Evidencia molecular del potencial inhibitorio de la melatonina contra el envejecimiento inducido por NaAsO2-en ratas macho, parte 2

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3. Discusión

además, es ampliamente utilizado en la agricultura debido a sus propiedades antifúngicas, antibacterianas, herbicidas y rodenticidas. Como resultado del uso generalizado de herbicidas, pesticidas y antibióticos para el ganado a base de arsénico [28]. Por otro lado, MLT ha mostrado efectos antiinflamatorios, antioxidantes y antirradicales libres [29]. La eliminación de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno y el aumento de la defensa antioxidante previenen el daño tisular y bloquean los factores transcripcionales de las citocinas proinflamatorias [30]. MLT ayuda a minimizar el estrés oxidativo inducido por arsénico, como se muestra en este estudio. La exposición a ÷, 1/3 y 1/10 LD50 NaAsO provocó un aumento en la concentración tisular de As total en los tejidos del corazón y los pulmones de manera dependiente de la dosis. Por otro lado, se encontró que el tratamiento con MLT redujo la concentración de As en el tejido.tallo de cistancheLa MDA es un marcador de peroxidación de lípidos que juega un papel clave en el aumento del estrés oxidativo al aumentar las ROS y los marcadores inflamatorios en etapas tempranas como el TNF-o [31,32]. En contraste con los grupos de control y MLT, encontramos que la exposición a NaAsO2 causó un aumento significativo dependiente de la dosis en MDA y, posteriormente, en los niveles de ROS. Se demostró que el tratamiento con MLT revierte los niveles de MDA y ROS inducidos por NaAsO2-en muestras de corazón y pulmón. Nuestros resultados son similares a los de Taysi et al., quienes identificaron que MLT podría revertir el daño oxidativo causado por la irradiación [33]. HMGB1 es una citocina inflamatoria que se libera durante la fase tardía de la inflamación. Encontramos el nivel más alto de HMGB1 tanto en el corazón como en los tejidos pulmonares expuestos a 1/2 LD50 NaAsO2, incluso después de la extracción del tejido en el día 30 del análisis. El tratamiento con MLT, por otro lado, resultó en niveles más bajos de HMGB1.

De manera similar, las muestras de plasma expuestas a 1/2, 1/3 y 1/10 de LD50 NaAsO2 mostraron niveles elevados de TNF- y 8OHdG, que fue prevenido por MLT, lo que sugiere su papel como protector contra el daño oxidativo del ADN [34]. Los niveles elevados de lactato se utilizan como biomarcador de hipoperfusión tisular e insuficiencia mitocondrial [35]. Después de 30 días, hubo un aumento en los niveles de lactato en los tejidos del corazón y los pulmones, lo que indica que NaAsO tiene un efecto perjudicial sobre las mitocondrias. Por otro lado, se encontró que MLT defiende contra este efecto, reduciendo los niveles de lactato en ambos tejidos.

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El efecto protector de MLT también se confirmó mediante la evaluación de los niveles de expresión de ARNm de KL, TERT y TRADD. KL ha sido identificado como un gen que juega un papel en el proceso de envejecimiento [36]. En ratas, el arsenito reduce el KL circulante y renal y causa daño tubular [37]. En el tejido del corazón expuesto a NaAsO2, descubrimos una disminución significativa dependiente de la dosis (p<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">beneficios y efectos secundarios de la cistanche tubulosaEn este estudio se prefirió la administración IP de ambos agentes a la vía oral para evitar la posible modificación y degradación del tracto gastrointestinal. Además, la administración IP proporciona una absorción más rápida y fiable que la oral, lo que garantiza una biodisponibilidad óptima de agentes pequeños y grandes en estudios experimentales con roedores [42].

