Abstracto

cistanche tubulosa(Schenk) Wight, una preciosa hierba homóloga a los alimentos y medicamentos de la familia Orobanchaceae, se cultiva ampliamente en el sur de Xinjiang, China. Sus principales componentes bioactivos de glucósidos feniletanoides,echinacósidoyacteosido (verbascosido), ofrecen múltiples actividades farmacológicas que incluyen antioxidación, antiinflamación y regulación inmune. Los procedimientos de procesamiento tradicionales no estandarizados a menudo causan pérdidas sustanciales de estos compuestos activos principales, lo que limita la aplicación medicinal y alimentaria funcional de estos compuestos.cistanche tubulosatrozos de decocción. Esta investigación tuvo como objetivo optimizar los parámetros de procesamiento modernos para productos frescos.cistanche tubulosarodajas para maximizar la recuperación de actósido y equinacósido, y aclarar aún más la bioactividad antioxidante, antiestrés y antiinflamatoria, así como el mecanismo molecular subyacente de las piezas de decocción procesadas de manera óptima a nivel celular.

Se realizaron experimentos de factor único para seleccionar rangos apropiados de espesor de rebanada, duración de la cocción al vapor y temperatura de secado en horno. Se adoptó una metodología de superficie de respuesta Box-Behnken de tres factores y tres niveles para establecer modelos de interacción multifactorial, utilizando el contenido de acteósidos y equinacósidos como indicadores de evaluación dual. Posteriormente, se construyó un modelo de células de macrófagos de ratón RAW264.7 estimuladas con lipopolisacáridos (LPS) para simular la peroxidación lipídica y el daño inflamatorio agudo. Se implementaron una serie de ensayos bioquímicos que incluían MTT, detección fluorescente de ROS, ELISA y Western blot para evaluar la potencia del estrés antioxidante y explorar vías de transducción de señales.

Según los resultados experimentales, los parámetros de procesamiento óptimos se determinaron como un espesor de rebanada de 0,6 cm, tratamiento con vapor durante 6 minutos y una temperatura de secado fijada en 57 grados. En esta condición de procesamiento práctica, los contenidos medidos de actósido y equinacósido alcanzaron el 7,25 % y el 31,62 % respectivamente, lo que muestra una buena coherencia con los valores de predicción teóricos. Los ensayos basados ​​en células revelaron que los procesados ​​de forma óptimacistanche tubulosaLos extractos de piezas de decocción redujeron significativamente las concentraciones de óxido nítrico (NO) y malondialdehído (MDA) en macrófagos RAW264.7 desafiados por LPS. Mientras tanto, elevó notablemente las actividades de las enzimas antioxidantes intracelulares de superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y lactato deshidrogenasa (LDH), junto con un mayor contenido de glutatión (GSH). Los niveles de secreción de mediadores proinflamatorios, incluidos TNF-, IL-1 e IL-6, también se suprimieron de manera dosis-dependiente. La detección por transferencia Western validó quecistanche tubulosaLos extractos restringieron la fosforilación excesiva de proteínas clave dentro de las cascadas de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB.

En resumen, este moderno protocolo de procesamiento optimizado mejora eficazmente los rendimientos de los glucósidos feniletanoides característicos (actósido y equinacósido) encistanche tubulosatrozos de decocción. El material herbario procesado ejerce importantes efectos antioxidantes, antiestrés y antiinflamatorios en el modelo de lesión de macrófagos inducida por LPS, cuyo mecanismo farmacológico se realiza parcialmente mediante la inhibición de la sobreactivación del eje de señalización inflamatoria p38/AKT/JNK/NF-κB. Este trabajo proporciona parámetros técnicos fiables para la fabricación industrial estandarizada y proporciona apoyo experimental para el desarrollo de alimentos funcionales antioxidantes derivados decistanche tubulosa.

