Efectos neuroprotectores de cuatro glucósidos feniletanoides en la apoptosis inducida por H2O2 en células PC12 a través de la vía Nrf2 / ARE
Mar 04, 2022
Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Maiquan Li 1, Tao Xu 1, Fei Zhou 1, Mengmeng Wang 1, Huaxin Song 1, Xing Xiao y Baiyi Lu 1,*
1. Introducción
El estrés oxidativo, que es un desequilibrio de la homeostasis antioxidante, induce la peroxidación lipídica, la lesión de proteínas y ADN, el envejecimiento celular y la muerte celular. Este proceso probablemente contribuye a varios trastornos neurodegenerativos, como la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la isquemia / reperfusión [1]. Se sabe que el peróxido de hidrógeno (H2O2), que es una de las principales especies reactivas de oxígeno (ROS), causa peroxidación lipídica y daño al ADN [2]. Además, el H2O2 es una fuente endógena de radicales libres hidroxilo que contribuye al nivel de fondo de estrés oxidativo celular [3,4]. Por lo tanto, las estrategias terapéuticas para prevenir la apoptosis inducida por el estrés oxidativo pueden tener el potencial en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
El factor nuclear eritroide 2 relacionado con el factor 2 (Nrf2), es un factor de transcripción que está fuertemente asociado con el estrés oxidativo. La activación de Nrf2 induce la transcripción de numerosos genes antioxidantes y de desintoxicación, incluyendo hemo oxigenasa-1 (HO-1), NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1, bioactividades antiinflamatorias [13] e inmunomoduladoras [14]. Osmanthusfragrans es un ingrediente común en varios alimentos asiáticos y se ha consumido durante mucho tiempo. Anteriormente demostramos que los extractos de flores de O.fragrans mejoraron el aprendizaje espacial y la memoria, inhibieron el daño oxidativo y exhibieron actividades neuroprotectoras en el envejecimiento inducido por d-galactosa en un modelo de ratón ICR [15]. Salidroside, acteoside e isoacteoside son la principal respuesta de PhGs para las actividades antioxidantes de los extractos de flores de O.fragrans [16].
Los estudios sobre el efecto neuroprotector de los PHG han obtenido resultados deseables. Salidroside redujo significativamente la apoptosis celular de las células PC12 que fueron expuestas en MPP+ [17,18]. Acteoside también alivió la apoptosis inducida por MPP + y el estrés oxidativo en células PC12 [19] y una lesión celular SH-SY5Y inducida por P25-35 [20]. El equinacósido se investigó en la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral a (TNFa) en células SH-SY5Y [21], la toxicidad dopaminérgica inducida por MPTP en ratones [22], los cultivos primarios lesionados por glutamato de células corticales de rata [23] y el daño inducido por 6-OHDA en células PC12 [24]. Los resultados indicaron que los PHG exhibieron un efecto citoprotector y son agentes potenciales para tratar enfermedades neurodegenerativas. Los estudios han demostrado que las propiedades antioxidantes de los PHG subyacen a muchas otras bioactividades para estos compuestos [25]. Sin embargo, pocos estudios han investigado el mecanismo molecular de los PhG contra la toxicidad oxidativa.
En nuestro estudio, seleccionamos cuatro PhG típicos de la siguiente manera: salidrosido (monosacáridos feniletanoide), actósido (disacáridos feniletanoides), isoacteosido (disacáridos feniletanoides) y equinacósido (trisacáridos feniletanoides). Empleamos un modelo de muerte neuronal utilizando células PC12 diferenciadas [26] para investigar el efecto protector y el mecanismo molecular de los PhG en el modelo de células PC12 inducidas por H2O2. Demostramos que los PhGs activaron la vía Nrf2/ARE al unirse a la proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (Keap1). Este proceso reguló al alza las enzimas antioxidantes y aumentó la resistencia de las células PC12 al estrés oxidativo.
