Las células T CD4D reactivas al antígeno nuclear se expanden en el lupus eritematoso sistémico activo, producen citocinas efectoras e invaden los riñones

Contacto: ali.ma@wecistanche.com

Dimas Abdirama et al.

Cistanche DHT para la enfermedad renal, haga clic aquí para obtener la muestra

lupus sistémicoeritematosoes sistémica y crónicaautoinmuneenfermedadcaracterizado por una pérdida de tolerancia hacia los antígenos nucleares con autorreactivosCD4DCélulas T implicadas en la patogénesis de la enfermedad. Sin embargo, se sabe muy poco acerca de su especificidad de receptor desde la detección de anticuerpos específicos de autoantígenos humanos.CD4DLas células T han sido extremadamente desafiantes. Aquí presentamos un análisis deCD4DCélulas T reactivas a antígenos nucleares utilizando dos métodos complementarios: bibliotecas de células T y enriquecimiento de células T reactivas al antígeno. Las frecuencias de antígeno específico nuclearCD4DLas células T se correlacionaron con la gravedad de la enfermedad. Estas células T autorreactivas producen citocinas efectoras como interferón-g, interleucina-17 e interleucina-10. En comparación con la sangre, estas células estaban enriquecidas en la orina de pacientes con nefritis lúpica activa, lo que sugiere una infiltración del tejido inflamado.riñones. Por lo tanto, estas características previamente no reconocidas respaldan el papel de las células T CD4D específicas de antígeno nuclear en el lupus eritematoso sistémico.

lupus sistémicoeritematoso(LES) es una enfermedad autoinmune sistémica y crónica caracterizada por la pérdida de tolerancia hacia los antígenos nucleares debido a la eliminación defectuosa de los desechos biológicos, como el material apoptótico que contiene ribonucleoproteínas y nucleosomas. enfermedad.²Además, las células T CD4+ autorreactivas están implicadas en la patogenia del LES al promover la producción de autoanticuerpos por parte de las células B y propagar directamente el daño orgánico en los órganos diana inflamados.³Aunque la detección de células T reactivas al antígeno nuclear se informó anteriormente, la evidencia de su existencia sigue siendo circunferencial hasta ahora y actualmente no está claro cómo interactúan en la patogénesis.^4–9Comprender cómo estas células participan en la autoinmunidad será fundamental para el diseño de un tratamiento eficaz.

La detección de células T específicas de autoantígeno se ve obstaculizada por sus frecuencias extraordinariamente bajas en la sangre circulante.10 Estudios previos de repertorios de células T CD4+ ingenuas humanas han utilizado tecnología basada en tetrámeros para proporcionar información precisa sobre las respuestas de las células T a epítopos de antígenos específicos. ; sin embargo, este método requiere un conocimiento previo de los tipos de antígenos leucocitarios humanos del donante.^11–13Se desarrollaron técnicas alternativas para detectar y enumerar simultáneamente poblaciones de células T raras con reactividad a diferentes antígenos sin conocimiento previo de los tipos de antígenos de leucocitos humanos mediante el uso de bibliotecas de células T policlonales amplificadas.¹⁴y por enriquecimiento de células T que expresan CD154-después de la estimulación con un antígeno denominado ARTE (enriquecimiento de células T reactivas al antígeno).¹⁵

Las células T CD4+ ejercen su función principalmente a través de la secreción de citocinas tras la activación antigénica¹⁶y propagando la inflamación tisular como en la nefritis lúpica (LN) que representa una de las complicaciones más graves del LES.^17,18