Varios estudios y revisiones indican que la melatonina produce efectos protectores significativamente más altos que los antioxidantes clásicos [43]. En estos estudios, se descubrió que la melatonina es más eficaz que la vitamina E[44-46], el betacaroteno [47l y el ácido ascórbico[48,49]. Además, en entornos clínicos, incluidas enfermedades crónicas como la artritis reumatoide [50], la hipertensión arterial [51] y la isquemia [52], se han informado efectos antioxidantes beneficiosos de la melatonina en comparación con las vitaminas. De manera similar, descubrimos que la exposición a NaAsO2 causa estrés oxidativo en los pulmones y los tejidos del corazón en función de la dosis y la toxicidad química. En el nivel alto de exposición LD50 NaAsO2, TNF- y 8OHdG en el plasma y MDA, ROS y HMGB1 en los tejidos del corazón y los pulmones estaban elevados. Estos hechos indican que la exposición al NaAsO2 desencadenó el estrés oxidativo en los tejidos pulmonar y cardíaco al producir MDA y ROS y aumentar la circulación de citocinas proinflamatorias como el TNF-. La hipoperfusión tisular, la insuficiencia mitocondrial y la inflamación pueden ser causadas por niveles elevados de lactato tisular y HMGB1. Los niveles elevados de 8OHdG en plasma sugieren que NaAsO2 causa daño en el ADN. De acuerdo con el análisis histológico, la dosis 1/2 de NaAsO2 en los tejidos del corazón de las ratas causó necrosis celular correlacionada con los resultados de la expresión del ARNm de los genes TERT y TRADD, mostrando un aumento significativo en los efectos inductores de la apoptosis del arsénico en los tejidos del corazón (Figuras 4 y 5). Sin embargo, con el uso combinado de MLT y NaAsO2, la eliminación de la necrosis fue mucho más potente y rápida en presencia de MLT que en su ausencia. Este aclaramiento se evidencia por la disminución de los niveles de expresión de ARNm de los genes TERT y TRADD. Análogamente, MLT atenuó los efectos tóxicos del arsénico en muestras de pulmón examinadas histológicamente, correlacionándose con los resultados obtenidos de los biomarcadores de estrés oxidativo e inflamatorio y la disminución en la puntuación de hiperemia, edema y células inflamatorias (tabla 4). Además, la exposición a NaAsO2 resultó en una expresión de ARNm de KL más baja y una expresión de ARNm de TERT y TRADD más alta, lo que indica un riesgo de envejecimiento del tejido cardíaco y muerte celular.

Por otro lado, el tratamiento con MLT redujo los niveles de MDA, ROS, HMGB1 y lactato en tejidos pulmonares y cardíacos, así como los niveles de TNF-c y 8OHdG en plasma. También impulsó la expresión de ARNm del gen KL mientras suprimía la expresión de ARNm de los genes TERT y TRADD. Esto indica que MLT protege los tejidos pulmonares y cardíacos al revertir el riesgo de envejecimiento inducido por el estrés oxidativo desencadenado por NaAsO. Sin embargo, se necesita más investigación para explorar el papel protector de MLT contra el envejecimiento inducido por arsénico en otros tejidos, como el hígado y el riñón, y la eficacia de MLT para reducir los niveles de arsénico en los tejidos.

Cistanche puede antienvejecimiento

4. Materiales y Métodos

4.1.Químicos

MLT (número CAS 73-31-4), NaAsO2 (número CAS 7784-46-5), Suprapur HNO3 (Merck, Darmstadt, Alemania) y todos los demás productos químicos utilizados en este estudio se compraron a Sigma-Aldrich (GmbH, Munich). , Alemania). El kit de aislamiento de lactato y el kit ELISA para el análisis de la caja 1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) se adquirieron de ZellBio GmbH (Ulm, Munich, Alemania), y el kit de análisis de TNF se obtuvo de Diaclone (Besancon Cedex, Francia). El kit de síntesis de ADNc de la primera hebra de Thermo Scientific Revert Aid se obtuvo de Thermo Fisher (Vilnius, Lituania).