Tratamiento de trastornos neurodegenerativos:PhGs de cistanche
2. Resultados
2.1. PhGs suprimió la citotoxicidad inducida por H2O2 en células PC12
Se probaron los efectos citotóxicos del H2O2 y phGs (0.1,1,5 y 10 卩g/mL) en las células PC12. Los resultados mostraron que el H2O2 indujo la pérdida de viabilidad de las células PC12 de manera dependiente de la concentración y dependiente del tiempo (Figura 1A). La exposición de las células PC12 a 200 H2O2 durante 2 h dio lugar a una viabilidad celular del 57,4%. El pretratamiento de células con PhGs a 0.1,1, 5 y 10 昭/mL no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular (Figura 1B) y protegió marcadamente a las células PC12 del daño inducido por H2O2 al mejorar la viabilidad celular como 9.549-22.141%, 12.092-25.289%, 1.470-9.289% y 3.411-11.441%, respectivamente (Figura 1C). Sin embargo, el pretratamiento con salidrosido (0,1 ^g/mL), isacteosido (0,1, 1, 5 y 10 ^g/mL), equinacósido (0,1,1 y 5 ^g/ml) no mostró diferencias significativas en la lesión celular inducida por HzOz. El pretratamiento de células con PhGs también mejoró la característica morfológica inducida por H2O2 (Figura 1D).
Figura 1.Los PHG suprimieron la citotoxicidad inducida por H2O2 en las células PC12. La viabilidad celular se detectó mediante ensayo MTT. Efecto citotóxico de H2O2 (A) y PhGs (B) a diferentes concentraciones en células PC12. (C) Los PhG atenuaron la disminución inducida por H2O2 en la viabilidad celular. Las células PC12 se incubaron con PhGs (0,1 y 10 mg/ml) durante 24 h, y luego se incubaron con 200 pM H2O2 durante otras 2 h después de que se eliminaron los PhG. D) Observación morfológica. Las células después del tratamiento fueron observadas por un microscopio de contraste de fase (x100), CK: grupo normal, H2O2: grupo tratado con H2O2, HL: grupo tratado con dosis bajas de salidrosido, HH: grupo tratado con dosis altas de salidrosido, ML: grupo tratado con dosis bajas de actósido, MH: grupo tratado con dosis altas de actósido, IL: grupo tratado con dosis bajas de isoacteosido, IH: grupo tratado con dosis altas de isoacteosido, SL: grupo tratado con dosis bajas de equinacósido, SH: grupo tratado con dosis altas de equinacósido. ** p< 0.01="" versus="" untreated="" group;="" #="" p="">< 0.05,="" versus="" h2o2="" treated="" group;="" ##="" p="">< 0.01,="" versus="" h2o2="" treated="">
2.2. Los PhG suprimieron la acumulación intracelular inducida por H2O2 de ROS, la peroxidación lipídica (MDA) y el aumento de las actividades de la superóxido dismutasa (SOD) en células PC12
La exposición de las células PC12 a 200 pM H2O2 durante 2 h aumentó los niveles de ROS, el contenido de MDA y la disminución de la actividad de SOD (Figura 2). El pretratamiento con PHGs atenuó el nivel de ROS, salidrosido y acteosido, y la alta dosis de pretratamiento con isoacteosidos y equinacó significativamente el nivel de ROS (p< 0.01).="" salidroside="" pretreatment="" showed="" no="" effect="" on="" mda="" content,="" but="" acteoside="" pretreatment="" significantly="" attenuated="" mda="" content="" (p="">< 0.05).="" isoacteoside="" and="" echinacoside="" pretreatment="" significantly="" attenuated="" mda="" content="" to="" a="">
Figura 2.Los PHG bloquearon la acumulación de ROS y MDA y aumentaron las actividades de SOD en células PC12. Las células PC12 se incubaron con PhGs (0.1 y 10 四g/mL) durante 24 h, y luego se incubaron con 200 |^M H2O2 durante otras 2 h después de que se eliminaron los PhGs. (A) Los PhGs bloquearon la acumulación de ROS y MDA. (B) Los PHG bloquearon la acumulación de MDA. C) Los doctorados aumentaron las actividades de la SOD. CK: grupo normal, Modelo: grupo tratado con H2O2, Salidroside: grupo tratado con salidroside, Acteoside: grupo tratado con acteoside, Isoacteoside: grupo tratado con isoacteoside, Echinacoside: grupo tratado con equinacósido. ** p< 0.01="" versus="" untreated="" group;="" #="" p="">< 0.05,="" versus="" h2o2="" treated="" group,="" ##="" p="">< 0.01,="" versus="" h2o2="" treated="">