El análisis del repertorio de células T presente en biopsias renales de pacientes con NL reveló oligoclonalidad deriñón-linfocitos T CD4+ infiltrantes, lo que indica la acumulación de linfocitos T específicos de antígeno en células inflamadasriñones.¹⁹Nuestro estudio anterior reveló que las células T urinarias en pacientes con NL activa son un biomarcador preciso que se asemeja al fenotipo de las células intrarrenales.^20,21Aunque estas células están enriquecidas para el receptor de quimiocinas CXC 3 y el receptor de quimiocinas CC 5 que expresan células T indicativas de una población de células T colaboradoras 1 (Th1) y contienen células T CD154+ que sugieren un encuentro reciente con el antígeno,^22,23su especificidad antigénica hacia antígenos nucleares sigue sin estar clara En este estudio, presentamos un análisis de células T CD4+ reactivas a antígenos nucleares en un total de 17 individuos sanos,¹² sujetos con LES inactivo y 20 sujetos con LES activo mediante el uso de bibliotecas de células T y técnicas ARTE para analizar las frecuencias de células T CD4+ autorreactivas en sangre periférica y orina de pacientes con LN, así como la producción de citoquinas.

RESULTADOS

Los linfocitos T CD4D reactivos al antígeno nuclear se expanden con SLE inactivo según se determina mediante una biblioteca de linfocitos T y ARTE

Dada la alta sensibilidad teórica para detectar células T específicas de antígeno raras, se generaron bibliotecas de células T CD4+ amplificadas y se interrogó por su reactividad contra antígenos nucleares. Se estimularon bibliotecas de células T expandidas de 12 pacientes con LES y 6 controles sanos con los antígenos nucleares canónicos SmD1, RNP70, histona, Ro y La en presencia de células presentadoras de antígeno, seguido de la medición de la concentración celular. proliferación en respuesta a la estimulación antigénica (Figura complementaria S1A). Debido a que los blastos de células T amplificados respondieron de manera diferente a los antígenos, se utilizó una puntuación z específica del donante como umbral de proliferación y el grado del índice de estimulación (respuesta de las células estimuladas en relación con las células no estimuladas) al superantígeno Staphylococcus enterotoxin B (SEB ) sirvió como criterio de inclusión (Figura complementaria S1B-D). Además de los antígenos nucleares, incluimos la transtiretina como un autoantígeno de control irrelevante (n=8 pacientes con LES; n=5 controles sanos) (Figura 1a). La detección de células específicas de antígeno se validó desafiando una serie de microcultivos con puntuación positiva con el antígeno respectivo y analizando la expresión de los marcadores de activación de células T específicos de antígeno CD154 e interferón (IFN)-g mediante el uso de citometría24 compañera (Figura complementaria S1E). Utilizando la distribución de Poisson,14 se enumeraron las frecuencias de células T específicas de antígeno. En particular, las frecuencias medias de algunas células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear aumentaron en pacientes con LES activo en comparación con sujetos sanos (SmD1: P ¼ 1; RNP70: P ¼ 0).{{ 35}}4; histona: P ¼ 0.35; Ro: P ¼ 0.02; La: P ¼ 0.04 ) y pacientes con LES inactivo (SmD1: P ¼ 0.79; RNP70: P ¼ 0.04; histona: P ¼ 0.23; Ro: P ¼ 0.04; La: P ¼ 0.006) (Figura 1b). El número total de células T CD4+ autorreactivas asociadas con LES varió entre individuos en un rango de 0 a 185,5 células por 1 millón de células, con las frecuencias más altas en pacientes con LES activo (Figura 1c). Se detectaron células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear en todos los pacientes con LES activo. Estas células también fueron detectables en 5 de 6 pacientes con LES inactivo, mientras que solo 3 de 6 controles sanos presentaban células T autorreactivas circulantes. Curiosamente, los pacientes con LES activo también mostraron una variedad más amplia de respuestas de células T autorreactivas, y cada paciente tenía células T reactivas contra al menos 3 antígenos nucleares. En comparación, la cartera objetivo fue menos variable en pacientes con LES inactivo y controles sanos. En conjunto, las células T reactivas al antígeno nuclear circulante no son exclusivas del LES, aunque el LES está inactivo, su número es mayor y sus estructuras diana son más variables.

