Parte 1 Efectos neuroprotectores de los glucósidos feniletanoides en un modelo in vitro de la enfermedad de Alzheimer
Mar 10, 2022
¿Es real el efecto neuroprotector de Cistanche?
JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,
SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 y JUMPING HU2
1 Departamento de Farmacia, Primer Hospital Afiliado; 2 Departamento de Medicinas Naturales,
Facultad de Farmacia, Universidad Médica de Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011, PR China
Recibido el 8 de enero de 2016; Aceptado el 6 de enero de 2017
Resumen.
El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos neuroprotectores deglucósidos de feniletanoide(PhGs) en H2O2- y péptido -amiloide (A )1-42-daño inducido de células PC12 como modelo in vitro de la enfermedad de Alzheimer (EA). Las condiciones óptimas de inducción se establecieron mediante la selección de varios tiempos y concentraciones de incubación. Las células PC12 se trataron con 0.5 µM A 1-42 y H2O2 en presencia de PhG durante 24 h y luego se evaluó la viabilidad celular mediante un ensayo MTT; También se midieron la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) y el contenido de malondialdehído (MDA). Las condiciones óptimas para establecer el modelo de AD fueron el tratamiento de células PC12 con 0.5 µM A 1-42 durante 48 h, o con 25 µM de H2O2 disuelto en DMEM con PBS. Los PhG en concentraciones de 5, 25 y 50 µg/ml aumentaron la viabilidad y redujeron la liberación de LDH y MDA por parte de las células PC12 lesionadas con A 1-42 o H2O2. En conclusión, el modelo de lesión celular PC12 inducida por A 1-42- y H2O2- se estableció con éxito. Se demostró que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo contra la lesión celular inducida por A 1-42- o H2O2-.
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Introducción
La enfermedad de Alzheimer (EA), un trastorno neurodegenerativo con las características clínicas de pérdida progresiva de la memoria y deterioro de la función cognitiva (1), es la causa más común de demencia en todo el mundo (2). Los costos financieros son inmensos debido a la prevalencia de la DA (3). Por lo tanto, es urgente desarrollar medios apropiados para el manejo y la prevención de la EA.
La patogenia de la EA está estrechamente relacionada con la acumulación de ovillos neurofibrilares y placas seniles (SP) en las regiones cerebrales afectadas (4,5). Se ha informado que el péptido amiloide (A), el componente principal de las SP, tiene un papel causal en la progresión de la EA, ya que tiene un efecto tóxico en las células neuronales (6). Los fragmentos A, incluidos A 1-40, A 25-35 y A 1-42, se generaron a través de la división de la proteína precursora de amiloide (7). Se encontró que la neurotoxicidad de A 1-42 es significativamente mayor que la de A 25-35 y A 1-40, y A 1-42 es capaz de inducir un modelo de EA (1,{ {13}}). El estrés oxidativo puede estar involucrado en la patogenia de la EA y es el principal mecanismo subyacente a la neurotoxicidad inducida por A (11-13). Varios estudios sugirieron que A 1-42 causó la acumulación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que condujo a la oxidación de lípidos y proteínas, daño al ADN y activación de la señalización del punto de control del ciclo celular (1,14,15). Cantidades excesivas de H2O2 pueden provocar daño oxidativo e inducir la apoptosis de las células PC12 (16). Por lo tanto, atacar el estrés oxidativo puede ser un enfoque prometedor para el desarrollo de estrategias terapéuticas para inhibir la neurotoxicidad inducida por A en la EA. Herba (H.)Cistanche, una medicina herbal china comúnmente utilizada en China continental para nutrir los riñones y reponer la esencia y la sangre, se ha utilizado para tratar la pérdida de memoria y el estreñimiento senil (17).Glucósido feniletanoide(PhG), uno de los principales componentes de H.Cistanche, mejora el deterioro de la apoptosis neuronal causada por A 25-35 a través de sus efectos antioxidantes (18,19). Un estudio anterior identificó cinco componentes principales del total de PhG, a saberacteósido, 2'-acetilactósido, echinacósido, citanósidos yisoactósido(20). Entre estos componentes,acteósidoyechinacósidose ha informado que tienen efectos neuroprotectores sobre la neurotoxicidad inducida por A 25-35- o H2O2- (21-23). Por ejemplo, Wu et al (24) sugirieron queacteósidoyechinacósidodisfunción cognitiva mejorada causada por A 1-42. El presente estudio tuvo como objetivo investigar los efectos protectores de las PhG en un modelo de células de rata in vitro de AD.
