Función neuroendocrina-inmune de Cistanche Deserticola y sus productos para cocinar al vapor vino de arroz en un modelo de rata inducido por glucocorticoides-Ⅰ

1. Introducción

Cistanche deserticola, que se llama "ginseng del desierto", es una medicina tradicional china que se ha utilizado durante siglos como hierba tónica yang paravigorizar el riñón y fortalecer el yang[1]. Ocho especies y una variación deCistanche Herba han sido registrados en China y sóloCistanche deserticolaYC Ma ycistanche tubulosa(Schenk) Wight están registrados en la Farmacopea China [2]. Los estudios farmacológicos demostraron queCistanches Herbaexhibió neuroprotector [3], inmunomodulador [4], cardioprotector [5], antifatiga [6], antiinflamatorio [7], hepatoprotector [8], antioxidante [9], antibacteriano [10], laxante [11] y antitumoral. efectos [12]. El amplio espectro de actividades biológicas reportadas de este género se ha atribuido a su compleja y variada composición fitoquímica.Cistanche deserticolacontiene glucósidos de feniletanol, iridoides, polisacáridos [13], etc. El contenido de glucósidos de feniletanoide es el más alto en los materiales medicinales originales [14].

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El procesamiento de Materia Médica China (CMM) es una técnica farmacéutica tradicional para cumplir con los diferentes requisitos de tratamiento, dispensación y preparación de acuerdo con la teoría de la medicina tradicional china. Esos productos procesados ​​se denominan piezas de decocción, que se utilizan en clínicas. El procesamiento tiene como objetivo mejorar la eficacia para reducir la toxicidad de los medicamentos crudos. La Farmacopea China de 2015 registró que las rodajas gruesas de Cistanche (CD) y el Cistanche cocido al vapor con vino de arroz (WCD) podían usarse como piezas de decocción en la clínica. Nuestro grupo de investigación demostró que el efecto laxante se alivió y los efectos antienvejecimiento y vigorizantes del yang del riñón mejoraron después de cocinar Cistanche al vapor con vino de arroz [15].

La función del eje hipotálamo-pituitaria-glándula suprarrenal-timo (HPAT) está alterada en el síndrome de deficiencia de riñón-yang [16]. Los pacientes con deficiencia de yang de riñón también tienen una disfunción inmune extensa. La disfunción del eje HPA está estrechamente relacionada con la inmunodeficiencia. La teoría de la red neuroendocrina-inmune (NEI) muestra que los sistemas inmunológico y neuroendocrino comparten muchos ligandos y receptores [17], y el hipotálamo se considera el pivote para vincular el sistema neuroendocrino con el sistema inmunológico.

En este estudio, replicamos la deficiencia de yang de riñón en ratas modelo con inyección de corticosteroides exógenos y exploramos el mecanismo de la deficiencia de yang de riñón en respuesta a diferentes productos procesados ​​de Cistanche deserticola desde la perspectiva de la función endocrino-inmune.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales y reactivos

Cistanche deserticola fue recolectada de Alashan Neimenggu en 2019.5 e identificada como los tallos carnosos secos de Cistanche deserticola YC Ma por el Prof. Yanjun Zhai (Facultad de Farmacia, Universidad de Medicina Tradicional China de Liaoning, China). Los especímenes de los vales se conservaron en el Centro de Tecnología de Ingeniería de Procesamiento de Liaoning.

Los compuestos estándar de ajugol se adquirieron en Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, China); cistanósido F,echinacósido, cistanósido A e isoactósidofueron comprados a Must Company (Sichuan China); El acteoside se adquirió de Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, China). El acetonitrilo y el metanol de calidad MS se adquirieron de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El ácido fórmico de calidad HPLC se adquirió de Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El vino de arroz se compró en Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, China).