Debido a que las células T autorreactivas desempeñan un papel en la propagación de las respuestas autoinmunes, comparamos el número de células T autorreactivas con la gravedad de la enfermedad, evaluada mediante la puntuación del índice de actividad de la enfermedad SLE (SLEDAI). Solo las frecuencias de células T CD4+ reactivas a RNP70, Ro y La se correlacionaron positivamente con SLEDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ { {11}}.4865; Ro: P ¼ 0.005, r ¼ 0.6299; La: P ¼ 0.01, r ¼ 0.5651) (Figura 1d). Por el contrario, la frecuencia de células T reactivas a la transtiretina se encontró en un nivel bastante similar en los 3 grupos (Figura 1e), descartando así un posible sesgo experimental debido a la hiperreactividad general de células T no específicas de antígeno inactiva SLE.

Las bibliotecas de células T ofrecen una serie de ventajas, incluida una alta sensibilidad para detectar células muy raras dentro de un número bajo de células de entrada. Sin embargo, esta técnica se basa en la expansión de las células, lo que puede alterar la composición celular y proporciona solo una posibilidad limitada para caracterizar fenotípicamente las células reactivas. Por lo tanto, validamos nuestras observaciones con el método ARTE. El protocolo ARTE requiere una mayor cantidad de células de entrada, lo que es especialmente difícil en pacientes con LES que a menudo presentan linfopenia y anemia. Debido a esta limitación y también para aumentar la lectura esperada de células reactivas, agrupamos los 5 antígenos nucleares canónicos y usamos este conjunto para estimular las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) antes del enriquecimiento de las células que expresan CD154- (n=15 pacientes con LES; n=6 controles sanos). Usando una combinación de los marcadores de superficie CD154 y CD69, las células T reactivas a los antígenos nucleares asociados con SLE podrían identificarse dentro de una población de fondo (Figura 1f). Aunque la expresión de fondo de CD154 y CD69 se observó abundantemente en todos los individuos, los pacientes con LES activo tenían frecuencias significativamente mayores de células T CD154+CD69+ cuando se estimularon con antígenos nucleares en comparación con la estimulación de fondo (P ¼ 0).0{ {18}}8), mientras que los individuos sanos y los pacientes con LES inactivo tenían frecuencias similares entre células estimuladas con antígeno y no estimuladas (individuos sanos: P ¼ 0.44; pacientes con LES inactivo: P ¼ {{23} }.56) (Figura 1g). Además, al restar las frecuencias de fondo, las frecuencias de células T reactivas al antígeno nuclear fueron más altas en pacientes con enfermedad activa que en individuos sanos y pacientes con enfermedad inactiva (P ¼ 0.02 y P ¼ 0.11, respectivamente) (Figura 1h). La frecuencia de células T reactivas al antígeno nuclear sustraídas de fondo se correlacionó positivamente con la actividad de la enfermedad (P=0.004, r=0.5978), lo que sugiere su papel potencial en la patogénesis del LES (Figura 1i). Además, las células T CD4+ reactivas a un antígeno de recuerdo Candida albicans MP65 demostraron frecuencias similares entre los donantes (Figura 1j), excluyendo la posibilidad de un sesgo general hacia frecuencias más altas de células T reactivas al antígeno en pacientes con LES activo.

En conjunto, nuestros datos generados con la biblioteca de células T y los métodos ARTE muestran la expansión de células T CD4+ específicas de autoantígeno en pacientes con LES activo. Ambas técnicas son comparables, como lo indican los valores de índice de estimulación mediana similares entre las respuestas de células T estimuladas por antígeno y no estimuladas (índice de estimulación mediana—biblioteca de células T: 1,857; ARTE: 1,614; P=0,33), aunque la técnica ARTE reveló frecuencias más altas de células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear que la técnica de biblioteca de células T (Figura 1k).

Las células T reactivas al antígeno nuclear en individuos sanos son células T CD4D autorreactivas auténticas.

