Nc886, un ARN no codificante, es un nuevo biomarcador y mediador epigenético de la senescencia celular en fibroblastos

Abstracto:

Los estudios funcionales de organismos y modelos humanos han revelado que los cambios epigenéticos pueden afectar significativamente el proceso de envejecimiento. El ARN no codificante (ncRNA), uno de los reguladores epigenéticos, juega un papel importante en la modificación de la expresión de los ARNm y sus proteínas. Puede mediar el fenotipo de las células. Se ha informado que nc886 (=vtRNA2-1 o pre-miR-886), un ncRNA largo, puede suprimir la formación de tumores y los daños causados ​​por los rayos UVB en los queratinocitos. Este estudio tuvo como objetivo determinar el papel de nc886 en la senescencia replicativa de los fibroblastos y determinar si las sustancias capaces de controlar la expresión de nc886 podrían regular la senescencia celular.

En los fibroblastos de senescencia replicativa, la expresión de nc886 disminuyó mientras que aumentó el nc886 metilado. Hubo cambios en los biomarcadores de senescencia, incluida la actividad SA- -gal y la expresión de p16INK4A y p21Waf1/Cip1 en células senescentes. Estos hallazgos indican que la disminución de nc886 asociada con el envejecimiento está relacionada con la senescencia celular de los fibroblastos y que el aumento de la expresión de nc886 tiene el potencial de suprimir la senescencia celular. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) aumentó la expresión de nc886 y mejoró la senescencia celular de los fibroblastos al inhibir los biomarcadores relacionados con la edad. Estos resultados indican que nc886 tiene el potencial como un nuevo objetivo para el antienvejecimiento y que ATC puede ser un potente ingrediente antienvejecimiento epigenético.

La senescencia celular es un término amplio que abarca fenómenos como la disminución de la función celular, la disminución de la capacidad proliferativa y el daño del ADN causado por muchos factores. La senescencia celular no es un proceso único y predecible, sino el efecto combinado de una gama de diferentes factores fisiológicos, genéticos y ambientales. En la investigación, se encontró que Cistanche puede resistir el envejecimiento porque el principio antienvejecimiento de Cistanche está relacionado principalmente con los diversos ingredientes activos que contiene. Cistanche es rico en una variedad de sustancias biológicamente activas, como polisacáridos, flavonoides, acetofenonas, etc. Entre ellos, el polisacárido es uno de los principales ingredientes activos de Cistanche, que tiene varias funciones para la salud, como mejorar la inmunidad, la antioxidación, regular el metabolismo, etc., y puede aliviar el grado de envejecimiento del cuerpo.

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Palabras clave:

fibroblastos; senescencia replicativa; regulación epigenética; nc886; extracto de te verde.

1. Introducción

La senescencia celular en un estado irreversible después de la detención de la proliferación celular ha surgido como un contribuyente potencialmente importante a la disfunción tisular y al envejecimiento de los organismos [1]. La senescencia se caracteriza por una alta actividad de la beta-galactosidasa asociada a la senescencia (SA- -gal), aumento de la expresión de biomarcadores de senescencia como p16INK4A y p21Waf1/Cip1, y disminución de la expresión de LaminB1 [2]. Hay dos tipos básicos de senescencia celular: senescencia replicativa y senescencia prematura inducida por estrés. La senescencia replicativa se define como el fenómeno cuando las células normales dejan de dividirse después de alcanzar un número limitado de divisiones. Está relacionado con el envejecimiento cronológico. La acumulación continua de daño puede inducir la senescencia replicativa de los fibroblastos, lo que lleva a la pérdida de la capacidad para remodelar y organizar la matriz extracelular (ECM). Las principales características de la dermis envejecida son una cantidad reducida de fibras de colágeno y una mayor producción de metaloproteinasas de matriz (MMP), que contribuyen a una estructura delgada y desorganizada de la dermis [3,4].

