Clonación Molecular Y Caracterización Bioquímica De Una Nueva Cumarina Glicosiltransferasa CtUGT1 De Cistanche Tubulosa

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Xiping Xu, et al.

RESUMEN

Las UDP-glicosiltransferasas (UGT) son una familia importante y funcionalmente diversa de enzimas involucradas en la biosíntesis de metabolitos secundarios. La cumarina es uno de los esqueletos más comunes de productos naturales con actividades farmacológicas candidatas. Sin embargo, hasta la fecha, muchos GT informados de plantas reconocieron principalmente a los flavonoides como aceptores de azúcar. Solo los GT limitados podrían catalizar la glicosilación de las cumarinas. En este estudio, se clonó una nueva UGT deCistanche tubulosa, una valiosa hierba china tónica tradicional, que es abundante en diversos glucósidos como los glucósidos feniletanoides, glucósidos de lignanos y glucósidos iridoides. La alineación de secuencias y el análisis filogenético mostraron queCtUGT1es filogenéticamente distante de la mayoría de los UGT de flavonoides informados y adyacente a los UGT de fenilpropanoide. Extensos ensayos enzimáticos in vitro encontraron que aunqueCtUGT1no participaron en la biosíntesis de glucósidos bioactivos enCistanche tubulosa, podría catalizar la glucosilación de las cumarinas umbeliferona 1, esculetina 2 e himecromona 3 con un rendimiento considerable. Los productos glicosilados se identificaron por comparación con los estándares de referencia o espectroscopía de RMN, y los resultados indicaron queCtUGT1puede catalizar de forma regioespecífica la glicosilación de hidroxilo cumarinas en la posición C7- OH. Los residuos clave que determinaronCtUGT1La actividad de se discutió más a fondo en base a modelos de homología y análisis de acoplamiento molecular. En combinación con los resultados de mutagénesis dirigida al sitio, se descubrió que H19 desempeñaba un papel insustituible como base de catálisis crucial.CtUGT1podría usarse en la preparación enzimática de glucósidos de cumarina bioactivos.

Palabras clave:Glicosiltransferasas vegetales, glucósidos de cumarina,Cistanche tubulosa, Modelado de homología, Mutagénesis dirigida al sitio

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Introducción

La glicosilación es uno de los tipos de modificación de la estructura más comunes de los productos naturales secundarios. La glicosilación podría cambiar la estabilidad y/o solubilidad del aglicón y contribuir mucho a la diversidad de productos naturales/no naturales debido a los múltiples tipos de conjugación. En las plantas, estas reacciones generalmente se llevaron a cabo mediante glicosiltransferasas (UGT) dependientes de uridina difosfato (UDP), un tipo de enzimas que catalizan la transferencia de fracciones de monosacárido desde el azúcar de nucleótido activado a una molécula aceptora de glucosilo que puede ser un carbohidrato, un glucósido, un oligosacárido , o un polisacárido [1,2]

Hasta la fecha, muchos genes que codifican UGT se han aislado de varias plantas [3]. La glicosilación se produjo principalmente en los grupos hidroxilo o carboxilo de una amplia gama de productos secundarios, como flavonoides [4], fenilpropanoides [5], terpenoides [6], esteroides [7], alcaloides [8], etc. Las cumarinas son metabolitos fenilpropanoides ampliamente distribuidos en muchas especies de plantas. Las cumarinas naturales a menudo existen como glicoconjugados, y estos derivados exhibieron un amplio espectro de actividades farmacológicas, que incluyen antioxidante [9], antiviral [10,11], hepatoprotectora [12], antiinflamatoria [13], anticancerígena [14 ], antimutagénico [15] y actividades inhibidoras de la colinesterasa (ChE) y la monoaminooxidasa (MAO) [14,15], etc. informó capaz de transferir el resto de azúcar a las cumarinas [16-18].

Las plantas ricas en diversos glucósidos podrían servir como un acervo genético ideal de UGT con nuevas actividades de catálisis. Además, se ha informado que numerosas UGT poseen una considerable promiscuidad de aceptores para catalizar la glicosilación de múltiples sustratos, algunos de los cuales ni siquiera se separaron en las plantas [19]. En este artículo, una nueva glicosiltransferasaCtUGT1fue identificado deCistanche tubulosa, una hierba medicinal tradicional que abunda en diversos glucósidos, como los glucósidos feniletanoides (PhG), los glucósidos de lignano y los glucósidos iridoides. La expresión heteróloga y la caracterización de la función demostraron que aunque recombinanteCtUGT1no participó en la biosíntesis de estos glucósidos enCistanche tubulosa, puede catalizar la glucosilación de cumarinas hidroxiladas, y la reacción ocurrió de manera regioespecífica en la posición 7- OH de las cumarinas umbeliferona 1, escalada 2 e himecromona 3 para producir tres compuestos farmacológicamente activos desnatados (1a), cichoriin (2a) , y 4-metilumbeliferil glucósido (3a) con un rendimiento considerable, respectivamente. Además, el sustrato de benzofenona 4,4′-dihidroxi benzofenona (4), el sustrato de isoflavona genisteína (5) y el sustrato de antraquinona aloe-emodina (6) también podrían ser aceptados porCtUGT1. Las propiedades catalíticas y los residuos clave que subrayan la capacidad de catálisis deCtUGT1también se evaluaron en base a modelos de homología, análisis AutoDock y mutagénesis dirigida al sitio.

