Efectos y mecanismos neuroprotectores de las procianidinas in vitro e in vivo Parte 2

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3. Discusión

Numerosos estudios han demostrado que las PC exhiben fuertes actividades antioxidantes y de eliminación de radicales ]25-27I, y que el estrés oxidativo causado por la producción excesiva de ROS y/o el deterioro del sistema de defensa antioxidante juega un papel fundamental en las enfermedades neurodegenerativas [ -6,28,29]. Sin embargo, los efectos y mecanismos neuroprotectores de las PC con respecto al daño oxidativo aún no están claros. Por lo tanto, este estudio investigó los efectos y mecanismos de las PC en la neuroprotección.

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En el presente estudio, las concentraciones apropiadas de PC mejoraron los niveles de enzimas antioxidantes, incluidas GSH-Px, CAT y SOD, pero redujeron los niveles de ROS y MDA en modelos de daño oxidativo en comparación con las mediciones que usan H, O solo. Estos hallazgos actuales fueron consistentes con estudios previos que sugirieron que un suplemento bajo en PC a través de la dieta puede mejorar las actividades de GSH-Px, CAT y SOD en lechones destetados [30]. Otro estudio también sugirió que las PC aumentaron significativamente las actividades de CAT y SOD y redujeron el contenido de MDA, mejorando así la calidad del esperma de cabra [31].

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La vía Nrf2/ARE es una importante vía antioxidante [32-34]. Normalmente, Nrf2 reside en el citoplasma, donde se une a la proteína inhibidora, Keap135,36]. Tras la estimulación con H2O2, Nrf2 se disocia de Keap1, inicia el sistema de defensa antioxidante endógeno y, posteriormente, se traslada al núcleo [34,37,38]. Luego interactúa con ARE para activar una serie de genes antioxidantes y protectores de células, incluidos GCLC, GCLM, NOO1 y HO-139,40]. En respuesta al estrés oxidativo, similar a los cambios observados durante la estimulación con H-O2, Nrf2 se disocia de Keap1 en el citosol y luego se traslada al núcleo, uniéndose a la secuencia ARE para activar la transcripción de genes crioprotectores [41,42]. Observamos que las concentraciones apropiadas de PC facilitaron la localización nuclear de Nrf2 en condiciones de lesión H, O2- en células PC12. Además, las concentraciones apropiadas de PC aumentaron notablemente los niveles de expresión de NOO1, HO-1, GCLM y GCLC, todos los cuales pueden actuar directamente para eliminar los radicales libres y las moléculas oxidativas [43]. Por lo tanto, estos resultados mostraron que las concentraciones apropiadas de PC aumentaron los niveles de la vía Nrf2/ARE. A continuación, se utilizó el silenciamiento del gen Nfr2 a través del siRNA de Nrf2 para evaluar más a fondo el papel de la activación de Nrf2/ARE en la neuroprotección mediada por PC contra el daño oxidativo inducido por H, O2-. Las células transfectadas con Nrf2-siRNA indicaron una marcada disminución en la expresión de Nrf2. Simultáneamente, encontramos que la desactivación de Nrf2 eliminó la protección mediada por las PC contra las deficiencias en la viabilidad celular tratadas con H2O, y la desactivación de Nrf2 también eliminó los efectos antioxidantes de las PC. Estos hallazgos coincidieron con un estudio anterior que sugirió que mejorar la activación de la vía Nrf2/ARE contribuye a la neuroprotección [44]. Por lo tanto, los presentes resultados indican que la vía Nrf2/ARE puede representar un objetivo farmacológico de las PC para la prevención de la neurodegeneración.

4. Materiales y Métodos 4.1. Sustancias químicas y reactivos

El H2O2 se compró a HUSHI (HUSHI, Shanghái, China). CCK-8, NAC se adquirió de Beyotime (Beyotime, Shanghái, China). PC, diacetato de 2',7/-diclorofluoresceína, MDA, GSH-Px, kits de diagnóstico SOD y kits de diagnóstico CAT se adquirieron de Solarbio (Solarbio, Beijing, China). RNAi Plus, kit de reactivos PrimeScript RT con gDNA Eraser y SYBR Premix Ex Tag II se adquirió de Takara (Takara, Shiga, Japón). Nrf2-siRNA, control-siRNA y lipofectamine 2000 se obtuvieron de GenePharma (GenePharma, Shanghái, China). Los siguientes anticuerpos primarios y los anticuerpos secundarios correspondientes se obtuvieron de Proteintech (Proteintech, Wuhan, China): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B y GAPDH.