materiales y métodos
PreparacióndePhGs. Los PhG totales se extrajeron deH. Cistanchecomo se describió previamente (25). El tallo secado al aire deH. Cistanche se pulverizó y se extrajo por percolación con EtOH al 80 por ciento. El percolado se evaporó a temperatura reducida
presión, seguido de resuspensión en una cantidad apropiada de H2O2(100 µmol/l). La mezcla se aisló en una columna de resina macroporosa SP-825 (Mitsubishi Chemical, Tokio, Japón) y se eluyó con 0, 30, 50, 70 y 90 por ciento de EtOH en agua. Para obtener la fracción rica en PhG, los eluyentes de EtOH al 30-50 por ciento se concentraron y secaron a presión reducida. Se realizó espectrofotometría ultravioleta (UV) para determinar los PhG totales. El contenido deechinacósidoyacteósidose determinó por cromatografía líquida de alta presión según un protocolo anterior (26). Se usó una columna Hypersil ODS-2 (4,6x250 mm, 5 µm; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, China) y se mantuvo a temperatura ambiente. Las fases móviles fueron cianuros de metilo y agua que contenía 0,4 por ciento de ácido fosfórico (v/v; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). El caudal fue de 0,75 ml/min y la longitud de onda se fijó en 333 nm.
Cultivo de célulasytratamiento de drogasLa línea celular de feocromocitoma de rata PC12 fue proporcionada por el Dr. He Chunhui, de la Facultad de Medicina de la Universidad Médica de Xinjiang (Urumqi, China). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 por ciento (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghái, China), 100 U/ml penicilina y 100 U/ml de estreptomicinas en una incubadora a 37 °C que contiene 5 % de CO2y 95 por ciento de aire. Al alcanzar una confluencia del 80 por ciento, las células se trataron con 0,25 por ciento de tripsina y se pasaron.
Para eliminar la interferencia del propio fármaco sobre el crecimiento de las células PC12, se realizó un experimento de toxicidad. En resumen, las celdas PC12 (3x104células/ml) se sembraron en 96-placas de pocillos a 100 µl/pocillo y se incubaron a 37 ˚C durante la noche. Después de desechar el sobrenadante, se añadieron 200 µl de DMEM completo al grupo en blanco, mientras que las células de los grupos de intervención se trataron con PhG a varias dosis (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 y 200 µg/ mililitros). Después de la incubación de las células a 37 °C durante 48 h, se añadieron a cada pocillo 20 µl de solución de MTT (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA). Después de la incubación durante 4 h, se descartó el sobrenadante y se añadieron 150 µl de dimetilsulfóxido por pocillo, seguido de agitación durante 10 min. Los valores de densidad óptica (DO) a 490 nm se detectaron utilizando un lector de placas ELISA.
A 1‑ 42-inducidoPC12Daño celular.Se disolvió en agua (100 µg/ml) un péptido 1-42 adquirido de Bioss Biotech (Beijing, China). Posteriormente, la mezcla se incubó a 37 ˚C durante 4 días y se almacenó a 4 ˚C antes de su uso.
Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos (3xl04células en 100 µl por pocillo). Después del cultivo durante 24 h para determinar la adherencia, se disuelven 50 µl A 1-42 en varias concentraciones finales (0, 0.25, 0,5, 1, 1,5 o 2 µM) en DMEM sin suero, seguido de incubación durante 24, 48, 72 o 96 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT. Se determinó que la concentración óptima de A 1-42 era 0,5 µM. Células PC12 (3xl04células por pocillo) se trataron con varias dosis de PhG ({{0}}, 0.5, 5, 25 o 50 µg/ml) en presencia de 0,5 µM A {{8 }} durante 24 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT.
H2O2-inducidoPC12Daño celular. Las células PC12 se sembraron en 96-placas de pocillos (3xl04células en 100 µl por pocillo). Después de cultivar
durante 24 h para adherencia, 100 µl H2O2a varias concentraciones finales ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 y 500 µM) disuelto en DMEM con o sin PBS (0,01 mol/l), seguido de incubación durante 24 horas La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT. El H óptimo2O2Se determinó la concentración y el solvente para establecer lain vitromodelo de AD.
Células PC12 (3xl04células por pocillo) se trataron con varias dosis de PhG ({{0}}, 0,5, 5, 25 y 50 µM). Después de cultivar durante 24 h para determinar la adherencia, las células PC12 se trataron con 100 µl de H2O2disuelto en DMEM con PBS en presencia de PhGs durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo MTT.
lactatodeshidrogenasa (LDH)ensayo de liberación El daño celular se evaluó midiendo la actividad de LDH en el sobrenadante de células PC12 usando un kit de LDH de acuerdo con el protocolo del fabricante (cat. no. 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China). En resumen, H bidestilada2Se añadieron secuencialmente O, {{0}}, 2 µmol/ml de ácido pirúvico, tampón de matriz y tampón de coenzima I 48 h después del tratamiento con el fármaco. Después de la incubación a 37 °C durante 15 min, se añadió 2,4-dinitro-fenilhidracina. Posteriormente, se añadieron a cada pocillo 250 µl de una solución de NaOH 0,4 M. El sobrenadante se recogió después de una incubación de 30 min a temperatura ambiente. Luego se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas.