2. Experimental

2.1. Material vegetal y productos químicos

Cistanche tubulosautilizado en este estudio se recolectó de áreas desérticas en Hetian, regiones autónomas de Xinjiang. Su identidad botánica fue confirmada por el profesor Pengfei Tu de la Universidad de Pekín. Las cumarinas probadas y otros sustratos en este estudio se compraron a Sigma-Aldrich (St. Louis, EE. UU.), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China) y Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, China). ) a menos que se indique lo contrario. Los estándares de referencia de desnatado (1a) y cichoriina (2a) se adquirieron de Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Wuhan, China).

2.2. Clonación molecular de CtUGT1 de Cistanche tubulosa

El ARN total deCistanche tubulosase extrajo del tallo carnoso con un kit OMEGA Plant RNA (GA, EE. UU.) y se transcribió inversamente a ADNc con el kit de reactivos PrimeScript™ RT (TaKaRa, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se diseñó un cebador degenerado para 3'RACE basado en las secuencias de aminoácidos en el PSPG conservado (Glicosiltransferasas de productos secundarios de plantas) - caja de glicosiltransferasas de plantas. Las amplificaciones de los extremos 3′ y 5′ deCtUGT1se llevaron a cabo utilizando el kit de amplificación de ADNc Smart RACE (Clontech, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante utilizando cebadores (Tabla S1). El cDNA de longitud completa delCtUGT1se amplificó por PCR utilizando KOD-Plus Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Japón) con pares de cebadores específicos de genes (Tabla S1) en las siguientes condiciones: un paso inicial de desnaturalización a 94 ◦C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 98 ◦C por 15 s, recocido a 55 ◦C por 30 s, y extensión a 68 ◦C por 55 s, con un paso final de extensión a 68 ◦C por 7 min. Todos los fragmentos de ADN obtenidos se clonaron en un vector pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China) y se secuenciaron.

2.3. Alineación de secuencias y análisis filogenético

Alineación de secuencias deCtUGT1con glicosiltransferasas informadas (Tabla S2) se realizó utilizando el paquete de software DNAMAN 4.0 (Lynnon Biosoft, Canadá). Los motivos y dominios se analizaron utilizando una herramienta de dominio conservado (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). El árbol filogenético se construyó arrancando el software MEGA 7.0.14 utilizando el método de unión de vecinos con 1000 réplicas de arranque [20]. La secuencia proteica traducida deCtUGT1se alineó con las glicosiltransferasas vegetales conocidas depositadas en la base de datos NCBI GenBank (Tabla S3) con ClustalW.

2.4. Expresión heteróloga y purificación de proteínas de CtUGT1 en Escherichia coli

La región codificante deCtUGT1se amplificó con BamH I y Not I como sitios de restricción usando los cebadores que se muestran en la Tabla S1. Las reacciones de PCR se realizaron utilizando KOD-Plus-Neo DNA Polymerase (TOYOBO, Osaka, Japón). Las secuencias obtenidas se verificaron mediante clonación en el vector pEASY-Blunt (TransGen Biotech, China). El producto de amplificación confirmado deCtUGT1posteriormente se digirió y se subclonó en el vector de expresión pET-28a( plus ) (Novagen, EE. UU.). A continuación, la construcción verificada se transformó en E. coli Transetta (DE3) para obtener la cepa recombinante. Se inoculó un cultivo nocturno de la cepa recombinante en medio Luria-Bertani (LB) que contenía 50 ug⋅mL−1 de kanamicina y 40 ug⋅mL−1 de cloromicetina en una proporción de 1:1{{ 19}}0. Los cultivos se cultivaron a 37 ◦C, 200 rpm hasta que el valor de OD600 alcanzó 0,4–0,6. Posteriormente se añadió isopropil- -D-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM y las células se cultivaron durante 16 ha 18 ◦C, 180 rpm. Luego, los sedimentos celulares se recolectaron por centrifugación (7600 × g, 10 min, 4 ◦ C) y se resuspendieron en 3 ml/g de tampón de lisis enfriado (Nota de datos complementarios 1) y se interrumpieron por sonicación en hielo. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 7600 ×g, 4 ◦C durante unos 30 min. Se utilizó una columna Histrap preequilibrada (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) para la cromatografía de afinidad según las instrucciones del fabricante. La proteína recombinante se eluyó con 10 volúmenes de columna de tampón de elución (Nota de datos complementarios 1) que contenía imidazol 250 mM. La pureza de la proteína se analizó mediante SDS-PAGE al 10 por ciento. La proteína purificada se concentró mediante un tubo de ultrafiltración de 30 kDa (Sigma-Aldrich, EE. UU.) y se desalinizó con una columna PD-10 (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) con tampón de desalinización (Nota de datos complementarios 1). La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford usando BSA como estándar.