Tanto la biblioteca de células T como las técnicas ARTE demostraron la detección de células T autorreactivas en individuos sanos, lo que representa un posible origen para el desarrollo de la autoinmunidad humana.²⁵Sin embargo, su número no fue significativamente diferente de las frecuencias de fondo, por lo que no está claro si los sujetos sanos realmente tienen que hacer circular células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear. Para desentrañar la especificidad antigénica de las células T autorreactivas en sujetos sanos, generamos clones de células T individuales a partir de precursores de células T CD154+CD69+ CD4+ aislados de individuos sanos después de la estimulación de PBMC con antígenos nucleares individuales y un antígeno de control derivado del lisado de Aspergillus fumigatus. Un número considerable de clones de células T específicas de autoantígenos asociados con LES respondieron a sus antígenos correspondientes después de la reestimulación con antígenos, como se destaca por la coexpresión de IFN-g con CD154 (número de clones específicos—Aspergillus fumigatus: 5 de 5; SmD1: 4 de 8; RNP70: 3 de 11; histona: 5 de 5; Ro: 4 de 9; La: 5 de 7) (Figura complementaria S2A y B). Además, la respuesta al antígeno (que se muestra de manera representativa para SmD1) dependía de la dosis, lo que enfatiza que las células T reactivas al antígeno nuclear en individuos sanos son células T CD4+ autorreactivas auténticas (Figura complementaria S2C). Por lo tanto, confirmamos la existencia de células T reactivas al antígeno nuclear en sujetos sanos dentro de la señal de fondo de los métodos de detección aplicados.

Producción de citoquinas de células T CD4D reactivas al antígeno nuclear

A continuación, examinamos la producción de citoquinas de células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear. Las células que expresan CD154- se tiñeron intracelularmente para detectar citocinas efectoras como IFN-g, interleucina (IL)-17, IL-4 e IL-10 después de la estimulación con un grupo de Antígenos nucleares asociados a SLE (Figura 2a). Las frecuencias de células T CD154+CD4+ productoras de IFN-g–, IL-17– e IL{{10}} aumentaron significativamente en pacientes con LES activo (todas las citocinas: P ¼ {{16} }.004), mientras que la frecuencia de células T autorreactivas productoras de IL-4 permaneció indistinguible de la frecuencia de fondo (P ¼ 0.125) (Figura 2b ). Además, los números absolutos de células T autorreactivas productoras de IFN-g e IL{{20}} fueron mayores en pacientes con LES activo que en individuos sanos y pacientes con LES inactivo (Figura 2b). Al restar las frecuencias de fondo, los pacientes con LES activo tenían frecuencias significativamente más altas de células T autorreactivas productoras de IFN-g e IL-10 que los individuos sanos (IFN-g: P ¼ {{40 }}.003; IL-10: P ¼ 0.004) así como de IFN-g– , IL-17– e IL-10– que producen células T autorreactivas que los pacientes con LES inactivo (IFN-g: P ¼ 0.002; IL{{ 36}}: P=0,002;IL-10: P=0,005) (Figura 2c). Además, la frecuencia de IFN-g– e IL-10– pero no de IL-17– e IL-4– que producen células T reactivas al antígeno nuclear se correlacionó con la actividad de la enfermedad. Sin embargo, solo la frecuencia de células productoras de IL-4 mostró una menor correlación con la actividad de la enfermedad (IFN-g: P < 0,0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il-17:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il="" -4:="" p="0,14," r="0,3717;" il-="" 10:="" p="0,0004," r="0,6977)" (figura="" 2d).="" a="" juzgar="" por="" la="" frecuencia="" de="" los="" productores="" de="" ifn-g,="" las="" células="" t="" cd4+="" reactivas="" al="" antígeno="" eran="" principalmente="" del="" linaje="" th1.="" por="" el="" contrario,="" la="" il-17,="" así="" como="" los="" productores="" de="" il-10,="" se="" detectaron="" solo="" a="" frecuencias="" más="" bajas.26="" en="" comparación="" con="" los="" niveles="" de="" autoanticuerpos,="" las="" frecuencias="" de="" las="" células="" t="" cd4+="" productoras="" de="" citoquinas="" no="" se="" correlacionaron="" con="" la="" concentración="" de="" anti-adn="" de="" doble="" cadena="" y="" con="" el="" título="" sérico="" de="" anticuerpos="" antinucleares="" (figura="" complementaria="" s3a="" y="" b).="" no="" se="" observó="" ninguna="" otra="" correlación="" entre="" las="" células="" t="" cd4+="" reactivas="" al="" antígeno="" nuclear="" y="" los="" autoanticuerpos,="" excepto="" las="" células="" t="" cd4+="" reactivas="" a="" la="" frente="" a="" los="" autoanticuerpos="" la="" (figura="" complementaria="">

Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 se incluyeron para la enumeración de células T CD4+ urinarias específicas para el antígeno nuclear individual. Paralelamente a las células T CD4+ urinarias, se determinó la frecuencia de células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear en sangre periférica, lo que permitió una comparación directa de las frecuencias respectivas dentro de los mismos individuos (Figura 3b). Encontramos que en la NL inactiva, las frecuencias de células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear urinario fueron más altas que las de la sangre periférica. Para confirmar esta observación, etiquetamos las células urinarias aisladas de 4 donantes activos de LN con éster de succinimidilo de carboxifluoresceína y mezclamos las células marcadas con PBMC compatibles con el donante para permitir una comparación directa de las células reactivas al antígeno en 1 ensayo utilizando la técnica ARTE. La frecuencia de células T CD154+CD69+ en muestras estimuladas y no estimuladas de células de sangre periférica y urinarias compatibles con donantes se utilizó para evaluar si las células T reactivas al antígeno nuclear están enriquecidas en la orina como un sustituto de lariñóncalculando el índice de estimulación (Figura 3c). Aunque la biblioteca de células T urinarias y los métodos ARTE diferían en su índice de estimulación media para los antígenos nucleares (índice de estimulación: biblioteca de células T urinarias: 17; ARTE: 2.79; P ¼ 0.4) (Figura 3d) , el análisis de autorreactividad en células T CD4+ periféricas y urinarias de ambos métodos (en total n=7) demostró un aumento del índice de estimulación específica de antígeno nuclear en la orina (P=0.0156) (Figura 3e). Estas observaciones sugieren que las células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear invaden y se acumulan en el tejido inflamado.riñones. Por lo tanto, la inflamación tisular local en el LES podría ser un fenómeno específico de antígeno y modulado directamente por las células T autorreactivas infiltrantes.

DISCUSIÓN

Una ruptura de la tolerancia contra los antígenos nucleares es el sello distintivo del LES y, además de las células B, se cree que las células T autorreactivas desempeñan un papel central en su patogenia. Sin embargo, dado que la detección de (auto)antígeno específico, las células T CD4+ aún representan un desafío importante en la investigación de la autoinmunidad, hasta la fecha, se sabe poco acerca de las células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear en el LES.

Recientemente, se han desarrollado nuevos métodos para la detección y enumeración de células T CD4+ específicas de antígeno. El enfoque de la biblioteca de células T aprovecha la expansión policlonal previa de células T para permitir la detección de clones de células T específicos de antígeno raros.14 Esta estrategia ofrece alta sensibilidad y permite trabajar con cantidades limitadas de células. Usando esta técnica, pudimos demostrar células T reactivas contra 5 antígenos nucleares canónicos en pacientes con LES activo. Las desventajas de la detección basada en bibliotecas son, además de ser laboriosas, que no se puede excluir el crecimiento o la pérdida de ciertos clones durante la fase de expansión y las opciones limitadas para el análisis fenotípico de las células.