Corticosterona (CAS: 50-22-6, pureza > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), pastillas chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), ACTH, CRH, T, IL de rata{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 e IL-10 se adquirieron en Nanjing Jiancheng Co., Ltd. El kit ELISA de cortisol de rata fue proporcionado por BOSK Co., anticuerpo CD4 de rata, anticuerpo CD8a (núms. 561833 y 559976), lisado de glóbulos rojos (Solarbio, R1010), solución tampón de PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM y cebadores de actina en sentido ascendente y descendente fueron proporcionados por Guangzhou Invitrogen Co. El kit de transcripción inversa (n.° RR037A) y el kit de síntesis de ADNc (n.° 10000068167) fueron proporcionados por Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Cloroformo, isopropanol, etanol al 75 % y uretano Todas las soluciones fueron analíticamente puras y fueron producidas por Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. El sistema Milli-Q produjo agua ultrapura (18,2 MΩ, Millipore, MA, EE. UU.).

2.2. Instrumentos experimentales

Un marcador enzimático (Thermo, modelo 3530911931), lavador de placas automático (modelo HBS- 4009), medidor de fuerza push-pull con pantalla digital (modelo VICTOR- 50N), centrífuga de congelación de alta velocidad (modelo Sigma 3k15). ), espectrofotómetro ultramicro (modelo B-50Q), amplificador de genes (modelo L96G), PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (modelo StepOne), citómetro de flujo (modelo AC66051710132), microtomo de parafina (modelo Laika), microscopio (Olympus , modelo BS-53) y un instrumento de agua pura (modelo F7JA36507).

2.3. Preparación de muestras para UPLC-Q-TOF-MS y experimentos farmacológicos

WCD se procesó a partir del mismo lote deCistanche deserticolaen nuestro laboratorio. Para la preparación de WCD, se infundieron trozos de CD secos (5 mm de espesor) (100 g) con vino de arroz (30 ml), se cocieron al vapor a alta presión (1,25 kPa) durante 4 h y luego se secaron a 55 grados.

Los polvos gruesos de CD y WCD se empaparon en 10 veces etanol al 95% durante 0,5 h, se extrajeron a reflujo 3 veces cada vez durante 1 h, se filtraron y los filtrados se combinaron 3 veces. El etanol se recuperó a presión reducida y se obtuvo el extracto para su administración. El extracto (1 ml) se añadió a metanol al 50%, lo que llevó el volumen total a 20 ml y se almacenó a 4 grados para el análisis del contenido.

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2.4. Condiciones UPLC-QqQ-MS para el análisis de extractos de CD y WCD

2.4.1. Condiciones analíticas LCThMS

Para realizar la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el sistema UPLC-MSThMS con el software MassLynx 4.1 Analyst. La columna analítica era una Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) a una temperatura de 40 grados C. La fase móvil era 0.Solución acuosa de ácido fórmico al 1% (A) y acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,1% (B). El gradiente de elución fue de 0,00–1,00 min con 3% B, 1,01–2,00 min con 3%–11,5% B, 2,01–3.{{29 }} min con 12 % B, 3,01–4,00 min con 15 % B, 4,01–5,00 min con 20 % B, 5,01–6,00 min con 22 % B, 6,01–8,00 min con 25 % B y 8,01–9,00 min con 10 % B. El caudal fue de 0,3 ml/min y el volumen de inyección fue de 1,0 μL.

El espectrómetro de masas triple cuádruple de Waters (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, EE. UU.) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) se utilizó en el modo de iones negativos. El gas de desolvatación era nitrógeno con un caudal de 500 LThh a una temperatura de 250 grados. Todos los compuestos detectados se midieron en el modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM); La Tabla 1 muestra los parámetros energéticos y la Tabla 2 muestra las curvas de calibración de los componentes analizados.

2.4.2. Preparación de sustancias de referencia

Tubulosido A (3,02 mg), equinacósido (3,00 mg), 2′-acetilactósido (2,34 mg), acteósido (2,45 mg), isoactósido (0,61 mg), cistanósido F ( 2,14 mg), salidrosida (3,39 mg), ácido geniposidico (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) y catalpol (2,39 mg) se disolvieron en metanol para preparar una solución madre. La solución madre se diluyó con metanol para obtener las concentraciones apropiadas para las soluciones estándar de trabajo. Todas las soluciones preparadas se almacenaron a 4 grados antes de su uso.