Palabras clave: cistanche tubulosa; tecnología de procesamiento de piezas de decocción; actósido; equinacósido; estrés antioxidante; macrófago RAW264.7; Vía de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB

1. Introducción

cistanche tubulosa(Schenk) Wight pertenece a la familia Orobanchaceae y su tallo carnoso y escamoso es la parte medicinal oficial. Esta planta medicinal del desierto se planta principalmente en el árido sur de Xinjiang, China. En la práctica herbaria tradicional china,cistanche tubulosaSirve como una hierba tónica clásica con funciones terapéuticas documentadas de tonificar el yang del riñón, reponer la esencia de la sangre y relajar la evacuación intestinal. Clínicamente se aplica para aliviar el dolor y la debilidad de la zona lumbar y las rodillas, la infertilidad causada por la deficiencia renal y el estreñimiento inducido por la sequedad intestinal.

Los glucósidos feniletanoides representan los marcadores bioactivos más críticos decistanche tubulosa. La Farmacopea China estipula que el contenido total de echinacósido más acteósido no debe ser inferior al 1,50 % para materiales medicinales calificados. Sin embargo, la actual fabricación convencional decistanche tubulosaLas piezas de decocción todavía siguen en su mayoría antiguos flujos de trabajo manuales: remojar hierba fresca cruda, humedecer completamente, rebanar y secar de forma natural o procesar vino al vapor. Estos enfoques convencionales carecen de especificaciones técnicas cuantitativas precisas. La inestabilidad térmica de los glucósidos feniletanoide frecuentemente conduce a una degradación severa del ingrediente activo durante el procesamiento, lo que reduce la calidad del producto final y restringe la producción de alta calidad a gran escala. En la actualidad, sólo una investigación limitada combina simultáneamente la optimización de la tecnología de procesamiento con la validación de la actividad biológica; la mayoría de los estudios simplemente detectan contenidos de constituyentes químicos sin verificación funcional celular, creando brechas para la transformación industrial. Google para....

El estrés oxidativo actúa como desencadenante patológico central de múltiples enfermedades metabólicas e inflamatorias crónicas. La acumulación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) altera la homeostasis redox, provocando aún más una sobreactivación de los macrófagos y una liberación masiva de citoquinas proinflamatorias, formando un círculo vicioso entre oxidación e inflamación. Las investigaciones farmacológicas existentes han demostrado quecistancheLos glucósidos de origen feniletanoide poseen propiedades antioxidantes y antiinflamatorias. Experimentos anteriores con animales demostraron quecistanche tubulosaLos glucósidos totales mejoraron la lesión hepática en modelos de roedores con sepsis al activar la señalización antioxidante Nrf2/HO-1. Componentes de lignano-glucósidos aislados decistanche tubulosapodría mitigar las respuestas inflamatorias provocadas por LPS mediante la modulación de la vía PI3K/AKT en macrófagos RAW264.7. Sin embargo, no se ha evaluado sistemáticamente si las piezas de decocción fabricadas en condiciones de procesamiento recientemente optimizadas conservan una potente bioactividad frente al estrés antioxidante. El mecanismo regulador molecular concreto aún requiere una exploración más profunda.

El macrófago RAW264.7 estimulado por LPS es un modelo in vitro de inflamación-daño oxidativo bien aceptado, ampliamente adoptado para evaluar los efectos antioxidantes y antiinflamatorios de los productos naturales. En este estudio, primero llevamos a cabo una selección de un solo factor seguida de una optimización de la superficie de respuesta de Box-Behnken para obtener parámetros técnicos estandarizados de corte, secado al vapor y corte que apuntan a altos rendimientos de acteosidos y echinacósidos. Después de obtener productos de decocción optimizados, preparamos extractos de hierbas y adoptamos el modelo de lesión celular RAW264.7 inducido por LPS. Se utilizan múltiples plataformas experimentales, incluida la medición de marcadores bioquímicos del estrés oxidativo, la cuantificación ELISA de citocinas y el análisis de la vía de transferencia Western para aclarar la eficacia del estrés antioxidante y el mecanismo de transducción de señales. Esta investigación ofrece parámetros de proceso prácticos para la producción a escala piloto de alta calidad.cistanche tubulosapiezas de decocción con actividad estable contra el estrés antioxidante y sienta las bases experimentales para el desarrollo posterior de alimentos funcionales y productos de suplemento dietético procedentes de Xinjiangcistanche tubulosarecursos.