4.2. Cultivo de células

Las células PC12 se obtuvieron de la Colección Nacional de Cultivos Celulares Autenticados. Las células se mantuvieron en medio DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10 por ciento y penicilina-estreptomicina (100 U/mL; 100 ug/mL) en una incubadora humidificada a 37 grados con 5 por ciento de CO2.

4.3. Ensayos de viabilidad celular

Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos a una densidad de 1 × 104 células/pocillo. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de PCs o NAC （20 μM） durante 24 h, luego de lo cual se incubaron con 200 μM de H2O2, durante 24 h. A continuación, se añadieron 10 μL de solución de CCK-8 a cada pocillo y se incubaron durante 1 h, después de lo cual se midió la absorbancia a 450 nm.

4.4. Mantenimiento de peces

La aprobación ética para el uso de animales fue otorgada por el Comité de Uso y Conservación de Animales del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Zhejiang (ZJU20200125). El pez cebra adulto (Danio rerio, cepa AB) se obtuvo del centro de animales de laboratorio de la Universidad de Zhejiang y se mantuvo a 28±1C bajo un ciclo de luz/oscuridad de 14/10-h [21J. Los peces fueron alimentados con nauplios de Artemia dos veces al día. Para producir embriones, se colocaron peces cebra adultos durante la noche en tanques de reproducción en una proporción de macho:hembra de 1:1. El desove se desencadenó dentro de las 2 h posteriores al encendido de las luces a la mañana siguiente. Los embriones se criaron en agua embrionaria a 28 grados [45].

4.5. Mediciones de ROS

Para medir la producción de ROS in vivo, se expusieron larvas de pez cebra (cepa AB), 3 días después de la fecundación (pdf) a NAC (30 μM) o a varias concentraciones de PC en ausencia o presencia de 300 μM de H,O, durante 4 días. Posteriormente, a 7 pdf, los diferentes grupos de tratamiento se transfirieron a una 24-placa de pocillos (10 larvas de pez cebra por grupo) tratadas con 20 uM de solución de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína, y se incubaron durante 60 min en la oscuridad a 28,5 grados C[46]. A continuación, las larvas se lavaron tres veces con medio embrionario para eliminar el exceso de diacetato de 2'7'-diclorofluoresceína. A continuación, se observaron las larvas teñidas y se tomaron imágenes con un microscopio confocal de barrido láser Olympus. La intensidad fluorescente de cada larva individual se cuantificó a través del software Image].

Para medir la producción de ROS in vitro, se sembraron células PC12 en 6-placas de pocillos a una densidad de 2x10* células/pocillo. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de PCs o NAC (20 uM) durante 24 h y luego se incubaron con 200 uM de HO, durante 24 h. Las células se incubaron con una solución de diacetato de 2',7'-diclorofluoresceína 10 μM en la oscuridad durante 30 min; a continuación, se eliminó la solución de colorante y se lavaron las células tres veces en solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se observaron las células y se tomaron imágenes con un microscopio confocal de barrido láser Olympus. Las intensidades fluorescentes de las células se cuantificaron a través del software Image].

4.6.Evaluación de MDA, GSH-Px, SOD y CAT

Las larvas de pez cebra (cepa AB) at3 pdf se expusieron a NAC (30 μM) o a varias concentraciones de PC en ausencia o presencia de 300 uM de H2O durante 4 días. El pez cebra de 7 dpf se anestesiaron con tetracaína y se homogeneizaron después de la eutanasia en hielo. MDA, GSH-Px, CAT y SOD se analizaron simultáneamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada experimento contenía 20 larvas y cada índice medido se repitió por triplicado.

Las células PC12 se sembraron en 6-placas de pocillos a una densidad de 2 × 10* células/pocillo. Las células se expusieron a diferentes concentraciones de PCs o NAC (20 uM) durante 24 h y luego se incubaron con 200 uM de H2O, durante 24 h. A continuación, se recogieron células PC12 y se incubaron con tampón de lisis. Las actividades de MDA, GSH-Px, SOD y CAT se midieron utilizando los kits de ensayo correspondientes, de acuerdo con los protocolos de cada fabricante. Cada índice medido se repitió por triplicado.