2.5. Ensayos de actividad enzimática y especificidad de sustrato de CtUGT1

Para investigar la actividad de glicosilación deCtUGT1, los ensayos enzimáticos se realizaron en una mezcla de reacción (150 μL) compuesta de 0.4 mM aglicona, 0.8 mM UDP-glucosa (UDPG) y 50 ug de purificadaCtUGT1proteína en el tampón de desalinización. Todas las reacciones se incubaron a 30 ◦C durante 12 h y se terminaron agregando 300 μL de metanol frío. Las mezclas se centrifugaron a 15,000 ×g durante 30 min para recolectar el sobrenadante para los análisis HPLC-UV/ESI-MS. Se llevaron a cabo rutinariamente tres ensayos paralelos para cada reacción. HPLC (Agilent 1260, EE. UU.) se equipó con un detector de matriz de diodos y una columna CAPCELL PAK C18 (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japón) a un caudal de 1 mL⋅min−1, y la temperatura de la columna se mantuvo a 30 ◦C. La fase móvil constaba de A (es decir, solución acuosa de ácido fórmico al 0,1 por ciento) y B (es decir, acetonitrilo). Los programas de gradiente se enumeraron en la Tabla S4. Los datos de HRESI-MS se registraron en un sistema LCMS-IT-TOF, equipado con una interfaz ESI (Shimadzu, Kioto, Japón) con He de ultra alta pureza como gas de colisión y N2 como gas de nebulización. Los parámetros de la fuente de ESI optimizados fueron los siguientes: tasa de flujo de gas envolvente, 1,5 ml⋅min−1; caudal de gas auxiliar, 1,5 mL⋅min− 1; voltaje de pulverización, 4,5 kV; temperatura capilar, 200 ◦C. Los espectros se registraron en el rango de 100 a 1500 m/z para un análisis de MS de barrido completo.

2.6. Efectos del tiempo de reacción, valor de pH y temperatura en la actividad enzimática y estudios cinéticos de CtUGT1

Efectos del tiempo de reacción, el valor del pH y la temperatura sobre la actividad enzimática deCtUGT1se ensayaron utilizando UDPG como donante de azúcar y 3 como aceptor de azúcar en las condiciones de reacción descritas anteriormente. Para la determinación del pH óptimo, se comparó la actividad enzimática en tampón 100 mM (ácido cítrico-citrato de sodio) con valores de pH que oscilaron entre 3.0 y 6.{{ 14}}, tampón de 10{{20}} mM (KH2PO4-K2HPO4) con valores de pH que van de 6.0 a 8.{{29} }, tampón 100 mM (Tris-HCl) con valores de pH entre 7,0 y 9,0, tampón 100 mM (Na2CO3-NaHCO3) con valores de pH entre 9,0 y 11,0. Para ensayar la temperatura de reacción óptima, las reacciones se incubaron a varias temperaturas que oscilaban entre 0 y 65 ◦C. Los cursos de tiempo de la reacción se evaluaron en 12 puntos de tiempo diferentes entre 0 y 24 h. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Las mezclas de reacción se analizaron por HPLC-MS como se describe anteriormente. Para estudios cinéticos deCtUGT1, los ensayos enzimáticos se realizaron en un volumen final de 100 μL que contenía tampón KH2PO4-K2HPO4 100 mM (pH 8,0), 25 ug de tampón purificadoCtUGT1, 3 mM de UDPG y concentraciones variables (50–3000 μM) de 3. Las reacciones se realizaron a 37 ◦C durante 30 min y luego se terminaron con 100 μL de metanol helado. Todas estas reacciones se realizaron por triplicado y la actividad enzimática se evaluó mediante la cuantificación de los derivados glucosilados correspondientes. Los parámetros cinéticos, incluida la constante de Michaelis-Menten (Km) y Vmax, se calcularon mediante análisis de regresión no lineal utilizando el software GraphPad Prism 5.

2.7. Selectividad de sustrato y donante de azúcar de CtUGT1

Para explorar las preferencias de sustrato deCtUGT1, se probaron un total de 27 sustratos pertenecientes a diferentes tipos estructurales utilizando UDPG como donante. Su información química se enumeró en la Tabla S5, y sus estructuras se mostraron en las Figs. S1 y S2. Para investigar la selectividad de los donantes de azúcar deCtUGT1, los ensayos se realizaron utilizando umbeliferona (1), esculetina (2), himecromona (3), 4,4′-dihidroxi benzofenona (4), genisteína (5) y aloe-emodina (6) como sustratos con UDPG, UDP- N acetil galactosamina, UDP-galactosa, GDP-manosa, GDP-fucosa, ácido UDP galacturónico, UDP-ramnosa como donantes de azúcar, respectivamente. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. Las mezclas de reacción se analizaron por HPLC-MS como se describe anteriormente.