La citometría de compañeros estándar está limitada por la cantidad de eventos detectables, lo que generalmente restringe el análisis de muestras a la población con frecuencias superiores al {{0}}.01 por ciento. Nuestra observación usando la biblioteca de células T reveló que la frecuencia de células T CD4+ autorreactivas circulantes para un autoantígeno particular en pacientes con un brote de enfermedad era w20 células en un millón de células, lo que representa una frecuencia de 0.002 por ciento; por lo tanto, la detección de células T CD4+ específicas de autoantígeno utilizando citometría estándar no manipulada es casi imposible. Bacher et al. introdujimos el enriquecimiento previo de células T CD4+ que son reactivas a antígenos particulares antes de la adquisición en citometría compañera, conocido como el método ARTE.15 Al adaptar este enfoque para la detección de células T CD4+ específicas de antígenos nucleares, pudimos confirmar nuestros hallazgos y demostrar la expansión de las células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear en el LES activo. En particular, la frecuencia de células T reactivas con transtiretina y C. albicans fue indiferente entre controles sanos y pacientes con LES con actividad variable de la enfermedad. Por lo tanto, la expansión observada de células T autorreactivas probablemente no sea el resultado de una hiperreactividad general del LES inactivo, sino de la expansión de células T específicas de antígeno.

Informes anteriores ya han demostrado la existencia de células T autorreactivas en el LES, principalmente utilizando la proliferación, la producción de citoquinas o la regulación positiva de los marcadores de activación, aunque sin poder cuantificar una población clara de estas células.4–6,8 La mejor evidencia sobre la Existe una frecuencia de células T específicas de antígeno nuclear para la reactividad contra la ribonucleoproteína pequeña U1, un objetivo de autoantígeno característico en la enfermedad mixta del tejido conjuntivo y que se encuentra solo en una fracción de pacientes con LES. Las células T CD4+ reactivas a la ribonucleoproteína nuclear pequeña U1 se determinaron mediante dilución limitante y el ensayo de punto inmunológico ligado a enzimas (ELISPOT) y se informó que se producían con una frecuencia de (40 a 250) - 106 células T y (20 a 60 ) 106 PBMC, respectivamente,7,9 que es de una magnitud similar a la frecuencia de las células autorreactivas en nuestro estudio. En nuestro trabajo, investigamos la reactividad frente a varios antígenos nucleares asociados al LES característicos. Curiosamente, aunque todos los pacientes con LN activa mostraron una mayor frecuencia de células T CD4+ reactivas al antígeno antinuclear, los pacientes diferían en su cartera de objetivos y la reactividad estaba dirigida contra un conjunto más amplio de antígenos en comparación con los pacientes con LES inactivo. El significado biológico de esto es actualmente desconocido. Diferentes reactividades de células T CD4+ pueden asociarse con ciertas manifestaciones clínicas de diferentes reactividades que pueden ser redundantes para la patogénesis de la enfermedad.

De manera similar a otras enfermedades autoinmunes, también pudimos demostrar la existencia de células T CD4+ autorreactivas en individuos sanos,28,29 aunque a frecuencias mucho más bajas en comparación con pacientes con LES activo. Estas células eran indetectables al comparar el número de células activadas con o sin estimulación con antígeno, incluso con técnicas tan sensibles como las bibliotecas de células T o los métodos ARTE. Sin embargo, mediante la clonación de una sola célula, pudimos demostrar que la señal de "fondo" de hecho contenía células T CD4+ específicas de autoantígeno. Qué eventos específicos conducen a la ruptura de la tolerancia y al aumento de la frecuencia de las células T autorreactivas sigue siendo especulativo; sin embargo, nuestros datos demuestran que la expansión de clones autorreactivos juega un papel en la patogénesis del LES.

Los linfocitos T CD4+ reactivos al antígeno nuclear circulante produjeron principalmente IFN-g y, en menor medida, IL-17 e IL-10. Este perfil de citoquinas, junto con la correlación débil o nula con la producción de autoanticuerpos, sugiere que el papel de las células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear puede no ser el proveedor exclusivo de la ayuda de las células B. Se ha demostrado que el IFN-g es indispensable en la patogenia de la NL.30,31 Se ha demostrado que las células Th1 se reclutan en el tejido renal inflamado en el LES,20,32 lo que hace que las células T reactivas al antígeno nuclear sean las principales candidatas para invadir el tejido renal.riñones, donde encontrarían su omnipresente autoantígeno afín. Se ha descrito anteriormente que las células T urinarias reflejan la actividad de la enfermedad y reflejan el fenotipo de las células intrarrenales en LN20,33; por lo tanto, utilizamos células T urinarias como sustituto de las células T renales. Las células T urinarias revelaron una variabilidad de TCR restringida, lo cual está en línea con las observaciones enriñónbiopsias,19,34 que indican enriquecimiento de ciertos clones de células T en el tejido renal inflamado. Entre las células T urinarias, pudimos detectar células T reactivas al antígeno nuclear, y su frecuencia se enriqueció en comparación con las células T circulantes. En consecuencia, parece probable que las células reactivas al antígeno nuclear participen directamente en la propagación del daño orgánico local.