4.2.Aprobación Ética

La manipulación, el cuidado, la matanza y otros procedimientos relacionados con animales se llevaron a cabo de conformidad con las directrices sobre investigación con animales: informes de experimentos in vivo (AR-RIVE). Se realizaron investigaciones y experimentos bioquímicos y de laboratorio de acuerdo con las Buenas Prácticas de Laboratorio.extracto de cistanche tubulosaEl Comité de Investigación del Instituto Nacional para el Desarrollo de la Investigación Médica (NIMAD) otorgó la aprobación ética para este estudio que involucra el uso y tratamiento de animales bajo un número de código: IR.NOMAD.REC.1397.542.

4.3.Diseño del estudio

En este estudio, utilizamos ratones machos, no hembras, ya que las variaciones cíclicas en el nivel de hormonas femeninas pueden influir en los estudios toxicológicos. Por lo tanto, se obtuvieron 30-35 g de ratones NMRI machos adultos sanos y libres de enfermedad de 7 a 8 semanas de edad de la casa de animales de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Ciencias Médicas de Teherán, Teherán, Irán. Se mantuvieron en condiciones ambientales controladas, incluida una temperatura ambiente de 20 a 25 grados, una humedad relativa del 50 al 55 por ciento y un período de luz y oscuridad de 12- horas. Tenían libre acceso a una dieta estándar y agua. Los ratones se dividieron en ocho grupos de seis ratones cada uno. El grupo 1 recibió una dieta normal estándar. El grupo 2 recibió una inyección intraperitoneal (IP) de 10 mg/kg/día de MLT, los grupos 3, 4 y 5 recibieron 1,5 (1/10 LD50), 5 (1/3 LD50) y 7,5 (1/2 LD50) mg/kg NaAsO2, respectivamente. A los grupos 6, 7 y 8 se les inyectó por vía intraperitoneal 1,5 (1/10 LD50), 5 (1/3 LD50) y 7,5 (1/2 LD50) mg/kg de NaAsO, junto con 10 mg/kg/día de MLT, respectivamente durante los últimos diez días del experimento. Después de un mes de tratamiento, se usaron inyecciones IP de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina para matar a los ratones. Las muestras de sangre se recogieron en EDTA y tubos separadores de suero. Los corazones y los pulmones se extrajeron inmediatamente y se congelaron a -80 grados para el análisis bioquímico. El tejido se recogió de las muestras de corazón y pulmón para su examen patológico. Después de lavar con tampón de fosfato estéril (pH 7,4), se mantuvieron en 10 mL de formalina al 10 por ciento (Figura 6).

4.4. Evaluación del arsénico tisular total utilizando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente

El arsénico total en los tejidos de la muestra se determinó utilizando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) (Perkin Elmer ELAN 6100 DRC-e). Los parámetros del instrumento se mencionan en la Tabla complementaria S1. Se añadieron dos ml de tampón de fosfato a 0,20 g de cada muestra y los tejidos se homogeneizaron completamente.opiniones sobre la cistanche tubulosaLos tejidos homogeneizados se transfirieron a tubos de ensayo de vidrio y se secaron en un baño de arena a 120 grados (aproximadamente durante la noche). Una vez que las muestras alcanzaron la temperatura ambiente, cada tubo se llenó con 0,5 ml de HNO3 concentrado y se calentó durante dos días. Las temperaturas no superaron los 120 grados durante el proceso de calentamiento. Luego se agregaron 0.5 mL de HNO3 concentrado a cada tubo de ensayo hasta que quedó ceniza blanca. Después de completar la digestión y enfriar las soluciones, se añadió 1 ml de HNO al 10 por ciento a cada tubo de vidrio y se sonicó durante 30 minutos a 50 grados. El contenido de los tubos de vidrio se transfirió a un matraz volumétrico de 5 mL y se calibró al signo con HNO3 al 10 por ciento. Se usó HNO3 al 10 por ciento para preparar soluciones estándar con concentraciones de 1, 5, 10 y 15 ug/L de As, y se usó solución estándar de germanio (5 g/l) como solución estándar interna [53].