2.3.PhGs Apoptosis inducida por H2O2 inversa en células PC12
El tratamiento con H2O2 (200 |1M) durante 2 h aumentó significativamente la apoptosis en células PC12, con una tasa apoptótica total de hasta el 16,02% (Figura 3). Sin embargo, el pretratamiento con PhGs (0,1 y 10 卩g/mL) durante 24 h disminuyó la tasa de apoptosis de manera dependiente de la concentración (p< 0.01).="" salidroside,="" acteoside,="" isoacteoside,="" and="" echinacoside="" markedly="" decreased="" the="" percentage="" of="" cell="" apoptosis="" by="" 4.750-6.627%,="" 4.413-5.800%,="" 6.593-10.047%,="" and="" 1.530-7.510%,="">
Figura 3. Los PHG revirtieron la apoptosis inducida por H2O2 en células PC12. Las células PC12 se incubaron con PhGs (0.1 y 10 卩g/mL) durante 24 h, y luego se incubaron con 200 pM H2O2 durante otras 2 h después de que se eliminaron los PhGs. Luego, la apoptosis se midió por citometría de flujo utilizando una sonda fluorescente PI / FITC. CK: grupo normal, Modelo: grupo tratado con H2O2, Salidroside: grupo tratado con salidroside, Acteoside: grupo tratado con acteoside, Isoacteoside: grupo tratado con isoacteoside, Echinacoside: grupo tratado con equinacósido. ** p< 0.01="" versus="" untreated="" group;="" ##="" p="">< 0.01,="" versus="" h2o2="" treated="">
2.4. Los PhGs invirtieron la regulación a la baja inducida por H2O2 de la expresión de proteínas de HO-1, NQO1, GCLC y GCLM
HO-1, NQO1 y glutamato-cisteína ligasa (GCL) son enzimas antioxidantes celulares importantes, y HO-1, NQO1 y subunidades catalíticas o modificadoras de GCL (GCLC o GCLM) son genes aguas abajo regulados por Nrf2 [27]. Se observó la expresión proteica de HO-1, NQO1, GCLC y GCLM después del tratamiento. Se encontró una diferencia obvia entre la expresión proteica de HO-1 y NQO1 con o sin H2O2 (Figura 6A-C) (p< 0.01).="" phgs="" (0.1="" and="" 10="" p^g/ml)="" reversed="" the="" h2o2-induced="" downregulation="" of="" protein="" expression="" of="" ho-1="" (except="" salidroside="" at="" 0.1="" pg/ml),="" nqo1="" (except="" acteoside="" at="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01).="" h2o2="" also="" downregulated="" gclc="" and="" gclm="" protein="" expression="" (p="">< 0.05)="" (figure="" 6a,d,e).="" phgs="" (0.1="" and="" 10="" pg/ml)="" reversed="" h2o2-induced="" downregulation="" of="" protein="" expression="" of="" gclc="" (except="" echinacoside="" at="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01)="" and="" gclm="" (except="" salidroside="" at="" 0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01).="" then,="" the="" chemical="" inhibitors="" for="" ho-1="" were="" used="" to="" further="" evaluate="" the="" roles="" of="" the="" antioxidant="" enzymes="" in="" regulating="" the="" protection="" of="" phgs="" against="" h2o2-induced="" cytotoxicity.="" phgs="" (0.1="" and="" 10="" pg/ml)="" prevented="" h2o2-induced="" cytotoxicity,="" but="" such="" protective="" effect="" was="" reversed="" by="" ho-1="" inhibitor="" znpp="" (p="">< 0.01)="" at="" 20="" pm="" (figure="" 6f,="" p=""><>
2.5. Expresión de Keap1 y análisis de acoplamiento molecular
En condiciones fisiológicas, Keap1 actúa como una proteína represora de Nrf2 al unirse al dominio Neh2 de Nrf2 y dirigirse a Nrf2 a una ubiquitina ligasa E3 basada en Cul3 para la ubiquitinación y posterior degradación por el proteasoma 26S [28]. La capacidad de unión a Keap1 de PhGs se evaluó mediante análisis de acoplamiento molecular para investigar el mecanismo bajo su efecto antioxidante.