Los mecanismos reguladores epigenéticos son mediadores clave del proceso de envejecimiento, adaptándose a factores estresantes y cambios relacionados con la edad en el entorno genómico y molecular. Estas alteraciones epigenéticas ocurren en varios niveles, incluida la reducción masiva de histonas centrales, la deformación de histonas por modificación postraduccional y metilación del ADN, el reemplazo de histonas canónicas con variantes de histonas y la expresión alterada de ARN no codificante (ncRNA) durante la senescencia replicativa y del organismo [5]. ,6]. nc886 es un ncRNA de 101 nucleótidos de longitud que puede unirse a una proteína diana, mediando así la actividad de la proteína y controlando la expresión génica [7]. nc886 también se ha propuesto como un supresor de tumores inferido en gran medida por su patrón de expresión y su ubicación genómica en el cromosoma humano 5q31, el locus del gen supresor de tumores. Una característica de la expresión de nc886 es el frecuente silenciamiento de los tumores malignos por la metilación del ADN CpG en la región promotora [8]. Con base en estudios previos, hemos encontrado que la reducción de la expresión de nc886 causada por la radiación UVB está asociada con aumentos de COX-2 y MMP-9 a través de la vía activada por ARN de proteína quinasa (PKR) en queratinocitos y que la promoción de la expresión de nc886 puede ser una estrategia útil para desarrollar materiales de protección UVB [9,10].

El té verde se ha estudiado como tratamiento para una variedad de afecciones dermatológicas, como el acné, la rosácea, la psoriasis, las verrugas virales e incluso el cáncer de piel. Los compuestos fenólicos, incluidos el ácido gálico (GC) y el galato de epigalocatequina (EGCG), son compuestos activos bien conocidos en el té verde. (-)-Epigalocatequina-3-(3"-O-metil) galato (3" Me-EGCG) es una forma O-metilada única de EGCG y se encuentra en el té oolong y el té verde. En particular, Jangwon No. 3 (variedades Amorepacific de té verde) contiene más 3" Me-EGCG que otras variedades de té verde [11]. Se ha informado que 3" Me-EGCG exhibe efectos antioxidantes y fotoprotectores en los queratinocitos [12] . En este estudio, investigamos el papel de nc886 en la senescencia replicativa de los fibroblastos y determinamos si la preparación de Me-EGCG de 3" de té verde altamente concentrado (AbsoluTea Concentrate 2.0) que podría aumentar la expresión de nc886 podría mejorar la senescencia celular.

2. Resultados

2.1. Perfil químico del concentrado 2 de AbsoluTea.0 (ATC)

El perfil químico de AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) se muestra en la Figura 1B. Los resultados se obtuvieron usando HPLC para ATC preparado como se describe en la sección Método. ATC contenía 30 por ciento o más de 3" Me-EGCG (Figura 1B). Se sabe que el extracto de té verde no contiene 3" Me-EGCG o muestra una concentración de menos del 6 por ciento [13,14]. Tanto los fibroblastos jóvenes como los senescentes tratados con ATC mostraron más aumentos en la expresión de nc886 que los tratados con extracto etanólico de té verde al 70 por ciento (Figura complementaria S1A). Además, los niveles de expresión de SA- -gal en los fibroblastos senescentes tratados con ATC se redujeron más que en los tratados con extracto de té verde (Figura complementaria S1B).

2.2. nc886 regula la senescencia celular de los fibroblastos

Para observar el papel de nc886 en la senescencia celular de los fibroblastos, utilizamos un modelo de senescencia replicativo mediante crecimiento y subcultivo. Como se muestra en la Figura complementaria S2, la actividad de SA- -gal y los niveles de expresión de los marcadores senescentes p16INK4A y p21Waf1/Cip1 aumentaron y la expresión de Lamin B1 disminuyó en fibroblastos senescentes en comparación con células jóvenes. Muchos estudios previos han informado que el envejecimiento es causado por el estrés oxidativo. Para confirmar si esta serie de estrés oxidativo está involucrada con la senescencia celular, se midieron los niveles de ROS en fibroblastos jóvenes (p3) y senescentes (p30). Los resultados mostraron que los niveles de ROS aumentaron con el envejecimiento (Figura complementaria S2D).