Medicióndemalondialdehído(MDA). La MDA se midió en el sobrenadante de las células PC12 utilizando un kit comercial (cat. n.º 20150604; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se agregaron en orden alcohol deshidratado y otros reactivos, seguidos de incubación en un baño de agua. a 95˚C durante 40 min. La mezcla se centrifugó a 1.006 xg y 25˚C durante 10 min después de enfriar. Luego se usó el sobrenadante para determinar el contenido de MDA. Posteriormente se midió la absorbancia con un lector de microplacas a 532 nm.
Evaluación de protector efectos de echinacósido y acteósido contra ANUNCIO en vitro. Las células PC12 se sembraron a una densidad de 3xl04células/pocillo en {{0}}placas de pocillos (100 µl/pocillo). Las células se incubaron con medicamentos que incluían echinacósido (n.º de cat. 111670-200503; Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Drogas, Beijing, China) y acteósido (n.º de cat. 111530-200505; Institutos Nacionales para el Control de Alimentos y Drogas). ) a varias concentraciones (0,5, 25 y 50 µg/ml). Posteriormente, las células se trataron con A 1-42 o H2O2durante 24 hy la viabilidad celular se midió mediante un ensayo MTT.
Estadístico análisis. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. La prueba t de Student se utilizó para las comparaciones entre grupos. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, EE. UU.). PAGS<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Resultados
Cuantificación de PhGs de H. Cistanches.Los espectros UV de las PhG extraídas, así como las soluciones estándar deechinacósidoy acteoside fueron registrados, y los resultados mostraron que los espectros UV eran consistentes (Fig. 1). espectrofotometría ultravioleta
mostró que el contenido de PhG era del 87,6 por ciento. Los resultados de la HPLC mostraron que los contenidos de equinacósido y acteósido eran
37,7 y 17,8 por ciento, respectivamente (Fig. 2).
DeterminacióndelaidealPhGconcentración. En comparación con el grupo en blanco, PhG a 75, 100, 125, 150, 175 y 200 µg/ml tuvo un efecto inhibidor significativo sobre las células PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 por ciento (Fig. 3). Por tanto, se usaron PhG a la concentración de 5, 25 y 50 µg/ml para tratar células PC12 en experimentos posteriores debido a que no afectaban a la viabilidad celular.
A 1‑42-inducidoPC12Daño celular.En comparación con el grupo de control, la viabilidad celular en el grupo de lesión 0.5 µM A 1-42 fue del 63 por ciento (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitromodelo AD.
También se determinó la actividad de las células PC12 tratadas con 00,5 µM A 1-42 en presencia de dosis seguras de PhG (5, 25 y 50 µg/ml) durante 24 h. En comparación con el grupo modelo (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">
H2O2-inducidoPC12Daño celular. La viabilidad de las células PC12 tratadas con 25 µM H2O2disuelto en DMEM con PBS fue del 56,43 por ciento. La viabilidad de las células PC12 tratadas con 200 µM H2O2disuelto en DMEM sin PBS fue del 71,64 por ciento (Tabla I). Por lo tanto, las células PC12 tratadas con 25 µM H2O2disueltas en DMEM con PBS fueron seleccionadas como la condición óptima para establecer el modelo AD.
En comparación con el grupo de control, la viabilidad celular en el grupo modelo fue del 48,8 por ciento (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">
Los PhG y la viabilidad de las células PC12 tratadas con PhG a concentraciones de 5, 25 y 50 µg/ml fueron del 54, 57 y 64 por ciento, respectivamente (Tabla II).
Los PhG inhiben la liberación de LDH inducida por lesiones por parte de las células PC12. En comparación con el grupo de control, el contenido de LDH del sobrenadante de las células PC12 dañadas aumentó, lo que fue inhibido por PhG de manera dependiente de la concentración. Este resultado indicó que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo en las células PC12 (Fig. 6).
inhibido por PhGs de una manera dependiente de la concentración. Este resultado indicó que las PhG tienen un efecto neuroprotector significativo en las células PC12 (Fig. 7). PhG y sus componentes echinacoside y acteoside rescatan la viabilidad de las células PC12 dañadas. En comparación con el grupo modelo, el tratamiento con acteósido aumentó significativamente la viabilidad de las células PC12 dañadas por A 1-42- de una manera dependiente de la dosis. Los PhG y el equinacósido también aumentaron significativamente la viabilidad de las células PC12 dañadas por A 1-42-en todas las concentraciones probadas (Fig. 8A).
En comparación con el grupo modelo, el acteósido aumentó significativamente la viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2. Los PhG también aumentaron la viabilidad de las células PC12 tratadas con H2O2, mientras que el efecto no fue significativo a concentraciones de 5 y 25 µg/ml (Fig. 8B). Además, el equinacósido aumentó la viabilidad celular a 25 µg/ml.
En conclusión, el acteósido, las PhG y el equinacósido ejercieron efectos neuroprotectores significativos en las células PC12 sometidas a lesión con A 1-42 o H2O2.