Efecto antioxidante: CistancheDoctorados
3. Discusión
Investigamos la neuroprotección de PhGs sobre la citotoxicidad inducida por H2O2 en células PC12. Los resultados muestran que el pretratamiento con PhG suprimió significativamente la citotoxicidad inducida por HzOz, atenuó el nivel intracelular de ROS, mejoró el nivel de enzimas antioxidantes intracelulares y, en última instancia, revirtió la citotoxicidad inducida por H2O2 en células PC12. Además, los PhG aumentaron la activación transcripcional de Nrf2, revirtieron la regulación a la baja inducida por HzOz de la expresión de proteínas de HO-1, NQO1, GCLC y GCLM. Además, los PhG mostraron una interacción potencial con el sitio de unión Nrf2 en la proteína Keap1.
En la lesión celular PC12 inducida por H2O2, la peroxidación lipídica, que se refiere a la degradación oxidativa de los lípidos, aumentó la permeabilidad de las membranas, lo que provocó daño celular [29]. La formación de MDA es ampliamente utilizada como el índice de peroxidación lipídica [30]. H2O2 mejoró la producción de ROS y agotó las enzimas de defensa antioxidante, como SOD, catalasa y GPx. Este proceso conduce al estrés oxidativo [31], que desempeña un papel clave en la causalidad y progresión de la mayoría de los trastornos neurodegenerativos. De acuerdo con estudios previos, observamos un mayor nivel de ROS, enzimas antioxidantes intracelulares reducidas y apoptosis mejorada de las células PC12 después del tratamiento con H2O2. El pretratamiento con PHGs atenuó significativamente el aumento inducido por HzOz en ros intracelulares, mejoró las enzimas antioxidantes intracelulares y, en última instancia, revirtió la citotoxicidad inducida por HzOz en células PC12.
Kuang et al. [32] informaron que el equinacósido mostró un efecto neuroprotector significativo sobre la citotoxicidad inducida por H2O2 en células PC12 a través de la vía apoptótica mitocondrial. En este estudio, encontramos que el equinacósido, el salidrosido, el acteosósido y el isoacteosido mostraron efectos neuroprotectores al mejorar la actividad antioxidante de las células PC12 porque aumentaron la activación transcripcional de Nrf2 y regularon la expresión de proteínas aguas abajo de HO-1, NQO1, GCLC y GCLM. Numerosos estudios han demostrado claramente que la activación de los genes diana Nrf2, en particular HO-1, en astrocitos y neuronas protegen fuertemente contra la inflamación, el daño oxidativo y la muerte celular. Se ha informado que el sistema HO-1 es muy activo en el sistema nervioso central, y su modulación aparentemente juega un papel crucial en la patogénesis de los trastornos neurodegenerativos [33]. Estudios recientes también aclararon el papel de Nrf2 en la progresión y el riesgo de EP [9] y Keap1 como un objetivo eficiente para la reactivación de Nrf2 en AD [34]. Los resultados apoyan la nueva evidencia de Nrf2 como diana terapéutica en enfermedades neurodegenerativas.
El análisis de acoplamiento molecular mostró que los PhG podrían unirse a Keap1, con las siguientes capacidades de unión: equinacósido > isacteoside > acteósido > salidroside. De acuerdo con estos resultados, el pretratamiento con PhGs condujo a la translocación nuclear Nrf2, con la siguiente expresión de Nrf2 en el núcleo: echinacósido > isacteoside * acteoside > salidroside. Asumimos que el número de glucósidos afectaba el posible modo de unión de PhGs y Keap1, y el modo de unión causó además la liberación de Nrf2 de Keap1. Este proceso resultó en la activación de Nrf2 y los genes aguas abajo y, en última instancia, protege a las células PC12 del estrés oxidativo inducido por H2 O2.