2.8. Preparación de 4-metilumbeliferil glucósido (compuesto 3a) por CtUGT1

La mezcla de reacción preparativa consistió en {{0}}.034 mmol sustrato compuesto 3, 0.04 mmol UDPG, 5 mg purificadoCtUGT1en 50 mL de tampón de reacción. Las reacciones se agitaron suavemente en las condiciones óptimas (KH2PO4-K2HPO4 100 mM con pH 8,0; 37 ◦C). Tras la incubación a 37 ◦C durante 24 h, el sobrenadante de la reacción se separó mediante cromatografía en columna con resina macroporosa (MCI GEL CHP) tras centrifugar a 12,000 ×g durante 30 min. La fase móvil fue una elución en gradiente de 100 por ciento de agua a 100 por ciento de metanol. Cada fracción se analizó por HPLC-UV. Las fracciones que contenían solo productos seleccionados se evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida y se caracterizaron por espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H y espectroscopía de RMN de 13C.

2.9. Acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida al sitio de CtUGT1

El modelo proteico deCtUGT1se estableció utilizando SWISS-MODEL [21–25]. La estructura cristalina de Medicago truncatula glicosil transferasa UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) fue elegida como estructura molde [26]. El modelo establecido fue evaluado por VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina se utilizó para estudios de acoplamiento molecular [29]. La estructura cristalina de UGT74F2 [30], una glicosiltransferasa de Arabidopsis thaliana, en complejo con el ligando UDP y el ácido salicílico (PDB ID 5U6M) se usó como estructura de control para el análisis del bolsillo del donante de azúcar y del bolsillo del aceptor de azúcar, respectivamente. . Se utilizaron Auto-Dock-Tools 1.5.6 de MGLTools (herramientas de laboratorio de gráficos moleculares) para preparar el UDPG del donante de azúcar y el sustrato 1, 2 para el acoplamiento molecular. Las cadenas laterales de residuos alrededor de la cavidad del sitio activo se flexibilizaron y los enlaces giratorios de los ligandos se dejaron libres para girar. La pose mejor clasificada según el modelo de acoplamiento de Vina con la afinidad más alta (kcat/mol) se sometió a un análisis visual utilizando el software PyMOL 2.0.

Para las investigaciones de mutagénesis, el gen de secuencia optimizada deCtUGT1(Nota 2 de datos complementarios) se sintetizó y probó como el tipo salvaje. Mutagénesis dirigida al sitio de laCtUGT1se realizó utilizando el Sistema de Mutagénesis Rápida (TransGen Biotech). Los mutantes se amplificaron a partir de la plantilla del gen optimizado que se construyó en el vector pET-28a usando los cebadores específicos que se muestran en la Tabla S1. Los mutantes construidos se verificaron mediante PCR y secuenciación antes de transformarse en E. coli (DE3) para expresión heteróloga. La purificación de proteínas y las reacciones enzimáticas se realizaron y analizaron como se describe anteriormente.

3. Resultados y discusión

3.1. Clonación de cDNA de longitud completa del gen CtUGT1 deCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) es una hierba medicinal china tradicional que produce una amplia variedad de glucósidos naturales bioactivos. Debería haber un número considerable de nuevos genes de glicosiltransferasas que existían en su genoma. Para buscar glicosiltransferasas novedosas con actividades de catálisis interesantes, se diseñó un cebador degenerado para 3′-RACE basado en el motivo PSPG conservado para clonar UGT permisivas deCistanche tubulosa. La secuencia del extremo 3 'obtenida se analizó más por NCBI blast y el cebador específico para 5'-RACE se diseñó en función de la secuencia obtenida. Los extremos de cDNA 5' amplificados y los extremos de cDNA 3' se empalmaron y la longitud total delCtUGT1Se obtuvo la secuencia, que incluye 1739 nucleótidos (Fig. S3) y se enumeró en la Nota 3 de datos complementarios. Posteriormente, un marco de lectura abierto (ORF) deCtUGT1fue encontrado por las herramientas NCBI ORF Finder y la secuencia de codificación de 1482 pb fue exitosamente clonada por amplificación RT-PCR usando cebadores específicos en la Tabla S1. La secuencia de cDNA de CtUGT1 se ha enviado a NCBI (número de acceso MW629113).

3.2. Análisis de secuencia y expresión heteróloga de CtUGT1

losCtUGT1Se esperaba que el gen codificara una proteína de 493 residuos de aminoácidos con una masa molecular estimada de 55,78 kDa. NCBI blast reveló que la secuencia proteica deducida deCtUGT1comparte la mayor identidad (76,39 por ciento) con enzimas similares a UGT86A1-. Las funciones bioquímicas de este tipo de enzima no han sido completamente caracterizadas. Se predice que pueden estar involucrados en la adaptación de la planta al estrés abiótico. La alineación de las secuencias de aminoácidos de CtUGT1 y otras glicosiltransferasas de plantas se muestra en la Fig. S4.

Los 44 residuos altamente conservados del motivo PSPG se encontraron en el extremo C-terminal deCtUGT1. Dentro de la caja PSPG, se ubicó una secuencia peptídica de HCGWNS en el aminoácido 373, que se detectó en el 95 por ciento de todas las glicosiltransferasas [31]. El residuo final del motivo PSPG fue la glutamina, lo que indicó que esta enzima tiende a usar UDPG como donante de azúcar [32] (Fig. S4). El árbol filogenético se construyó con base en las secuencias polipeptídicas predichas deCtUGT1y diferentes tipos de glicosiltransferasas de origen vegetal que estaban involucradas en la biosíntesis de varios metabolitos secundarios. Hasta ahora, la mayoría de las glicosiltransferasas de plantas reportadas reconocieron a los flavonoides como sus sustratos, como las flavonas 7-O-glicosiltransferasas, las flavonoides 3-O-glucosiltransferasas, las isoflavonas 7-O-glicosiltransferasas y glicosiltransferasas de chalcona. Los resultados del análisis filogenético mostraron queCtUGT1no se ha agrupado en el clado de flavonoides GT. En cambio, se encuentra junto a UGT74T1 y UGT74S1 (lignan glicosiltransferasas de Linum usitatissimum) y NtGT2 (una cumarina glicosiltransferasa de Nicotiana tabacum), lo que indica queCtUGT1puede tener algunas actividades de catálisis novedosas hacia sustratos fenilpropanoides (Fig. 1), especialmente considerando que solo se han identificado funcionalmente miembros limitados que pertenecen a estos clados.

Para revelar aún más su actividad de catálisis, elCtUGT1La secuencia se expresó bajo el control del promotor T7 lac en células E. coli Transetta (DE3) como proteína de fusión marcada con His6-. El recombinante marcado con HisCtUGT1se purificó eficientemente hasta la homogeneidad mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. El peso molecular del CtUGT1 recombinante purificado fue de aproximadamente 55 kDa (Fig. S5), lo cual es consistente con la masa molecular predicha.

3.3. Especificidad de sustrato aceptor in vitro de CtUGT1

Para probar la actividad de glicosilación deCtUGT1, se realizaron ensayos enzimáticos in vitro. Se usó UDPG como donante de azúcar. Los aceptores de azúcar se seleccionaron en función de diferentes preocupaciones. En primer lugar, elCtUGT1el gen fue clonado deCistanche tubulosacuyos principales componentes químicos son PhGs. Para verificar siCtUGT1participa en la biosíntesis de PhG, las agliconas comunes de PhG enCistanche tubulosatales como tirosol (NP1, Fig. S2) y salidroside (NP2, Fig. S2) se seleccionaron primero como sustratos. Desafortunadamente, los análisis de HPLC y HRESI-MS no encontraron ningún producto glicosilado, lo que indicó queCtUGT1puede no estar involucrado en la biosíntesis de PhG.

En segundo lugar, según la alineación de secuencias y los resultados del análisis filogenético (Fig. 1),CtUGT1estaba relacionado filogenéticamente con las glicosiltransferasas de lignanoides y cumarinas, lo que sugería queCtUGT1es probablemente una glicosiltransferasa fenilpropanoide. Para verificar esta predicción, se probaron tres sustratos de cumarina 1, 2 y 3 junto con un sustrato de lignanoide magnolol NP17 como aceptores de azúcar, respectivamente. Como control negativo se utilizaron enzimas inactivadas por calor (100 ◦C, 10 min). El análisis HPLC-HRESI-MS de las reacciones usando NP17 como sustrato no encontró ningún producto. Por el contrario,CtUGT1mostró habilidades de glucosilación obvias contra los sustratos de cumarina probados (1,2,3). Utilizando el sustrato 1 como ejemplo, como se muestra en la Fig. 2A, se produjo un nuevo pico (1a) con un tiempo de retención reducido (11,46 min) en comparación con el del sustrato 1 (19,75 min) medianteCtUGT1a un rendimiento del 37,78 por ciento. Su espectro de absorción UV corresponde a 1. El espectro HRESI-MS mostró que el pico 1a mostró un aumento de [M más H] en m/z 325,1029, y un aumento de [M más Na] en m/z 347,0710 (calcd. 347,0737 para C15H16O8Na ) con la fórmula predicha de C15H16O8, que era 162 amu mayor que la de 1 y consistente con la fórmula teórica de un producto glucosilado (Fig. 2A). De manera similar, el producto glucosilado del sustrato 2 (14,21 min, Fig. 2B) y 3 (21,92 min, Fig. 2C) también se encontró en el tiempo de retención de 10,85 min y 13,80 min, con una tasa de conversión de 22,03 por ciento y 68,67 por ciento. , respectivamente. La masa molecular de los productos coincidió exactamente con la masa calculada de los productos glucosilados, lo que confirmó queCtUGT1podría catalizar la glicosilación de los compuestos de cumarina 1–3 (Tabla 1).

Posteriormente, considerando que la mayoría de las enzimas reportadas recientemente exhibieron promiscuidad de catálisis in vitro, para explorar más a fondo el espectro de sustrato deCtUGT1, se realizaron ensayos enzimáticos expansivos hacia diversos compuestos pertenecientes a diferentes tipos de productos naturales, incluidos flavonoides, compuestos fenólicos, cumarinas, estilbeno, antraquinonas, benzofenona, naftaleno e iridoide (Figs. S1-S2), usando UDPG como el donante de azúcar. Se encontró que el sustrato de benzofenona 4,4′-dihidroxi benzofenona (4), el sustrato de isoflavona genisteína (5) y el sustrato de antraquinona aloe-emodina (6) también podrían ser catalizados porCtUGT1para formar el correspondiente producto glucosilado 4a, 5a, 6a con mayor polaridad (Fig. 3). El análisis HRESI-MS mostró que los picos de iones de los productos eran todos 162 amu mayores que los de los sustratos, lo que sugiere queCtUGT1podría catalizar la glicosilación de estos compuestos para formar su correspondiente producto monoglucósido. Las tasas de conversión de 4, 5 y 6 fueron 4,12 por ciento, 14,14 por ciento y 23,33 por ciento, respectivamente (Tabla 1).

La selectividad del donante de azúcar deCtUGT1también se exploró. Además de UDPG, se probaron otros seis donantes, incluidos UDP-N-acetilgalactosamina, UDP galactosa, GDP-manosa, GDP-fucosa, UDP-ácido galacturónico y UDP ramnosa, utilizando los sustratos 1–6 como aceptores. Los resultados mostraron queCtUGT1seleccionó exclusivamente a UDPG como donante de azúcar. No se observó ningún producto cuando se probaron otros azúcares activados (datos no mostrados).

3.4. Propiedades bioquímicas y parámetros cinéticos de CtUGT1

Propiedades bioquímicas deCtUGT1se investigaron usando 3 como aceptor de azúcar y UDPG como donante de azúcar como se indica en la Fig. 4. Actividad de catálisisCtUGT1se probó en un rango de temperatura de 4–60 ◦C, la actividad óptima se detectó a 37 ◦C (Fig. 4A). El análisis de la actividad enzimática entre pH 3.0 y 9.0 mostró que el valor de pH óptimo se observó a pH 8,0 (tampón 100 mM KH2PO4-K2HPO4, Fig. 4C). El rendimiento del producto de glicosilación 3a aumentó linealmente en 1 hora y la tasa de crecimiento se estabilizó después de 5 horas (Fig. 4B). El valor Km aparente deCtUGT1para 3 fue 218,7 ± 7,176 μM, y Vmax fue 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min− 1⋅ug− 1.

3.5. Preparación enzimática e identificación estructural de productos glucosilados

Con base en los resultados de los ensayos enzimáticos,CtUGT1tiende a ser una glucosiltransferasa específica que podría catalizar la glucosilación de diferentes tipos de productos naturales. La información de HPLC-HR-MS de los productos se resumió en la Tabla 1. Entre ellos, los sustratos de cumarina exhibieron una tasa de conversión considerable. Se analizó adicionalmente la actividad enzimática contra las cumarinas. Cabe señalar que los tres sustratos de cumarina probados aceptados porCtUGT1tienen un grupo hidroxilo en la posición C-7, mientras que la esculetina (2) tiene un grupo hidroxilo adicional en la posición C-6. El perfil de HPLC del producto glucosilado de esculetina se muestra en la Fig. 2. Solo se observó un único producto, lo que sugiere que la reacción de glucosilación ocurrió de manera regioespecífica en la posición C-6 o C-7. Para confirmar el sitio de glicosilación, el producto 2a se identificó por comparación con los glucósidos auténticos mediante análisis HPLC-UV/HRESI-MS. Al agregar el glucósido auténtico cichoriin (glucosilado en la posición 7-OH de 2) en el sistema de reacción, el pico se superpuso con 2a, el perfil de co-HPLC confirmó además que el producto glicosilado de 2 catalizado porCtUGT1es cichoriin [33], que demostró que el resto glucosilo se transfirió específicamente en la posición C7-OH. El producto 1a también se identificó por comparación con el patrón de referencia. Los espectros de UV-HPLC junto con el análisis de co-HPLC (Fig. 2) revelaron que la estructura química de 1a se atribuyó como desnatado [34], que es el producto glucosilado de 1 en la posición C7-OH.