En resumen, aquí demostramos que las células T CD4+ reactivas al antígeno nuclear son LES inactivas expandidas; fenotípicamente son principalmente células T Th1 productoras de IFN-g e invaden órganos diana inflamados como el riñón.

MÉTODOS

Los métodos detallados se dan en el material complementario.

Sujetos y muestras de sangre y orina.

Se obtuvieron muestras de sangre de 17 individuos sanos, 12 pacientes con LES inactivo (puntuación SLEDAI<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). Además, se obtuvieron muestras de orina de 12 pacientes con LES y NL activos. Todos los sujetos habían dado su consentimiento informado sobre la base de la aprobación ética obtenida por la junta de revisión institucional y las autoridades éticas de Charité - Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 y 1/036/16). Las PBMC y las células urinarias se prepararon utilizando un gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque.

Anticuerpos y compañeros de citometría

Dependiendo de los experimentos, se tiñeron varias moléculas de superficie en células estimuladas por antígeno en diferentes combinaciones de los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 y -CD154; para discriminar células vivas y muertas se utilizó el kit LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd., Paisley, UK). Para teñir el compartimento de células intracelulares, las células se fijaron con paraformaldehído al 2 por ciento (v/v) durante 15 minutos a temperatura ambiente y se permeabilizaron con BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); los siguientes antígenos se tiñeron intracelularmente usando un protocolo estándar: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 e IL-17. Las muestras se adquirieron en citómetros BD FACSCanto II y BD LSRFortessa (BD Biosciences) en el centro de citometría de flujo Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin mediante el software BDFACSDiva (BD Biosciences). Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).

Preparación de antígenos y grupos de antígenos

Usamos los siguientes antígenos para estimular las células T CD4+ en el ensayo de la biblioteca de células T: 0.5 mg/ml de proteína recombinante humana SNRPD1 (SmD1) (Biorbyt Ltd., Cambridge, Reino Unido), 5{{9 }} ng/ml de proteína recombinante humana SNRP70 (RNP70) (Abcam Plc., Cambridge, Reino Unido), 0,5 mg/ml de proteína histona humana natural (Abcam Plc .), 0,5 mg/ml de proteína humana SS-A/Ro recombinante (amablemente proporcionada por Euroimmun AG, Lübeck, Alemania), 0,5 mg/ml de proteína humana SS-B/Larecombinant (amablemente proporcionada por Orgentec Diagnostika GmbH, Mainz, Alemania) , 1 mg/ml de SEB (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Alemania), 1 mg/ml de PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemania) y 0,5 mg/ml de proteína recombinante de transtiretina humana (ATGen, Seongnam, Corea del Sur).

Bibliotecas de células T periféricas y urinarias

The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >99 por ciento y 70 por ciento a 75 por ciento para muestras de sangre periférica y orina, respectivamente. Paralelamente, las células presentadoras de antígenos se prepararon mediante la recolección de células CD3 de PBMC después del agotamiento con microesferas CD3 antihumanas (Miltenyi Biotec GmbH) y se crioconservaron. Después de 1 a 2 semanas de cultivo, las fracciones de células T CD4+ amplificadas se distribuyeron en 96-placas de pocillos, según la cantidad de antígenos a analizar. Antes de la estimulación con los antígenos, las células se dejaron en reposo durante al menos 4 días. El día de la estimulación, las células presentadoras de antígeno se descongelaron y distribuyeron en el cultivo de células T en una proporción de al menos 1 célula presentadora de antígeno por 100 células T CD4+. Bibliotecas de células T CD4+ para control negativo (células no estimuladas) y control positivo (células estimuladas con SEB) siempre se incluyeron en los experimentos. Las células T CD4+ se estimularon con el antígeno durante 4 días y se determinó la proliferación utilizando un protocolo estándar de [3H]-timidina.