2.5. Preparación y agrupación de modelos animales.

Se compraron ratas macho SD (180–220 g) de Liaoning Changsheng Biotechnological Co., número de permiso de animal: SCXK (Liao) 2015–0001. Todas las ratas se mantuvieron con libre acceso a comida y agua a 25 grados y una humedad relativa del 30 al 50%. Los animales fueron alojados durante 7 días antes de los experimentos.

Cien ratas se dividieron aleatoriamente en 10 grupos: grupo de control en blanco (BC), grupo de control modelo (MC), grupo de control positivo (PC), grupo de control de vino de arroz (WC), grupo de control de dosis alta de CD (CD -HD), grupo de dosis media de CD (CD-MD), grupo de dosis baja de CD (CD-LD), grupo de dosis alta de WCD (WCD-HD), grupo de dosis media de WCD (WCD-MD) y Grupo de dosis bajas de WCD (WCD-LD). Las dosis de CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD y CD-LDThWCD-LD fueron 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) y 1,37 gTh (kg ∙ d), respectivamente. La dosis para el grupo PC fue de 1,646 gTh(kg ∙ d), y para el grupo WC, 1 mlTh100 g durante 40 días. El sexto día después de la administración, a las ratas se les inyectó por vía subcutánea la suspensión acuosa de corticosterona (corticosterona + 0.1% dimetilsulfóxido + 0.1% Tween-80 + 0.9% cloruro de sodio), excepto para el grupo BC [18]. La concentración de corticosterona fue de 5 gThL y la dosis de 0,1 mlTh100 g. Las ratas del grupo BC recibieron solución salina normal + 0.1% dimetilsulfóxido + 0.1% Tween- 80 + 0.9% cloruro de sodio mediante inyección en la misma dosis.

2.6. Determinación de funciones del eje HPA

2.6.1. Prueba de peso, temperatura y poder de retención

Se realizó una prueba de peso cada 3 días y se tomó la temperatura cada 6 días. durante el experimento. El día 39, se midió la fuerza máxima de las extremidades traseras con un medidor de agarre. Las ratas fueron colocadas sobre plataformas lisas, haciendo que sus extremidades traseras se agarraran al poste. Las ratas agarrarán instintivamente cualquier objeto para evitar moverse hacia atrás cuando se tira de la cola hasta que la fuerza de tracción exceda el agarre. Cuando la rata perdía el agarre, el preamplificador podía registrar automáticamente la fuerza máxima de agarre.

2.6.2. Determinación del nivel de T, CRH, ACTH, CORT y cortisol en suero

Una hora después de la última administración, las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de una solución de uretano (20 gTh100 ml). Luego, se recogieron las muestras de sangre, se centrifugaron a 3500 r durante 15 minutos para obtener el suero y se almacenaron a -20 grados. Las concentraciones de T, CRH, ACTH, CORT y cortisol se midieron con kits de ELISA para ratas según las instrucciones del fabricante.

2.6.3. Observaciones microscópicas

La estructura morfológica del tejido de la glándula suprarrenal se observó mediante tinción con HE. El tejido suprarrenal se fijó en paraformaldehído al 10%, se deshidrató en etanol, se hizo transparente con una solución de xileno, se embebió mediante métodos convencionales, se cortó en rodajas de 4 μm de espesor, se desparafinaron con solución de xileno, se hidrataron con el gradiente de etanol y luego se tiñeron con hematoxilina y eosina. solución de tinción. Después de volverla transparente con xileno, la placa se selló con goma neutra y se observó al microscopio.

2.6.4. Tinción inmunohistoquímica de la expresión de proteínas Bax, Bcl-2, caspasa-3, Fas y FasL en la glándula suprarrenal