Efectos neuroprotectores del cistancheDoctorados
4. Materiales y métodos
4.1. Compuestos químicos y reactivos
Salidroside (CAS No. 10338-51-9), acteoside (CAS No. 61276-17-3), isoacteoside (CAS No. 61303-13-7) y echinacoside (CAS No. 82854-37-3) fueron comprados a YYuanye Biotechnology Company (Shanghai, China). Los PhG se disolvieron en PBS para producir una solución madre de 10 mg/ml, que se almacenó a -20 °C. El H2O2 fue comprado a Aladdin® (Shanghai, China). El suero bovino medio y fetal RPMI-1640 se compró a Hyclone (Logan, UT, EE. UU.), y el 0,5% de tripsina EDTA, penicilina y estreptomicina se compraron a Keyi (Hangzhou, China). MDA, kits de diagnóstico SOD, MTT y DCFH-DA fueron comprados al Instituto Beyotime de Biotecnología (Nanjing, Jiangsu, China). El kit de doble tinción Annexin V-FITC/PI fue adquirido a Solarbio Life Sciences (Beijing, China). Los anticuerpos contra Nrf2, Histona H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM y p-actina, peróxido de rábano picante (HRP) IgG y anti-conejo-HRP-IgG se compraron a Abcam (Londres, Reino Unido). Los inhibidores de HO-1 y ZnPP fueron comprados a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RNAiso Plus, PrimeScript™RT reagent Kit con gDNA Eraser y SYBR® Premix Ex Taq™ II fueron comprados a Takara (Shiga, Japón). Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent fue comprado a Thermo Fisher Scientific (Waltham, Reino Unido). Las secuencias de siRNA Nrf2 fueron las siguientes: adelante, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; y viceversa, UUAAGACACUGUAAUUCGG. Mientras tanto, las secuencias de siRNA de control fueron las siguientes: forward, UUCUCCGAACGUGUCACGU; y reverso, ACGUGACACGUUCGGAGAA.
4.2. Cultivo celular
La línea de feocromocitoma suprarrenal de ratón (células PC12) se obtuvo del Instituto de Bioquímica y Biología Celular, SIBS, (CAS, Shanghai, China). Las células se mantuvieron en RPMI-1640 (Hyclone) que contenía 10% de suero fetal bovino (Hyclone), 100 U/mL de penicilina y 0,1 mg/ml de estreptomicina a 37 °C con 5% de CO2. El medio se cambiaba cada dos días.
4.3. Viabilidad celularEnsayo
Las células PC12 se sembraron en placas de 96 pocillos a 2 x 104 células/pozo. Después de la unión, las células se preincubaron con o sin inhibidor durante 20 min, se incubaron con o sin PhGs durante 24 h, y luego se incubaron con H2O2 durante otras 2 h después de que se eliminaron los PhGs. Después de la incubación, las células se trataron con 5 mg/ml de MTT durante 4 h a 37 °C, y los medios se retiraron cuidadosamente. Los cristales de formazano que se habían formado por las células sobrevivientes se disolvieron en 150 rL de DMSO para generar un color azul [35], y la absorbancia se midió a 570 nm en un lector de placas. Los controles utilizaron la misma concentración de medio con DMSO solo. La viabilidad celular se normalizó como porcentaje de control.
Las concentraciones de PhGs (0.1,1,5 y 10 Rg/mL) se eligieron dependiendo del análisis de citotoxicidad de PhGs y el efecto citoprotector reportado de echinacoside [32]. Según el informe, no se mostró ningún efecto de citotoxicidad por debajo de 10 Rg / ml, y se informó que el equinacósido mostró un efecto citoprotector en el modelo celular lesionado por HzOz.
4.4. Ensayo de apoptosis
Se detectó apoptosis con un kit de doble tinción Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Las células PC12 se sembraron en placas de 6 pocillos a 2 x 105 células/pozo. Después de la unión, las células se trataron con PhGs (0.1 y 10 Rg/mL) durante 24 h y se incubaron con H2O2 durante otras 2 h después de que se eliminaron los PhGs. Después de la incubación, las células se lavaron en PBS frío, se centrifugaron dos veces a 1500 rpm durante 10 minutos y se resuspendieron en 500 rL de tampón de unión. Annexina V (5 rL) y yoduro de propidio marcadas con FITC.
Abreviaturas
GCLC glutamato-cisteína ligasa-subunidad catalítica
GcLM glutamato-cisteína ligasa-modificador catalítico subunidad modificador
Peróxido de hidrógeno H2O2
HO-1 hemo oxigenasa 1
Keap1 Kelch ECH proteína de asociación 1
NQO1 NAD(P)H quinona oxidorreductasa 1
Factor nuclear Nrf2 factor eritroide 2 relacionado con factor 2
PhGs salidroside, acteoside, isoacteoside, y echinacoside
Especies reactivas de oxígeno ROS
ZnPP zinc protoporfirina
Extracto de Cistanche deserticola: PHG de cistanche
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