Para observar el impacto potencial de nc886 en la senescencia celular en fibroblastos, se determinó el nivel de expresión del gen nc886 en cada número de pases. El nivel de expresión de nc886 disminuyó al aumentar el número de pases (Figura 2A). Se ha informado que la expresión de nc886 disminuye con la metilación de las islas CpG. Para determinar si la regulación negativa de nc886 en fibroblastos senescentes estuvo mediada por la metilación de nc886, se realizó una PCR específica de metilación. Como se muestra en la Figura 2A, la metilación de nc886 aumentó con un número creciente de pases (Figura 2A). Este resultado demuestra que la expresión reducida de nc886 en un alto número de pases de fibroblastos se debe a un aumento en la metilación del ADN de nc886. Para verificar el papel de nc886 en la senescencia de los fibroblastos, se determinaron los cambios en los marcadores senescentes en los modelos de sobreexpresión y eliminación de nc886. Los resultados revelaron que el grupo de fibroblastos senescentes con sobreexpresión de nc886 mostró una disminución de la actividad de SA-beta-gal, disminución de los niveles de expresión de p16INK4A y p21Waf1/Cip1 y aumento de los niveles de laminB1.

Además, el aumento de ROS en fibroblastos senescentes disminuyó por la sobreexpresión de nc886 (Figura 2B). Por el contrario, en el grupo de fibroblastos jóvenes con eliminación de nc886, se aceleró la senescencia celular y aumentaron los niveles de expresión de marcadores celulares senescentes como p16INK4A y p21Waf1/Cip1 (Figura 2C). Estos resultados sugieren que nc886 puede regular la senescencia celular de los fibroblastos al regular la expresión de marcadores de senescencia (Figura 2B, C).

2.3. ATC mitiga la senescencia celular al regular la expresión de nc886

Los resultados obtenidos anteriormente mostraron que el aumento de la expresión de nc886 podría mejorar la senescencia celular mediante la mediación de marcadores senescentes. Para observar el efecto de ATC en la expresión de nc886, se evaluó el nivel de expresión y la metilación de nc886 en fibroblastos senescentes después del tratamiento con ATC en una concentración no citotóxica (Figura 3A). Como se muestra en las Figuras 3B y C, ATC aumentó significativamente la expresión de nc886 y disminuyó la metilación de nc886 de una manera dependiente de la concentración. Este resultado demostró que el aumento de la expresión de nc886 por ATC estuvo mediado por la inhibición de la metilación de nc886. Además, observamos que ATC inhibía la actividad de SA- -gal y disminuía los niveles de expresión de los marcadores senescentes p16INK4A y p21Waf1/Cip1 en fibroblastos senescentes (Figura 3D, E). Sin embargo, la expresión de LaminB1 que se sabe que disminuye con el envejecimiento aumentó en los fibroblastos senescentes tratados con ATC (Figura 3E). Estos resultados demuestran que ATC puede mitigar la senescencia celular aumentando la expresión de nc886.

Figura 2. nc886 regula la senescencia celular de los fibroblastos. (A) La expresión de nc886 y nc886 metilado según el pase se confirmó mediante PCR en tiempo real y se normalizó con ARNr 18s. (B) El fragmento nc886 amplificado y purificado a partir de ADN genómico humano se transfectó en células senescentes con lipofectamina 3000. La sobreexpresión se confirmó observando la expresión de nc886 mediante PCR en tiempo real y la expresión de SA- -gal mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. La expresión de la proteína marcadora de senescencia y la generación de ROS intracelular se observó en el modelo de sobreexpresión de nc886. (C) Las células se transfectaron con anti-oligos (si-ctrl y si-nc886) a una concentración de 250 ppm usando el reactivo LipofectamTM RNAiMAX. La eliminación de nc886 se confirmó observando la expresión de nc886 mediante PCR en tiempo real y la expresión de SA- -gal mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. La expresión de marcadores de senescencia se confirmó con Western blot. Barras de escala: 200 µm. Los datos se presentan como media ± DE de tres ensayos independientes. *, p < 0,05; **, p < 0,01 en comparación con el control.

