oportuno. manera [53].

El análisis computacional también es necesario para establecer si los datos experimentales derivados de MPS se pueden extrapolar al rendimiento in vivo [54]. Por lo tanto, la integración de algoritmos de aprendizaje automático (modelado in silico) debería convertirse en un componente estratégico de los MPS [55]. El modelo computacional se puede ajustar para ayudar a resolver las limitaciones de los MPS vinculados experimentalmente y traer los datos dentro del rango de estudios en animales y métodos de extrapolación [54]. Las predicciones obtenidas a partir de estudios in silico pueden proporcionar información para mejorar aún más los modelos MPS [55]. Por ejemplo, los estudios in silico podrían emplearse para modelar la motilidad de las células inmunitarias después del daño de la barrera intestinal y predecir el comportamiento celular tras la exposición a parámetros o biomoléculas específicos [56–59].

Observaciones finales y perspectivas futuras

Durante el próximo siglo, se prevé que la prevalencia de la ERC aumente drásticamente en todo el mundo, lo que plantea importantes desafíos económicos y sociales. Independientemente del país de origen, se ha descubierto que los costos anuales de atención médica y sociales aumentan en paralelo con la progresión de la ERC [60], lo que destaca la necesidad urgente de una plataforma modelo de enfermedad en la que estudiar la fisiopatología de la ERC e identificar posibles objetivos terapéuticos.

Sin embargo, quedan muchos desafíos por abordar y varios problemas deben resolverse antes de que se puedan desarrollar MPS que modelen con precisión la ERC (ver Preguntas pendientes). Por ejemplo, los eventos iniciales que impulsan el inicio de la ERC siguen siendo desconocidos, lo que dificulta el modelado del inicio de la ERC en MPS.RiñónLas lesiones que conducen al desarrollo de la ERC son de naturaleza diversa y con frecuencia involucran un componente cardiovascular, lo que dificulta aún más su representación. Además, la composición del microbioma intestinal es compleja y difícil de reproducir; sin embargo, es un requisito esencial para un modelo de enfermedad de ERC. Los últimos desarrollos exitosos de MPS que integran bacterias anaerobias han sido posibles gracias a la integración de biosensores para la detección de oxígeno, así como a la inclusión de flujos controlados y una capa de moco que reduce el crecimiento excesivo de bacterias y limita el daño de las células intestinales (Tabla 1). Sin embargo, quedan por lograr amplios consorcios de bacterias anaerobias dentro de los sistemas, aunque esto será necesario para una representación fisiológica del microbioma intestinal. Los problemas con los materiales absorbentes y permeables al aire también representan un obstáculo importante en el campo, ya que desafían la idoneidad de los sistemas para el crecimiento de bacterias anaerobias o para probar compuestos lipofílicos. La relevancia de las interconexiones de órganos se ha destacado fuertemente en esta revisión; por lo tanto, es de vital importancia integrar los sistemas circulatorio e inmunológico dentro de las MPS, pero estos se han incorporado solo en unos pocos modelos.

Al mejorar la interdisciplinariedad, la integración de bioimpresión, biomateriales y biosensores para el monitoreo en tiempo real del microambiente podría abordar las características anatómicas y bioquímicas, así como la complejidad, de los sistemas que son necesarios para aumentar su relevancia fisiológica. A medida que avanza la tecnología MPS, junto con la tendencia actual hacia enfoques multidisciplinarios mejorados, estas preguntas sin respuesta eventualmente se abordarán.

Expresiones de gratitud

Este proyecto recibió financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska Curie STRATEGY-CKD H2020-2019-ETN (860329), así como de la convocatoria WIDESPREAD-05-2018-TWINNING REMODELACIÓN (857491). Este trabajo fue apoyado además por los holandesesRiñónFundación (DKF, 17OI13). RM es miembro del grupo de trabajo EUTox respaldado por ESAO/ERA-EDTA.

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