4.5. Evaluación de biomarcadores de estrés oxidativo

El ensayo de sustancia reactiva con ácido tiobarbitúrico (TBARS) se utilizó para medir la actividad de peroxidación lipídica (LPO) mediante el cálculo de los niveles de malondialdehído (MDA) en los tejidos del corazón y los pulmones. Se homogeneizaron muestras de tejido cardíaco o pulmonar de 0,15 g cada una en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se mezclaron con 800 ml de ácido tricloroacético y se centrifugaron durante 40 min a 3000 g. Luego, se agregaron 150 mL de ácido tiobarbitúrico al 1 por ciento p/v al sobrenadante de 600 mL y se colocaron en agua hirviendo durante 15 minutos. Finalmente, se agregaron 400 mL de n-butanol y se usó un espectrofotómetro para reportar la absorbancia a 532 nm [54].

4.6. Evaluación de especies reactivas de oxígeno

Los niveles de ROS en muestras de corazón y pulmón se calcularon de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente [55]; 100 mg de cada muestra fresca de tejido de corazón y pulmón se homogeneizaron con una solución tampón de extracción que contenía HEPES (5 mM), KCl (20 mM), EDTA, (1 mM) y sacarosa (0,25 M), pH=7,4 en cada vial de tampón de fosfato y centrifugado a 10000 g durante 10 min a 4 grados después de añadir el DL-ditiotreitol( DTT, 50 uM). En el siguiente paso, los sobrenadantes de las muestras de tejido de corazón y pulmón se mezclaron con 80 μL de tampón de ensayo y 5 μL de DCFH-DA (5 μM) durante 15 min a 37 grados; 2',7'-diclorofluoresceína diacetato (DCF-DA) es un agente fluorogénico que penetra en las células y se convierte en 2',7-diclorodihidrofluoresceína (DCFH). Luego, DCFH fue catalizado por esterasa intracelularmente y oxidado por ROS en 2'7'-diclorofluoresceína (DCF). Finalmente, la absorbancia DCF se midió cada 5 min con un lector de espectrofotómetro de microplacas multimodo (BioTek⑧, SynergyM HT, Winooski, VT, EE. UU.) durante 60 min con espectros de excitación y emisión de 488 nm y 525 nm, respectivamente. Para estandarizar los datos obtenidos del ensayo ROS, se utilizó cada grupo de muestras de tejido diluido para determinar el nivel de proteína. En resumen, se añadieron 10 μL de reactivo de Bradford a 100 μL de muestras diluidas y, después de incubar a temperatura ambiente durante 15 min, se leyó la absorbancia de cada muestra a 595 nm.

4.7.Evaluación de Citocinas Proinflamatorias

Se evaluaron los niveles de citocinas proinflamatorias, es decir, TNF- en plasma y HMGB1 en muestras de corazón y pulmón. Estos se reconocen como el principal mediador de la sepsis en las fases temprana y tardía [56]. Se midió el nivel de HMGB1 para los tejidos del corazón y los pulmones, que se mantuvieron a 80 grados. Se aisló una cantidad de 100 mg de tejido cardíaco y pulmonar aislado de cada animal y se homogeneizó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los niveles de TNF- y HMGB1 se cuantificaron según el protocolo del fabricante. La absorbancia se estimó a 450 nm.cistancheLos niveles de TNF- y HMGB1 se registraron en pg/mg de proteína y ng/mg de proteína, respectivamente.

4.8.Evaluación del daño del ADN

La ocho-hidroxi-2-desoxiguanosina (8OHdG) es un producto del daño oxidativo del ADN. Es un biomarcador esencial para el daño del ADN. Los niveles plasmáticos de 8-hidroxi-2-desoxi guanosina (8OHdG) se determinaron según el kit ELISA 8OHdG (ZellBio GmbH [Ulm, Alemania]).