2.4. ATC regula los cambios relacionados con la edad de ECM y SASP

Una característica de la senescencia de los fibroblastos es que aumenta la actividad de MMP-1, un componente que degrada el colágeno, mientras que disminuye la síntesis de colágeno [15,16]. El aumento de MMP-1 y la disminución de colágeno se confirmaron en fibroblastos senescentes con un alto número de pasajes (Figura 4A).

Sin embargo, ATC suprimió la expresión de MMP-1 y aumentó la síntesis de colágeno en fibroblastos senescentes. Este resultado indica que ATC puede mejorar el cambio de ECM relacionado con la edad a través de la regulación de la expresión de MMP-1 y la síntesis de colágeno en fibroblastos senescentes (Figura 4B). Se ha informado que un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en el que las células senescentes secretan factores proinflamatorios específicos, factores de crecimiento y enzimas proteolíticas contribuye a la aparición y progresión de enfermedades relacionadas con el envejecimiento [17-19]. Observamos el efecto de ATC en SASP, particularmente citocinas proinflamatorias como IL-1, IL_6 e IL-8. Como se muestra en la Figura 4C, ATC reguló a la baja los niveles de expresión de IL-1, IL-6 e IL-8 inducida por la senescencia. Esto sugiere que ATC puede ejercer un efecto antienvejecimiento a través de la supresión de SASP.

3. Discusión

Las células senescentes experimentan cambios morfológicos característicos que implican una reorganización nuclear y de cromatina agrandada y, a menudo, irregular. Cuando la senescencia es inducida por daño en el ADN, agotamiento de la replicación o expresión de oncogenes, Lamin B1 se pierde principalmente. Varios factores estresantes internos o externos pueden desencadenar la vía de respuesta al daño del ADN (DDR) para activar la vía p53 y/o p16INK4A. p16INK4A puede inactivar Cdk4/6, dar como resultado la acumulación de pRb fosforilada, interrumpir la regulación del factor de transcripción E2F e inducir la detención del ciclo celular o la senescencia [20,21]. El aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), producidas principalmente por mitocondrias disfuncionales, puede conducir a la senescencia celular a través del daño del ADN y la transactivación de las vías de señalización de la senescencia, incluidas p53, p16INK4A y p21Waf1/Cip1 [22].

En este estudio, encontramos que la expresión de nc886 disminuyó con el aumento del número de pases y que la regulación positiva de la expresión de nc886 mitigó la senescencia celular a través de la mediación de la producción de LaminB1, p16INK4A, p21Waf1/Cip1 y ROS. nc886 es transcrito por la ARN polimerasa III (Pol III) y silenciado por la hipermetilación del ADN CpG en muchas neoplasias malignas [8]. Observamos que la expresión de nc886 disminuyó con la metilación de islas CpG en fibroblastos senescentes. Este resultado indica que la hipermetilación de las islas CpG perjudica la funcionalidad de nc886 como supresor de la senescencia celular.

Las vías de expresión génica específicas afectadas por nc886 no están claras. Es probable que incluyan informes previamente informados para otros ncRNA. nc886 puede desempeñar un papel fundamental en la senescencia celular a través de la mediación directa o indirecta de la vía de señalización de la senescencia a niveles de estructura de cromatina, actividad del factor de transcripción, regulación génica postranscripcional y postraduccional [23]. Por ejemplo, nc886 puede mediar en la vía de la senescencia de la progresión del ciclo celular.

Se ha informado que AK156230 como ncRNA está asociado con la inducción de la senescencia replicativa de los fibroblastos a través de sus funciones en la autofagia y la progresión del ciclo celular. La regulación negativa de las células inducidas por AK156230 mostró respuestas de senescencia al activar p53 y p21 mientras disminuía la quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK1) [24]. El ncRNA1 asociado a la senescencia (SAL-RNA1), MALAT1 y MIAT se conocen como reguladores negativos de la senescencia celular. Están disminuidos en los fibroblastos senescentes. La regulación a la baja de estos genes puede conducir a aumentos en los marcadores de senescencia como SA-gal, p16, p21 y p53 [25]. El efecto de MALAT1 sobre la senescencia celular se logró mediante la disminución del factor de transcripción oncogénico b-Myb/Mybl2.

Aunque la expresión de varios ncRNA se ve afectada durante la senescencia, solo unos pocos están funcionalmente involucrados en la senescencia. Debido a que la localización de los ncRNA es importante para comprender los mecanismos involucrados en la función, los ncRNA nucleares y citoplasmáticos se analizan por separado al describir los mecanismos moleculares que afectan la senescencia [26]. El ncRNA ubicado en el citoplasma puede funcionar como un regulador de la traducción a través del apareamiento de bases con el mRNA diana [27]. El ncRNA puede afectar los niveles de expresión de proteínas al aumentar o disminuir la estabilidad del mRNA [28].

Por ejemplo, durante la senescencia inducida por RAS, el UCA1 citoplásmico contribuye a la estabilización del ARNm de p16 mediante el secuestro de hnRNPA1 [29]. nc886 contiene un sitio de unión activado por ARN de proteína quinasa (PKR). La unión de PKR-nc886 puede inhibir la actividad de PKR. PKR, un receptor citoplasmático para ARN de doble cadena (dsRNA), está regulado por la serina/treonina proteína quinasa que se activa por infección, citoquinas, estrés oxidativo e irradiación (incluidos los rayos UV), lo que lleva a la inducción subsiguiente de inflamación y apoptosis [20]. ,21] [30,31]. nc886 se une a PKR con una afinidad comparable a la de dsRNA y evita que se active PKR. La eliminación de nc886 da como resultado la fosforilación de la subunidad del factor 2 de iniciación eucariota (eIF2) a través de la vía PKR, lo que provoca la muerte celular e inhibe la síntesis global de proteínas celulares. Se ha informado que la producción de COX-2, IL-8 y MMP por TNF- está mediada por la vía PKR en condrocitos humanos [32].

En un estudio anterior, también demostramos que la inflamación inducida por UVB se puede regular a través de la vía nc886-PKR en los queratinocitos [10]. Además, la PKR está relacionada con la lesión inducida por el estrés oxidativo en los miocitos cardíacos neonatales. La inhibición de PKR protege contra la lesión inducida por H2O2- al atenuar la apoptosis y la inflamación [33]. La inflamación y el estrés oxidativo son factores importantes que inducen el proceso de envejecimiento. Por lo tanto, la ruta de PKR puede mediar en la senescencia celular de los fibroblastos inducida por el agotamiento de nc886. Para dilucidar el mecanismo regulador detallado involucrado en el efecto de nc886 sobre la senescencia celular de los fibroblastos, se necesitan más estudios.

Los efectos antienvejecimiento del extracto de té verde se han informado ampliamente en estudios anteriores. Las actividades antioxidantes y antiinflamatorias del té verde son mecanismos bien conocidos que contribuyen a su efecto antienvejecimiento. En una prueba preliminar, encontramos que ATC aumentó significativamente la expresión de nc886 en más del 70 por ciento del extracto etanólico de té verde (Suplemento Figura S1A). Este resultado sugiere que las catequinas concentradas que incluyen 3" Me-EGCG pueden atribuirse a la regulación positiva de la expresión de nc886. Para determinar si el agente estimulante de nc886 podría prevenir la senescencia celular, observamos el efecto de ATC en los fibroblastos senescentes. ATC aumentó la expresión de nc886 por inhibiendo el nivel de metilación del gen nc886 en fibroblastos senescentes (Figura 3B, C). ATC también alivió la senescencia celular al mediar biomarcadores senescentes como la actividad SA- -gal, LaminB1, p16INK4A y p21Waf1/Cip1 (Figura 3E ). Además, el ATC restauró el aumento de MMP-1 y la disminución de la producción de colágeno inducida por la senescencia celular (Figura 4B). Los factores SASP varían ligeramente según el tipo de célula y el tipo de estrés inducido por el envejecimiento. conocidos como genes diana para NF-κB que regulan las citocinas proinflamatorias como IL-6 e IL-8.