Se desparafinaron y rehidrataron secciones suprarrenales de rata fijadas con formalina e incluidas en parafina después de cortarlas con un espesor de 4 μm. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena, las secciones se preincubaron en un bloque de peróxido de hidrógeno durante 10 min. Las secciones se sumergieron en citrato 0 0,01 M (pH 6,0) y se calentaron hasta ebullición. El proceso se repitió después de 5 a 10 min. Después de enfriar, las secciones se lavaron con PBS (pH 7,2–7,6) 1–2 veces, se dejaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos y se lavaron con PBS (pH 7,2–7,6) 2–3 veces. La solución de bloqueo de BSA al 5% se añadió a temperatura ambiente y el exceso de líquido de la sección se sacudió 20 minutos después. Se agregaron anticuerpos primarios diluidos específicos para FasTh FasL, Bcl-2ThBax y caspasa-3 (diluidos 1:100 con PBS) y se incubaron a 37 grados durante 1 hora o 4 grados durante la noche. Las secciones se lavaron 2 a 3 veces con PBS (pH 7,2 a 7,6). Luego, se añadió IgG anti-ratón de cabra biotinilada y las secciones se secaron a 20-37 grados durante 20 minutos y se lavaron con PBS (pH 7,2-7,6) 4 veces durante 5 minutos. Después de un lavado minucioso en PBS, las secciones se incubaron con una mezcla de reactivos A y B durante 30 minutos, se incubaron con PBS durante 45 minutos y finalmente se revelaron con sustrato DAB (DAKO) durante 30 minutos antes de contrateñirlas ligeramente con hematoxilina, deshidratarlas. y montado.

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2.7. Determinación de funciones inmunes

2.7.1. Cálculo del índice de órganos inmunitarios

Una hora después de la última administración, las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de solución de uretano (20 gTh100 ml), y luego se extrajeron el bazo y el timo y se pesaron inmediatamente en una campana estéril. Los coeficientes de peso del bazo o del timo (%) � peso del bazo o del timo (mg) Peso corporal (g).

2.7.2. Detección de subconjuntos de linfocitos T en sangre periférica

Los esplenocitos y hemocitos se incubaron con los anticuerpos monoclonales anti-CD4 (PE) y anti-CD8 (FITC) durante 30 minutos en la oscuridad. Se añadieron 2 ml de lisado de eritrocitos y la solución se mezcló mediante agitación vorticial. La solución se dejó en oscuridad durante 10 min y se centrifugó durante 5 min. Se descartó el sobrenadante y luego la solución se lavó 3 veces con PBS enfriado con hielo y se resuspendió en solución permeabilizante de PBS. Se analizaron al menos 10,000 células mediante citometría de flujo dentro de 1 h de cada tinción con Mab.

2.7.3. Determinación del nivel de IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c en suero

Una hora después de la última administración, las ratas fueron anestesiadas mediante inyección intraperitoneal de solución de uretano (20 gTh100 ml) y se extrajo sangre de la aorta abdominal. La sangre se centrifugó a 3500 r durante 15 minutos para obtener el suero y se almacenó a -20 grados. Las concentraciones de IL-10, IL-6, IL-2, TNF- e IFN-c se detectaron con kits de ELISA para ratas según las instrucciones del fabricante.

2.8. Expresión de CaM en tejidos de hipotálamo y hipófisis.

El ARN total se extrajo del hipotálamo y los tejidos de la hipófisis mediante TRIzol. La transcripción inversa se llevó a cabo en 10 μL de ARN total según las instrucciones del fabricante. Se analizaron cantidades iguales de ADNc mediante qPCR en presencia de un colorante de unión a ADNds (Promega, EE. UU.) y el sistema de PCR en tiempo real CFX 96 (Bio-Rad, EE. UU.) para observar los diferentes genes en las condiciones de activación inicial en 95 grados durante 10 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95 grados durante 15 s y extensión de recocido a 60 grados durante 1 min.

Los cebadores para CaM y actina se dan en la Tabla 1, y se utilizó actina como control interno. Cada muestra se normalizó utilizando la diferencia en los umbrales críticos (Ct) entre el gen diana y la actina. Se utilizó la siguiente ecuación para describir el resultado: ΔΔCt � (gen Ct objetivo - gen Ct -actina) grupo experimental - (gen Ct objetivo - gen Ct -actina) grupo de control. Luego se compararon los niveles de ARNm de cada muestra, utilizando la expresión 2- ΔΔCt gen diana. Se promediaron los resultados de cada grupo (Tabla 3).