Los blastos de células T amplificados respondieron de manera diferente a los antígenos mostrados por CPM de centelleo altamente heterogéneo; por lo tanto, era necesaria una normalización del umbral de proliferación determinado como puntuación z específica del donante. La puntuación z se calculó como 5 diferencias de los percentiles 75 y 25 por encima de la mediana de CPM de microcultivos no estimulados. Las células en microcultivos estimulados con SEB sirvieron como control positivo. Cabe destacar que los microcultivos con un índice de estimulación SEB de<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">

Métodos ARTE periféricos y urinarios

Seguimos el protocolo que utiliza el CD154 MicroBead Kit (Mil-tenyi Biotec GmbH).35 Brevemente, las células se estimularon durante 7 horas con antígenos y luego se marcaron con anticuerpos anti-CD154-biotina humana y microesferas anti-biotina según a las instrucciones del fabricante. Las células marcadas se cargaron en columnas MS calibradas (Miltenyi Biotec GmbH) para enriquecer las células que expresan CD154-. El marcaje de las células con éster de N-succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (Sigma Aldrich Chemie GmbH) se realizó siguiendo un protocolo estándar.

Generación de clones unicelulares

Se generaron clones unicelulares a partir de células reactivas al antígeno, que se enriquecieron con la expresión de CD154 siguiendo el protocolo ARTE. Las células que expresan CD154- se filtraron con un filtro de preparación de 30- mm (Miltenyi Biotec GmbH) y se resuspendieron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato fría al 20 por ciento (v/v), albúmina de suero bovino al 0,5 por ciento y ácido etilendiaminotetraacético 2 mM. Las células fueron células individuales clasificadas para el fenotipo CD154+CD69+, y las células clasificadas individuales se cultivaron en pocillos individuales de 96-placas de pocillos en presencia de células alimentadoras. Los cultivos celulares se mantuvieron durante 3 a 4 días hasta que se hicieron visibles varios clones. Un día antes de la reestimulación, las células presentadoras de antígeno se descongelaron y distribuyeron en el cultivo de células T en una proporción de al menos 1 célula presentadora de antígeno por 100 células T CD4+. Las células se estimularon con 1 mg/ml de antígeno y los clones no estimulados sirvieron como control negativo.

Análisis de repertorio TCR basado en secuenciación de última generación

El ADN genómico se aisló de células T CD4+ periféricas y células urinarias utilizando el AllPrep DNA/RNA Micro Kit (Qiagen, Venlo, Países Bajos). El locus TCR-b recombinante se amplificó siguiendo el protocolo descrito anteriormente.36 Las lecturas se procesaron mediante IMSEQ,37 y los clonotipos iguales se agruparon y analizaron más.

Estadísticas

Las pruebas estadísticas se realizaron con el software GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Se aplicó el ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples. La prueba U de Mann-Whitney y la prueba de rango con signo de Wil-Coxon se utilizaron en los experimentos con conjuntos de datos independientes y dependientes, respectivamente. Después del ajuste de Bonferroni para comparaciones múltiples, se corrigió el cálculo de los valores de P críticos porque se basa en el número de comparaciones planificadas. valores p<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">

EXPRESIONES DE GRATITUD

Agradecemos a Toralf Kaiser y Jenny Kirsch (Flow Cytometry and CellSorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) por su ayuda con la citometría de flujo y la clasificación celular. El apoyo para estos estudios fue proporcionado por subvenciones de DeutscheForschungsgemeinschaft dentro de Sonderforschungsbereich 650 toGR y por subvenciones de Deutsche Gesellschaft für Nephrologie and Clinical Scientist Program of Charité – Universitätsmedizin Berlin andBerlin Institute of Health to PE.