El producto 3a se preparó a partir de una reacción ampliada y se caracterizó estructuralmente mediante espectroscopía HRESI-MS, 1H NMR y 13C NMR (Figs. S13, S14 y Nota 4). En la señal de RMN de 1H, en comparación con el sustrato 3, desapareció una señal de hidroxilo fenólico en la posición C{{10}} y la señal de carbono de C-7 se desplazó a δ 1.{{25} } ppm al campo alto, mientras que las señales C-6 y C-8 cambiaron al campo bajo en 13C NMR. Estos hallazgos confirmaron que el residuo de glucopiranosilo estaba unido al grupo hidroxilo fenólico en la posición C-7 de 3 [35]. Además, el espectro de RMN de 1H mostró señales de protones anoméricos en δH 5.00 (1H, d, J=7,0 Hz); se indicó que el componente de azúcar era -D-glucopiranosa. Este resultado demostróCtUGT1es una cumarina O-glucosiltransferasa que catalizó la glucosilación de hidroxilo cumarina en la posición 7-OH.

3.6. Modelado de homología, acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida al sitio de la proteína CtUGT1

Extensas reacciones enzimáticas revelaron queCtUGT1podría catalizar la glucosilación de tres cumarinas en su correspondiente producto glucosilado, y la posición glucosilada ocurrió específicamente en la posición 7- OH. Identificar los residuos clave que determinaron las actividades de catálisis deCtUGT1, se realizaron investigaciones de modelado de homología, acoplamiento molecular y mutagénesis dirigida al sitio de CtUGT1. El modelo molecular homólogo para CtUGT1 se estableció utilizando SWISS-MODEL [21–25]. La estructura cristalina de Medicago truncatula glicosil transferasa UGT85H2 (PDB ID 2PQ6), determinada a una resolución de 2,1 Å, mostró la puntuación total más alta con la máxima homología de secuencia y un valor E bajo, se eligió como estructura molde [26]. La evaluación de la racionalidad del modelo establecido se mostró en el diagrama de Ramachandran (Fig. S6), el 88,5 por ciento de los residuos en el modelo establecido se encuentran en la región más favorecida. El modelo de homología de CtUGT1 consiste en dos motivos de pliegues de tipo Rossmann similares en el terminal N y C, respectivamente (Fig. 5A). El dominio N-terminal tiene láminas paralelas de siete hebras alrededor de diez hélices. El dominio C-terminal contiene láminas de seis hebras flanqueadas por nueve hélices (Fig. 5A, S7).

Para aclarar aún más el bolsillo activo deCtUGT1, se realizó el acoplamiento molecular. Dado que UGT85H2 solo tiene la estructura de forma apo, se seleccionó como molde de control otro homólogo UGT74F2 con UDP y ácido salicílico como dos ligandos. El UDPG se preparó como donante de azúcar. Se prepararon dos sustratos de cumarina 1 y 2 como aceptores de azúcar respectivamente. Los sitios de unión del donante y el aceptor de glucosilo se calcularon y acoplaron por separado como se muestra en la Fig. 5. Los resultados indicaron que los dos bolsillos de unión están ubicados dentro de la hendidura profunda en el área de interacción del dominio N-terminal estrechamente empaquetado y C -dominio terminal deCtUGT1y espacialmente cerca uno del otro (Fig. 5A). El C-terminal deCtUGT1participa principalmente en contacto con el donante de glucosilo como se describe en las UGT de otras plantas, y la mayoría de los residuos circundantes son hidrofílicos y están muy conservados. Como la típica caja de PSPG, el residuo W377 en este motivo podría formar enlaces de hidrógeno con el grupo glucosa de UDPG (Fig. 5B); N378 y S379 en este motivo podrían formar enlaces de hidrógeno con el grupo difosfato de UDPG (Fig. 5B). Además, según los resultados del acoplamiento, los residuos de W356 y Q359 pueden interactuar con el grupo uridina a través de la interacción del enlace de hidrógeno para estabilizar al donante en el bolsillo activo. Para verificar la función de estos residuos clave predichos, se seleccionaron un total de 16 sitios y se sometieron a mutagénesis de exploración de alanina. Las actividades de catálisis de estos mutantes se probaron utilizando los seis sustratos positivos mencionados anteriormente. Los análisis de HPLC mostraron que, cuando los residuos de G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 y D398 se mutaron en alanina, la actividad de glicosilación de la proteína fue totalmente perdido hacia todos los sustratos probados. Estos resultados sugirieron que los 16 residuos anteriores son los residuos clave que determinaron la unión del donante de UDPG y la actividad de glicosilación deCtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 por ciento) como V14, V132, E153, T212 e I209 (Fig. S8). Se predice que estos residuos hidrofóbicos que rodean el anillo aromático podrían formar interacciones de van der Waals con el sustrato en el bolsillo de unión.