4.9.Evaluación del Nivel de Lactato

Los niveles de lactato de la muestra de tejido se midieron utilizando un kit de ensayo de lactato colorimétrico de acuerdo con el protocolo proporcionado (ZellBio GmbH [Ulm, Alemania]). En resumen, se homogeneizaron 10 ml de ácido perclórico al 8 por ciento con 100 mg de muestras de corazón y pulmón. Se aplicó la curva estándar y se registró como mmol/mg de proteína tisular para medir los niveles de lactato.

4.10. PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real para la expresión génica

Para detectar la función de MLT y NaAsO2 en la expresión génica a nivel de ARNm, se utilizó PCR de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). A este respecto, se evaluaron tres genes asociados con diferentes vías moleculares, TERT, receptor del factor de necrosis tumoral del dominio de muerte asociado tipo 1 (TRADD) y KL (relacionado con la actividad de Klotho). El ARN de tejido se extrajo utilizando el protocolo de solución RNX-Plus (SinaClon, Irán) de muestras de corazón congeladas. La pureza del ARN se calculó espectrofotométricamente mediante Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, EE. UU.). Se usó el kit RNase-Free DNase I para eliminar el ADN genómico, luego se transcribió inversamente un microgramo de ARN extraído a ADNc. Los genes diana se normalizaron con el gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno. Se utilizó el sistema LightCycler③96 (Roche, Indianápolis, IN, EE. UU.) para el análisis qRT-PCR. Se usó la mezcla maestra SYBRgreen y se realizó qRT-PCR en condiciones, es decir, un ciclo a 94 grados durante 10 min, 40 ciclos a 95 grados durante 15 s y temperatura de hibridación durante 30 y luego 72 grados durante 25 s. Los resultados se informaron de acuerdo con el Método Pfaffle [57]. Los cebadores específicos utilizados en el presente estudio se muestran en la Tabla 5.

4.11.Evaluaciones Histológicas Ex Viro

Se recolectaron muestras de tejido de corazón y pulmón después de sacrificar a los animales el día 30, mientras que las muestras de tejido se almacenaron en 10 ml de una solución de NaCl al 0,9 por ciento. Las muestras se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 por ciento (NBF, PH.7.26) durante 48 h, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 5 um. Las secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina y un examinador independiente las evaluó mediante microscopía óptica (Olympus BX51; Olympus, Tokio, Japón).

4.12. Análisis estadístico

Los resultados se presentaron como media ± error estándar de la media (SEM). La significación estadística se evaluó mediante un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con significancia estadística en p<>

5. Conclusiones

Concluimos que el tratamiento con MLT puede ayudar a reducir el envejecimiento mediado por estrés oxidativo inducido por NaAsO2-. El NaAsO2 provoca estrés oxidativo, inflamación, daño en el ADN y muerte celular en los tejidos pulmonar y cardíaco al elevar los niveles de MDA, ROS, lactato, HMGB1, TNF-x y 8OHdG, lo que puede provocar el envejecimiento y la lesión de los tejidos, como lo demuestra la disminución del ARNm niveles de expresión de KL inducidos por NaAsO, y aumento de la expresión de los genes TERT y TRADD (Figura 7). El tratamiento con MLT, por otro lado, redujo la toxicidad dependiente de la dosis de NaAsO2. Se ha demostrado que MLT protege los pulmones y el corazón de la lesión tisular y el envejecimiento inducidos por NaAsO2-al reducir el riesgo de estrés oxidativo, inflamación, daño en el ADN y normalizar los niveles de expresión de ARNm de los genes KL, TERT y TRADD.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 6603. https://doi.org/10.3390/molecules26216603 https://www.mdpi.com/journal/molecules