2. Materiales y métodos

2.1 Materias primas, reactivos e instrumentos

Frescocistanche tubulosaLos tallos carnosos se cosecharon en otoño en Hotan, Región Autónoma Uigur de Xinjiang, China. La línea celular de leucemia de monocitos y macrófagos de ratón RAW264.7 se adquirió de Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, China). Merck (Alemania) suministró acetonitrilo y metanol de calidad cromatográfica. Las sustancias estándar de referencia, echinacósido y acteósido (pureza superior o igual al 98 %), se obtuvieron del Instituto de Investigación de Tecnología de Metrología Weiye del Norte de Beijing. El dimetilsulfóxido (DMSO) se compró a Sigma‑VETEC (EE.UU.). El medio DMEM con alto contenido de glucosa y el kit de ensayo de proteína total BCA fueron productos de Thermo Fisher Scientific (EE. UU.). El suero bovino fetal (FBS) se adquirió de BI (Israel). La solución de doble anticuerpo penicilina-estreptomicina provino de HyClone (EE. UU.). Los kits de ensayo comerciales para NO, MDA, SOD, CAT y GSH se adquirieron de Beyotime Biotechnology (Shanghai, China). Kit de detección de LDH y lipopolisacárido (LPS,Escherichia coli055:B5) se obtuvieron de Solarbio (Beijing, China).

Los instrumentos de laboratorio clave incluyeron el sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) Shimadzu, el evaporador rotatorio LabTech, el pulverizador de hierbas chinas de alta velocidad de tipo oscilante, el horno termostático de secado rápido, el equipo de olla de vapor, el lector de microplacas multimodo BioTek SYNERGY-H1, la balanza analítica electrónica FA1204N, la centrífuga refrigerada CF1524R, la cabina de bioseguridad BSC-1300IIA2 y el BDS200-PH. microscopio óptico invertido.

2.2 Experimentos de procesamiento de factor único

Frescocistanche tubulosaLos tallos carnosos se cortaron en rodajas de diferente espesor (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Las rebanadas se cocinaron al vapor durante duraciones variadas (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Posteriormente, los materiales se secaron bajo diferentes gradientes de temperatura (ambiente 25 grados, 40 grados, 50 grados, 60 grados, 70 grados, 80 grados). Las muestras de piezas de decocción completamente secas se pulverizaron y se tamizaron a través de un tamiz de malla 40 para la posterior cuantificación de los componentes de HPLC.

2.3 Determinación del contenido de acteosido y echinacósido

Preparación de la solución de muestra: Pesar con precisión 1,0 g de polvo de pieza de decocción pulverizado en un matraz cónico con tapón. Agregue con precisión 100 ml de solución de metanol al 50 %. Realice un remojo de 30 minutos seguido de una extracción ultrasónica de 40 minutos. Después de enfriar, reponga la pérdida de peso del disolvente con 50 % de metanol, mezcle uniformemente y permita un asentamiento estático. El sobrenadante se filtró a través de una membrana microporosa de 0,22 µm para inyección por HPLC.

Preparación de la solución estándar de referencia: Pesar con precisión la cantidad adecuada de sustancias de referencia de acteosidos y equinacósidos, disolverlas con metanol al 50 % dentro de matraces volumétricos, preparar soluciones estándar en gradientes seriados y filtrar con una membrana filtrante de 0,22 μm.