4. Discusión

La glicosilación es uno de los pasos de modificación más importantes en las rutas de biosíntesis de muchos metabolitos secundarios. La glicosilación podría aumentar la biodisponibilidad de los productos naturales al mejorar su solubilidad en agua y reducir su toxicidad. La cumarina se considera la forma más simple dentro de una gran clase de sustancias fenólicas naturales construidas a partir de un anillo de -pirona fusionado con un anillo de benceno. Tanto los compuestos a base de cumarina naturales como los sintéticos han atraído la atención de los químicos médicos y los científicos de diseño de fármacos como consecuencia de sus diversas propiedades farmacológicas y biológicas [36]. Una mayor modificación glicosilada de las cumarinas podría ayudar a enriquecer la diversidad estructural de estos compuestos y también a mejorar su solubilidad y biodisponibilidad. En las plantas, este proceso de glicosilación es catalizado por la UDP-glucosiltransferasa. Aunque se han identificado múltiples UGT de diferentes plantas, hasta la fecha, la mayoría de las UGT informadas estaban involucradas en la modificación glicosilada de flavonoides. Se informó que solo las UGT limitadas podían aceptar cumarinas como sustratos. En este estudio, un nuevo gen de glicosiltransferasaCtUGT1fue clonado de la hierba china tradicionalCistanche tubulosa. La alineación de secuencias y los resultados del análisis filogenético mostraron queCtUGT1es filogenéticamente distante de la mayoría de los UGT de flavonoides informados y muy cercano a los UGT de fenilpropanoide. Extensos ensayos enzimáticos revelaron que CtUGT1 no podía catalizar la glicosilación de compuestos de fenil etanol para formar PhG, que es el principal componente químico deCistanche tubulosa. En cambio, podría reconocer las cumarinas como sus sustratos y realizar la reacción de glicosilación. La elucidación de la estructura de los productos mostró que el sitio de glicosilación catalizado porCtUGT1ocurría de manera regioespecífica en la posición C7-OH de las cumarinas. Usando CtUGT1, se sintetizaron e identificaron estructuralmente con éxito tres glucósidos de cumarina, incluido el desnatado (1a), la cichoriina (2a) y el 4-metilumbeliferil glucósido (3a). Estos tres compuestos se informaron como moléculas farmacéuticamente activas. Por ejemplo, se ha considerado que 1a posee diversas actividades farmacológicas, que incluyen actividad renoprotectora, propiedades antiinflamatorias, anticancerígenas y antiamebianas [37]. 2a mostró una alta actividad antibacteriana contra algunas bacterias Gram-positivas como Bacillus cereus y Staphylococcus aureus [38]. 3a puede ayudar a las plantas a mejorar su capacidad de respuesta a productos químicos y toxinas [39].

Además de las cumarinas, extensos ensayos enzimáticos encontraron queCtUGT1también mostró actividad de glucosilación observable hacia el sustrato de benzofenona 4, el sustrato de isoflavona 5 y el sustrato de antraquinona 6, lo que indicó que CtUGT1 tiene cierta tolerancia al sustrato. Sin embargo,CtUGT1no pudo catalizar la biosíntesis de los componentes de los glucósidos enCistanche tubulosatales como glucósidos de feniletanoide (PhG), glucósidos de lignanoide y glucósidos de iridoide. Además, de acuerdo con las investigaciones previas, no se aislaron glucósidos cumarínicos deCistanche tubulosa. Entonces, la función in vivo deCtUGT1todavía necesita ser explorado más a fondo. La actividad de glicosilación de CtUGT1 hacia sustratos cumarínicos convierte a esta enzima en una herramienta útil para la modificación de la glicosilación enzimática de cumarinas y también indicó que las enzimas metabólicas secundarias de las plantas podrían realizar actividades de catálisis inestimables que van mucho más allá de sus funciones nativas.

Declaración de interés en competencia

Los autores declaran que no existen conflictos de interés.

Reconocimiento

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (Subvención No. 7192112); Programa de patrocinio de jóvenes científicos de élite por CAST (Subvención No. CACM- 2018- QNRC1- 02); Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 81402809); Fondo de Becas Estatales del Consejo de Becas de China (Subvención No. 201906555010) y Fundación de Ciencias para Jóvenes Académicos Elite de la Universidad de Medicina China de Beijing (Subvención No. 2018-JYB-XJQ006).

Apéndice A. Datos complementarios

Los datos complementarios de este artículo se pueden encontrar en línea en https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

De: 'Clonación molecular y caracterización bioquímica de una nueva cumarina glicosiltransferasaCtUGT1deCistanche tubulosa' porXiping Xu, et al.

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

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