2.9. Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando el software SPSS (versión 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Las diferencias entre grupos se analizaron con análisis de varianza de medidas repetidas unidireccionales (ANOVA). Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE) utilizando el software GraphPad Prism (versión 6.0, San Diego, CA, EE. UU.). Las diferencias con un valor de p inferior a 0.05 se consideraron estadísticamente significativas.

3. Resultados experimentales

3.1. Análisis UPLC-QqQ-MS

Para lograr la mejor separación, forma de pico y un tiempo de análisis corto, en nuestro experimento preliminar se estudiaron las condiciones cromatográficas, incluida la columna, la fase móvil y el programa de gradiente. Los cromatogramas típicos con modo MRM se presentan en la Figura 1.

En la Tabla 4, podemos ver que los contenidos de glucósidos de feniletanoides en WCD aumentaron en comparación con los de CD, especialmente para echinacósido y acteosido, mientras que el contenido de iridoides disminuyó en WCD.

3.2. Regulación para la función del eje HPA

3.2.1. Prueba de peso, temperatura y poder de retención

Las ratas del grupo MC y de los grupos experimentales mostraron síntomas de deficiencia de yang en el riñón gradualmente después de recibir corticosterona. Los síntomas, como pérdida de peso, hipotermia, pérdida del brillo del cabello, decaimiento, retraso en la respuesta y una disminución significativa en el consumo de agua y la actividad, mejoraron mucho en los grupos CD y WCD. La Figura 2 (a) muestra los cambios de peso. El peso de cada uno de los grupos de fármacos aumentó, especialmente en los grupos CDHD y WCD-HD. El aumento de peso en el grupo MC fue el más bajo. La Figura 2 (b) muestra los cambios de temperatura, que fueron los más bajos en el grupo MC, y la temperatura aumentó en los grupos WCD-HD, WCD-MD y WCD-LD.

La Figura 2 (c) muestra que el poder de retención aumentó para el grupo BC y cada uno de los grupos experimentales, y el grupo WCD-MD fue el más alto, lo que demostró que los signos de debilidad inducidos por la deficiencia de yang de riñón mejoraron después de la administración.

3.2.2. Niveles de T, CRH, ACTH, CORT y Cortisol

La Figura 3 muestra que, en comparación con los del grupo BC, el nivel de T, CRH, ACTH y CORT en el suero de rata disminuyó (P < 0.01) y el nivel de cortisol disminuyó (P < 0.05) en el grupo MC. En comparación con los del grupo MC, el nivel de T en los grupos WCD-HD y WCD-MD aumentó (P < 0.01), el nivel de CRH en el WCD-LD, Los grupos WCD-MD y WC mejoraron (P < 0.01), el contenido de ACTH aumentó en los grupos CD-HD, WCD-MD y WCD-HD (P <0,01), el nivel de CORT mejoró en los grupos CD-MD, WCD-MD y WCD-HD (P <0,01) y mejoraron en los grupos CDHD y WCD-LD (P <0,05), y el nivel de cortisol aumentó en cada uno de los grupos de fármacos.

3.2.3. Resultados de la observación microscópica

El tejido de la glándula suprarrenal se puede dividir en capa cortical y capa de médula. Las capas corticales incluyen capas globulares, haces y reticulares. Las células contienen más lípidos y la capa de la médula está formada principalmente por células de feocromocitoma y una pequeña cantidad de tejido fibroso. Como se muestra en la Figura 4, encontramos que todo era normal en el grupo BC, mientras que en el grupo MC, la corteza suprarrenal tenía hiperplasia evidente, atrofia celular y densidad creciente. La franja bulbosa se engrosó y la zona fascicular translúcida, la zona reticular estrecha y las células más pequeñas mostraron una coloración desigual y congestión capilar. En el grupo PC, los límites corticales y medulares eran visibles. Las células de las bandas globulares y de haces estaban dispuestas uniformemente y se había restaurado la estructura morfológica. Se observó la misma mejor restauración en los grupos WCD, y los efectos en el grupo WCD-MD fueron mejores que los de los grupos WCD-HD y WCD-LD. La morfología de la glándula suprarrenal en los grupos de CD no fue tan buena como la de los grupos de WCD.

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