En este estudio, confirmamos que el ATC suprimió el aumento de la expresión de IL-1, IL_6 e IL-8 en células senescentes (Figura 4C). No podemos excluir la posibilidad de que el efecto de mejora del té verde sobre la senescencia celular se logre mediante múltiples mecanismos, incluida la regulación nc886, la antioxidación y la antiinflamación. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el aumento de nc886 por ATC juega un papel fundamental en la supresión de la senescencia celular, lo que posteriormente afecta la producción de fibroblastos de ECM.

4. Materiales y Métodos

4.1. Preparación de ATC

Las hojas secas de té verde (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon No. 3) utilizadas para el estudio actual se obtuvieron de plantas de té cultivadas en el jardín de té Dolsongi (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Corea del Sur. Se extrajeron hojas de té secas (170 g) con EtOH al 70 por ciento (v/v) a temperatura ambiente durante 16 h. Luego, el extracto se pulverizó usando un liofilizador (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, China). Para preparar ATC, el extracto de EtOH se concentró diez veces con un evaporador rotatorio y se cargó en una columna rellena con resina AB-8 (diámetro interior 5 cm, longitud 45 cm). La elución con disolvente de la columna se realizó con 4 veces el volumen del lecho (BV) de 20 por ciento, 30 por ciento y 100 por ciento de EtOH (v/v). En este estudio, los disolventes residuales de la columna se eliminaron con un compresor de aire antes de la elución. El eluato de EtOH al 30 por ciento se concentró veinte veces y se aplicó a una columna de poliamida (diámetro interior 2,5 cm, longitud 40 cm). La columna de poliamida se eluyó 5 veces BV de 10 por ciento y 100 por ciento de EtOH. El eluato de EtOH al 100 por ciento se concentró cuidadosamente y se liofilizó.

4.2. Cultivo Celular y Tratamiento Celular con ATC

Los fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se adquirieron de ATCC (Manassas, VA, EE. UU.). El cultivo celular se llevó a cabo en condiciones controladas a 37 ◦C con 5 % de CO2 utilizando medio de Eagle modificado por Dulbecco (WELGENE, Daegu, Corea) suplementado con 10 % de suero bovino fetal (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y 1 % de penicilina -estreptomicina (WELGENE, Daegu, Corea). Las células se sembraron en 6-placas de pocillos a una densidad de 2 × 105 células/placa. Después de alcanzar el 60 por ciento de confluencia, se trataron con la concentración indicada de ATC durante 72 h.

4.3. Análisis de citometría de flujo y tinción de SA- -Gal

Las células se tiñeron usando un SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se analizaron con un sistema de imágenes de células EVOS® FL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y un citómetro de flujo BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

4.4. Medición de ROS intracelular

La producción de ROS intracelular se controló mediante C20,70 -diacetato de diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA; Molecular Probes), un indicador fluorescente de ROS. Las células se incubaron con H2DCFDA (5 µM) durante 30 min a 37 ◦C. La fluorescencia asociada a las células se detectó con un citómetro de flujo BD FACS Calibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.).