4.7. Extracción de ARN total, transcripción inversa y reacción en cadena de polimerasa cuantitativa en tiempo real

Las larvas de pez cebra (cepa AB) a los 3 dpf se expusieron a NAC (30 μM) o varias concentraciones de PC en ausencia o presencia de 300 μM de H, O, durante 4 días. Después de los tratamientos, el ARN se extrajo usando RNAiso, siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN se transcribió inversamente utilizando un kit PrimeScript RT con un borrador de gDNA, siguiendo las instrucciones del fabricante (Takara, Shiga, Japón). La PCR cuantitativa en tiempo real se realizó con un sistema de PCR en tiempo real Vi-7 de Applied Biosystems usando SYBR Premix Ex TaqII -actina como gen de referencia, y la expresión génica relativa se calculó usando el 2-AACt método. Las secuencias de cebadores utilizadas se enumeran en la Tabla 1.

4.8. Transfección de ARNip Nrf2

Se usó Nrf2-siRNA para derribar Nrf2. Las células PC12 se sembraron en 6-placas de cultivo de pocillos y luego se transfectaron con Nrf2-siRNA (80 nM) o control-siRNA usando Lipofectamine 2000, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4.9.Preparación de proteínas de células completas, citoplasmáticas y nucleares

Para la extracción de proteínas de células enteras, las células se recolectaron y se incubaron con tampón de lisis RIPA que contenía PMSF al 1 por ciento y cóctel de inhibidor de proteasa al 1 por ciento durante 30 minutos en hielo. Los lisados ​​celulares se centrifugaron y el sobrenadante se recogió y almacenó. Para la preparación del fraccionamiento subcelular, las muestras de células se procesaron utilizando el kit de extracción de proteínas nucleares y citoplasmáticas. El contenido de proteína se ensayó utilizando el ensayo BCA. 4.10.Transferencia de Western

Las muestras de proteínas en alícuotas se resolvieron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Luego, las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B o GAPDH. Luego, la membrana se lavó con TBST durante 5 min; esto se repitió 5 veces. Posteriormente, las transferencias se incubaron en anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa. Finalmente, las bandas de proteínas se visualizaron utilizando un reactivo de detección de transferencia Western ECL-plus.

4.11. Ensayo de comportamiento locomotor

Las larvas de pez cebra (cepa AB) a 3 pdf se expusieron a NAC (30 μM) o varias concentraciones de PC en ausencia o presencia de 300 μM de HO, durante 4 días. A partir de entonces, a 7 pdf, estas larvas tratadas se sembraron en 24-placas de pocillos (un pez por pocillo y 12 larvas por grupo). Usamos Any-maze 4.73 para medir el comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra y calculamos la distancia total recorrida en 10 minutos [47].

4.12.Análisis estadístico

Los datos se muestran como la media ± desviación estándar (SD) de al menos tres experimentos independientes. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) y las pruebas de rango múltiple de Duncan para determinar la significación estadística, y las diferencias se consideraron significativas cuando p<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Conclusiones

En conclusión, los presentes hallazgos indican que las PC ejercen efectos neuroprotectores mediante la activación de la vía Nrf2/ARE y sus enzimas de desintoxicación y enzimas antioxidantes aguas abajo. En conjunto, las PC pueden tener un efecto protector sobre los trastornos neurodegenerativos.

Contribuciones de autor:Conceptualización, JCandJZ.(Jiajin Zhu); metodología, JC; software, YC; validación, YZ., JZ(Jiawen Zhao) y HY; análisis formal, JC; investigación, YC; recursos, JZ(iajin Zhu); curación de datos, JC; redacción—preparación del borrador original, JC; redacción—revisión y edición, JZ.(iajin Zhu); visualización, JC; supervisión, DL; administración de proyectos, JZ (Jiajin Zhu); adquisición de fondos, JZ (Jiajin Zhu). Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Esta investigación no recibió financiación externa.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional:El estudio se realizó de acuerdo con las pautas de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética de Conservación y Uso de Animales del Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Zhejiang (ZJU20200125). Declaración de consentimiento informado: No aplicable.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos están contenidos en el artículo. Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

Disponibilidad de muestras: Los autores no proporcionan muestras de los compuestos.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules