Los oligosacáridos mejoran la lesión renal aguda al aliviar el grupo de diferenciación 44-respuestas inmunitarias mediadas en las células tubulares renales

Abstracto:Lesión renal aguda (IRA)es un episodio repentino dedaño renalque ocurre comúnmente en pacientes ingresados ​​en hospitales. Hasta la fecha, no se ha desarrollado ningún tratamiento ideal para reducirgravedad de la IRA. oligo-fucoidan(FC) interfiere con el grupo de proteínas de diferenciación 44 (CD44) de la superficie de las células tubulares renales para prevenir la fibrosis intersticial renal; sin embargo, aún se desconoce la influencia de los oligosacáridos en la IRA. En este estudio, se seleccionaron FC, galactooligosacárido (GOS) y fructooligosacárido (FOS) para investigar la influencia de los oligosacáridos en la IRA. Se ha demostrado que los tres oligosacáridos son parcialmente absorbidos por el intestino. Descubrimos que los oligosacáridos redujeron la antigenicidad de CD44 de forma dependiente de la dosis y suprimieron la expresión inducida por hipoxia de CD44, fosfo-JNK, MCP-1, IL-1 y TNF- en NRK-52E. células tubulares renales. Mientras tanto, la transfección de ARNip de CD44 y el inhibidor de JNK SP600125 redujeron la expresión de fosfo-JNK y citoquinas inducida por hipoxia. El ligando de CD44, el hialuronano, contrarrestó la influencia de los oligosacáridos sobre CD44 y fosfo-JNK. Dos días después de la cirugía por lesión por isquemia-reperfusión, los oligosacáridos redujeron la inflamación renal, la creatina sérica, MCP-1, IL-1 y TNF- en ratones con IRA. A los 7 días postoperatorio se favoreció la recuperación renal. Estos resultados indican que FC, GOS y FOS inhiben la cascada CD44/JNK inducida por hipoxia y las citoquinas en las células tubulares renales, mejorando así la IRA y la inflamación renal en ratones con IRA. Por lo tanto,suplementación con oligosacáridoses una posible estrategia sanitaria para pacientes con IRA.

Palabras clave: lesión renal aguda; grupo de diferenciación 44; fructooligosacárido; galactooligosacárido; oligofucoidan; inflamación

1. Introducción

Lesión renal aguda(IRA) se caracteriza por una disminución repentina de la tasa de filtración glomerular y el consiguiente aumento de la creatinina sérica. Este daño es común en pacientes ingresados ​​en hospitales y unidades de cuidados intensivos, especialmente en personas mayores. La isquemia, la sepsis y la nefrotoxicidad son las principales causas de IRA que a menudo coexisten y, por tanto, complican el diagnóstico y el tratamiento [1]. La IRA grave pone a los pacientes dados de alta en riesgo de sufrir eventos adversos, como enfermedad renal crónica, eventos cardiovasculares, cáncer e infecciones [2]. La IRA tiene un rápido desarrollo y no existe ningún tratamiento eficaz disponible para evitar o reducir su gravedad. La ingesta de nutrientes específicos puede reducir la lesión tubular renal en la IRA [3]. Por lo tanto, estudiar la influencia de una nutrición específica en la IRA ayudará a mejorar la IRA y los riesgos que la acompañan que enfrentan los pacientes dados de alta.

Inflamación y reclutamiento de leucocitos.son mediadores clave de la IRA. Los riñones, especialmente las células tubulares renales, generancitocinas inflamatoriasdurante la IRA, como IL-1, IL-6, proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) y factor de necrosis tumoral (TNF-) [4,5] . Estas citocinas inducen además inflamación sistémica y reclutamiento de leucocitos. Aunque varios subconjuntos de leucocitos ejercen efectos protectores sobre la IRA (como las células T reguladoras), la mayoría de los neutrófilos, monocitos y células dendríticas son perjudiciales para la recuperación de la IRA [6]. La inflamación sistémica también es perjudicial para la recuperación de la IRA debido a los altos niveles de citocinas [7]. Entre las citocinas secretadas por el riñón, MCP-1 es la principal responsable del reclutamiento de leucocitos, responde a varias citocinas, incluidas IL-1 y TNF-[8,9], y desempeña un papel importante en la patogénesis. de diferentes lesiones renales [10]. En las células tubulares proximales humanas HK-2, la expresión de MCP-1 inducida por hipoxia está mediada por la vía de la quinasa terminal c-Jun NH2- (JNK) [11]. La vía p38 también participa en la expresión de MCP-1 inducida por albúmina en células epiteliales tubulares renales [12]. Por lo tanto, la regulación de las vías JNK y p38 puede influir en la inflamación y el reclutamiento de leucocitos en la IRA.

Los oligosacáridos son polímeros de sacáridos que contienen de 3 a 10 monosacáridos que no son digeribles y constituyen un componente importante del total de prebióticos disponibles como aditivos dietéticos [13]. La mayoría de los fructooligosacáridos (FOS) ingeridos en el cuerpo humano son completamente fermentados por la flora del colon y una pequeña fracción se recupera en la orina [14]. Los galactooligosacáridos (GOS) pueden absorberse en la sangre y posteriormente excretarse en la orina [15]. La misma situación se aplica al fucoidan en las algas marinas pardas [16]. Los oligosacáridos absorbidos pueden influir en las reacciones bioquímicas y el reconocimiento celular [17]. Nuestro estudio anterior revela que el oligofucoidan (FC) interfiere con la interacción entre la proteína CD44 de la superficie de las células tubulares renales y sus ligandos extracelulares, previniendo así la fibrosis intersticial renal [18]. La interacción entre CD44 y sus ligandos extracelulares promueve la vía de señalización JNK [19]. Por tanto, la ingesta diaria de oligosacáridos podría reducir la inflamación renal en pacientes con IRA. Sin embargo, aún se desconoce la influencia de estos polímeros en la IRA. Este estudio investigó el efecto de FC, FOS y GOS en células tubulares renales tratadas con hipoxia y ratones con AKI con lesión por isquemia-reperfusión (IRI). Los resultados mostraron que los tres oligosacáridos suprimieron las respuestas inmunitarias renales mediadas por CD44- y redujeron la gravedad posterior a la IRA. Por tanto, el uso de estos polímeros como complemento nutricional presenta una nueva estrategia de tratamiento de la IRA

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

FOS (grado promedio de polimerización < 10), GOS (grado promedio de polimerización < 8) y FC (grado promedio de polimerización < 5) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU., Cat. No. F8052), Carbosynth (Berkshire, Reino Unido, Cat. No. OG32134) y Hi-Q Marine Biotech International (Taipei, Taiwán), respectivamente. Los oligosacáridos se disolvieron en H2O bidestilada y se filtraron utilizando filtros estériles de 0,22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania). El hialuronano (HA) y todos los demás productos químicos de grado reactivo se obtuvieron de Sigma. Anticuerpos contra JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17 }}) y TNF- (sc-52746) se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE. UU.). Los anticuerpos contra p38 (9212) y fosfo-p38 (9211) se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE. UU.). Los anticuerpos contra Ly6G (ab25377) y F4/80 (ab100790) se adquirieron en Abcam (Cambridge, Reino Unido). Los anticuerpos contra HIF-1 (NB100-105) se compraron de Novus Biologicals (Centennial, CO, EE. UU.).

2.2. Cultivo celular

Las células tubulares renales proximales de rata (NRK-52E) y la línea de macrófagos de ratón RAW264.7 se adquirieron en el Instituto de Investigación y Desarrollo de la Industria Alimentaria (Hsinchu, Taiwán); cultivado en DMEM suplementado con solución antibiótica/antifúngica y suero fetal de ternera al 10%; y se mantuvo a 37 ◦C y 95% de humedad en una incubadora de CO2. Después de alcanzar el 70% de confluencia, las células se cultivaron en un medio sin suero y se incubaron durante la noche antes del experimento. Para el experimento de hipoxia, se depositaron células NRK-52E y Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, Nueva York, NY, EE. UU.) en frascos rectangulares (Mitsubishi Gas Chemical America), y toda la configuración se colocó en un recipiente de 37 ◦C incubadora durante 4 h. Luego, las células se cultivaron durante la noche en condiciones normales.

2.3. Análisis de transferencia Western

En resumen, se aplicaron 15 µg de lisado de proteína NRK-52E a cada carril y los resultados se analizaron mediante transferencia Western. Los niveles relativos de bandas de proteínas se cuantificaron a partir de cinco experimentos independientes mediante el software Quantiscan de Biosoft (Cambridge, Reino Unido).

2.4. Transfección corta de ARN de interferencia (si) de CD44

El ARNip CD44 de rata (4390771) se adquirió de Thermo Scientific (Waltham, MA, EE. UU.). Después de crecer hasta una confluencia del 70%, las células se transfectaron con ARNip utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Thermo Scientific) según las instrucciones del fabricante.

2.5. Ensayo de proliferación celular

Después de cultivar células NRK-52E hipóxicas durante 24 h, se usó el mismo medio para cultivar células RAW264.7 en una placa de 96-pocillos (2000 células/pocillo). Después de 24 h de incubación, se analizó la proliferación de células RAW264.7 utilizando un kit de ensayo SRB (Abcam, nº de catálogo ab235935) según las instrucciones del fabricante.

2.6. Pruebas de antigenicidad CD44

El CD44 de rata recombinante se obtuvo de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU., Cat. No. 6577-CD) y se empleó para producir una reacción de unión con HA según las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 20 ng/ml de CD44 de rata recombinante con diferentes concentraciones de FC, FOS o GOS durante 10 minutos para investigar la influencia de los oligosacáridos en la antigenicidad de CD44. Las mezclas se analizaron usando un kit ELISA CD44 (Abcam, Cat. No. ab213928) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.7. Animales de experimentación e IRI renal

Se adquirieron ratones macho 129S1 / SvImJ de ocho semanas de edad de Lasco Technology (Taipei, Taiwán). Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Experimentales de la Universidad Médica de Taipei (n.º de aprobación LAC-2019-0511) y formados por la Guía de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Para la inducción de IRI, se sometió a ratones (que pesaban entre 21 y 23 g) a un pinzamiento bilateral del pedículo renal durante 30 minutos mediante la realización de una incisión en el flanco [20]. Los ratones fueron anestesiados mediante anestesia inhalada con isoflurano antes de la operación. Los ratones operados de forma simulada se sometieron a una operación similar, excepto por el pinzamiento de los pedículos renales. Todos los ratones fueron alimentados con oligosacáridos mediante sonda oral desde 1 día antes hasta 2 días después de la cirugía IRI. Los ratones experimentales se dividieron en los siguientes cinco grupos con n=8 para los resultados del día 3 y del día 7: (1) grupo simulado; (2) grupo IRA; (3) grupo con IRA alimentado con FC (10 mg/kg/día); (4) grupo con IRA alimentado con FOS (10 mg/kg/día); y (5) grupo de IRA alimentado con GOS (10 mg/kg/día). Los ratones se sacrificaron 3 o 7 días después de la cirugía y se recogió y analizó sangre utilizando un analizador bioquímico y kits de ELISA. Se analizó el nivel de creatinina sérica de cada ratón para evaluar el desarrollo de IRA. La morfología del riñón se examinó mediante tinción con ácido periódico de Schiff (PAS) y tinción inmunohistoquímica (IHC) en secciones de parafina de 2 µm fijadas con formalina.

2.8. Tinción de inmunohistoquímica

Los tejidos de riñón se fijaron con paraformaldehído tamponado al 4%, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 2 µm para teñirlas con los kits HRP DAB del sistema de detección UltraVision Quanto (Thermo Scientific, Fremont, CA, EE. UU.) y se hibridaron con el anticuerpo principal siguiendo las instrucciones del fabricante. .

2.9. Tinción PAS

Las secciones de riñón se tiñeron con un kit de tinción PAS (Abcam, n.º de catálogo ab150680) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.10. Ensayo ELISA

El medio de cultivo de células NRK-52E y las muestras de suero de los ratones experimentales se recogieron y analizaron utilizando el kit ELISA MCP-1 (Abcam, Cat. No. ab208979) e IL-1 Kit ELISA (Abcam, nº de catálogo ab197742). Las muestras de suero también se analizaron utilizando un kit ELISA de TNF (R&D Systems, Cat. No. MTA00B) y un kit ELISA de lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL) (R&D Systems, Cat. No. MLCN20) por las instrucciones del fabricante.

2.11. Pruebas estadísticas

Las diferencias significativas entre los dos grupos se determinaron mediante la prueba t de Student. Las diferencias se consideraron significativas para los valores de p.<0.05

3. Resultados

3.1. Los oligosacáridos inhiben el aumento de CD44 y citocinas en células NRK-52E hipóxicas

La expresión de CD44 en células NRK-52E tratadas con FC, FOS y GOS se monitorizó por primera vez para evaluar la influencia de los oligosacáridos en las células tubulares renales. La expresión de CD44 inducida por hipoxia fue inhibida por los tres oligosacáridos en el rango de 0.05–0.5 mg/ml (Figura 1A). Por lo tanto, se utilizó la dosis de oligosacárido de 0,1 mg/ml en los siguientes experimentos celulares. En el sistema preparado, el tratamiento con hipoxia indujo notablemente la expresión del marcador de hipoxia HIF-1 en células NRK-52E, lo que indica que las células estaban en un estado de hipoxia (Figura 1B). La hipoxia reguló positivamente los niveles de JNK, MCP-1, IL-1 y TNF- fosforilados, pero no en las células tratadas con oligosacáridos (Figura 1B, C). La expresión de JNK aumentó en células hipóxicas pero no en células tratadas con FC o FOS. GOS no afectó la expresión de JNK en células hipóxicas pero suprimió la regulación positiva de JNK fosforilada. Por lo tanto, los oligosacáridos pueden inhibir la transducción de señales JNK inducida por hipoxia y la expresión de citoquinas en las células tubulares renales. Aunque FC y GOS regulaban positivamente la p38 fosforilada en células hipóxicas, la expresión de esta proteína no aumentó en las células hipóxicas. Este hallazgo indica que p38 no desempeña un papel clave en las respuestas inducidas por hipoxia en las células NRK-52E.

3.2. CD44 y JNK desempeñan un papel fundamental en el aumento de citocinas en células NRK-52E hipóxicas

La expresión de CD44, JNK fosforilada y citocinas en las células tubulares renales se vio afectada por los oligosacáridos, pero su asociación aún no se ha dilucidado. Para investigar el papel de CD44 en la transducción de señales de JNK y la expresión de citocinas en células hipóxicas, se transfectaron células NRK-52E con diferentes dosis de ARNip de CD44. El ARNip de CD44 a 50 y 100 p.m. bloqueó eficientemente la expresión de CD44 aumentada por hipoxia e inhibió significativamente el aumento inducido por hipoxia en los niveles de JNK, MCP- 1, IL-1 y TNF-fosforilados (Figura 2A). La influencia del bloqueo de CD44 en la expresión de JNK se relacionó con las dosis de ARNip. La expresión de JNK en células hipóxicas fue inducida por ARNip de CD44 a 50 pM pero inhibida a 100 pM. Ambas dosis suprimieron la regulación positiva de JNK fosforilada. El inhibidor selectivo de JNK, SP600125, redujo significativamente la expresión de MCP-1, IL-1 y TNF- en células NRK-52E hipóxicas (Figura 2B). Estos resultados sugieren que el efecto inhibidor de la transfección de ARNip de CD44 sobre las citoquinas inducidas por hipoxia se atribuye a una reducción de JNK fosforilada.

Figura 1. Efecto inhibidor de los oligosacáridos sobre la transducción de señales de CD44 en células NRK-52E hipóxicas. Las células se trataron previamente con FC, FOS o GOS durante 30 min y luego se sometieron a cultivo hipóxico. La expresión de proteínas se analizó mediante transferencia Western. (A) Efectos dependientes de la dosis de los oligosacáridos sobre la expresión de CD44. (B) Efecto de los oligosacáridos en las señales relacionadas con CD44-. La concentración de oligosacáridos se fijó en 0,1 mg/ml. Los aumentos relativos en las bandas de proteínas también se presentan en forma de gráfico de barras (C). Los resultados se expresan como media ± DE (n=4).

Figura 2. Papel de CD44 y JNK en las respuestas inflamatorias inducidas por hipoxia en células NRK-52E. La expresión de proteínas se analizó mediante transferencia Western. (A) Efecto inhibidor de la transfección de ARNip de CD44 sobre JNK fosforilada y citocinas. (B) Efecto inhibidor de SP600125 sobre las citoquinas. Las células se trataron previamente con SP600125 20 µM durante 30 minutos antes del tratamiento con hipoxia. Los aumentos relativos en las bandas de proteínas también se presentan en forma de gráfico de barras. Los resultados se expresan como media ± DE (n=4).

3.3. La secreción de citoquinas inducida por hipoxia en las células tubulares renales promueve la proliferación de macrófagos

La inflamación es un mediador de la lesión renal en la IRA. Por tanto, se examinó la influencia de los paseos de oligosaccha en los leucocitos. La Figura 3A muestra que FC, FOS y GOS no influyeron en la proliferación de células de macrófagos RAW264.7. La proliferación de células RAW264.7 fue promovida por el medio de cultivo de 24-horas para células NRK-52E hipóxicas (Figura 3B), pero no por el medio para células NRK-52E hipóxicas tratadas con oligosacáridos. El primero tenía niveles de MCP-1 e IL-1 más altos que el segundo (Figura 3C, D). Los tres oligosacáridos redujeron significativamente MCP-1 e IL-1 en el medio de cultivo de células NRK-52E hipóxicas. Por lo tanto, FC, FOS y GOS pueden reducir la expresión y secreción de citocinas en las células tubulares renales hipóxicas y, en consecuencia, disminuir la inflamación causada por las células tubulares renales lesionadas.