4.5. PCR en tiempo real y PCR específica de metilación

El ARN total se extrajo con TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La medición cuantitativa del ARN se realizó utilizando un espectrofotómetro de microplacas Epoch (BioTek, Winooski, VT, EE. UU.). El ADNc se sintetizó utilizando una mezcla maestra de platino de síntesis de ADNc am-fiRivert (GenDEPOT, Barker, TX, EE. UU.). El ADN genómico se extrajo con el kit de extracción de ADN genómico AccuPrep® (BIONEER, Daejeon, Corea). La conversión de bisulfito se realizó utilizando el kit de metilación de ADN EZ (Zymo Research, CA, EE. UU.). Para realizar qRT-PCR, se utilizaron un kit de síntesis de ADNc AMPIGENE® (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, EE. UU.) y un sistema de PCR en tiempo real ABI7500 (Ambion Inc, Austin, TX, EE. UU.). Las secuencias de cebadores utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 1.

4.6. Ensayo de lactato deshidrogenasa

Se usó el ensayo LDH para determinar la citotoxicidad midiendo la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada de las células dañadas. El ensayo se realizó utilizando un kit de ensayo WST de citotoxicidad LDH (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.7. Transfección de ADN para sobreexpresión de nc886 y transfección de siRNA para nc886 Knockdown

Para obtener ADN para la sobreexpresión de nc886 en las células, se amplificó el ADN con AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Corea) usando ADN genómico de HDF como plantilla y los siguientes cebadores descritos en la Tabla 2.

El ADN amplificado se purificó utilizando un kit de purificación por PCR QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania). El ADN purificado se transfectó con un reactivo LipofectamineTM 3000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Para eliminar nc886, las células se transfectaron con anti-oligos (si-ctrl y si-nc886) a una concentración de 250 pM utilizando el reactivo Lipofectamine™ RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.).

4.8. Transferencia occidental

Los lisados ​​celulares se prepararon con solución de extracción de proteínas PRO-PREP™ (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Korea). Las proteínas totales se separaron con un sistema de electroforesis NuPAGE (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La inmunotransferencia se realizó con anticuerpo primario contra p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.), MMP1, Col1A2 y actina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, EE. UU.). Los valores de densitometría de barrido de las bandas se analizaron utilizando ImageJ, versión de software 1.52a (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.).

4.9. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Después de la incubación indicada, se midió el colágeno (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japón) y MMP-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.) en el sobrenadante del cultivo mediante el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) siguiendo las instrucciones del fabricante.

4.10. Análisis estadístico

Todos los resultados se presentan como media ± desviación estándar (DE). Las diferencias entre los dos grupos se evaluaron mediante la prueba t o análisis de varianza (ANOVA) usando GraphPad Prism. La significación estadística se indicó como p < 0.05 o p < 0,01.

5. Conclusiones

En conclusión, la regulación de la expresión de nc886 puede ser un objetivo potencial de la senescencia celular en los fibroblastos, y el ATC puede ser un potente ingrediente antienvejecimiento epigenético.

Contribuciones de autor:

Conceptualización, YK, KH y EJ; metodología YK, HJ, N.-HP y K.-SL; curación de datos, YK, HJ y EC; investigación, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP y EJ; administración de proyectos, WP, DP y EJ; recursos, WP y DP; supervisión, DP y EJ; escritura—borrador original, YK; redacción: revisión y edición, N.-HP, KH, WP, DP y EJ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:

Esta investigación no recibió financiación externa.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:

No aplica.

Declaración de consentimiento informado:

No aplica.

Declaración de disponibilidad de datos:

Los datos estarán disponibles a petición.

Conflictos de interés:

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Yuna Kim 1, Hyanggi Ji 1, Eunae Cho 1, Nok-Hyun Park 2, Kyeonghwan Hwang 2, Wonseok Park 2, Kwang-Soo Lee 1, Deokhoon Park 1 y Eunsun Jung 1*.

1 Instituto de Ciencias de la Vida Biospectrum, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Corea; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (JJ); biozr@biospectrum.com (CE); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 División de Investigación e Innovación Básica, Centro de I+D de Amorepacific Corporation, Youngin-si 17074, Corea; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

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