Configuración cromatográfica: columna analítica COSMOSIL C₁₈; sistema de fase móvil: fase móvil A: solución acuosa de ácido fosfórico al 0,1 %; fase móvil B: acetonitrilo. La longitud de onda de detección se estableció en 330 nm; temperatura de la columna 35 grados; caudal 1 ml/min. Se aplicó el método de estándar externo para el cálculo cuantitativo del contenido de acteósidos y equinacósidos. Puntuación de evaluación integral=(contenido de echinacósido × 50 %) + (contenido de acteosido × 50 %). Las puntuaciones integrales sirvieron como indicador de evaluación compuesto para el desempeño de las condiciones de procesamiento.

2.4 Diseño experimental de superficie de respuesta de Box-Behnken

Basado en resultados experimentales de un solo factor, se utilizó el software Design-Expert 13.0 para implementar la disposición experimental de tres niveles y tres factores de Box-Behnken. Se seleccionaron como variables independientes el espesor de la rebanada (X₁, cm), el tiempo de tratamiento con vapor (X₂, min), y la temperatura de secado (X₃, grados). El contenido de actósido (Y₁, %) y el contenido de echinacósido (Y₂, %) fueron valores de respuesta. Se realizaron diecisiete grupos de experimentos. Se seleccionó el nivel cero para cada factor de acuerdo con el parámetro óptimo adquirido en las pruebas de un solo factor. Después de finalizar las pruebas de superficie de respuesta, se completaron el análisis de varianza del modelo, el trazado 3D de superficie de respuesta y la predicción de condición. Se llevaron a cabo experimentos de verificación prácticos después de ajustar los parámetros teóricos previstos a los valores de producción reales operables.

2.5 Cultivo celular y preparación de muestras

La materia prima de las piezas de decocción se fabricó en condiciones de procesamiento optimizadas. El polvo de hierbas se extrajo siguiendo el protocolo de preparación de muestras mencionado anteriormente, se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó al vacío para obtener un extracto sólido en polvo. La solución madre se preparó disolviendo el extracto en polvo en DMSO, diluido adicionalmente con medio DMEM completo (que contiene 10 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina) para experimentos celulares; La concentración de trabajo final de DMSO se controló por debajo del 0,1 % (v/v). Se cultivaron macrófagos RAW264.7 en medio completo DMEM en un ambiente de incubadora humidificada con 5 % de CO₂ y 37 grados.

2.6 Ensayo de citotoxicidad de MTT

Se sembraron células RAW264.7 en microplacas de 96 pocillos con una densidad celular de 8 x 10⁴ células/ml. Los grupos experimentales incluyeron un grupo de control de disolvente (medio DMSO al 0,1 %), un grupo de modelo de LPS (concentración final de LPS de 1 ug/ml) y múltiplescistanche tubulosagrupos de concentración de extractos (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Después de 2 h de preincubación con muestra de hierbas, se suplementó LPS (concentración final de 1 ug/ml) a cada grupo, excepto al grupo de control con disolvente. La incubación continuó durante 24 h. Luego se añadió reactivo MTT (5 mg/ml) y se incubó durante 4 h. Deseche el sobrenadante, agregue 150 l de DMSO por pocillo, agite a 37 grados durante 15 min. Se leyó el valor de absorbancia a una longitud de onda de 490 nm en un lector de microplacas y se calculó la tasa de supervivencia celular. Se determinó el rango de concentración de trabajo seguro para las pruebas funcionales de seguimiento.

2.7 Medición de ROS intracelular

Se inocularon macrófagos RAW264.7 en placas de seis pocillos con una densidad de 4 x 10⁵ células por pocillo. Después de la adherencia celular, se realizó el tratamiento de agrupación: grupo de control con disolvente, grupo de modelo LPS y grupos de tratamiento con extracto de CT (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Después de 2 h de pretratamiento con la muestra, se añadió 1 ug/ml de LPS, excepto en el grupo de control con disolvente, se incubó durante 24 h. El nivel de ROS intracelular se detectó mediante el método de carga de sonda fluorescente según las instrucciones del kit. La intensidad fluorescente se midió con un lector de microplacas de fluorescencia (excitación 488 nm, emisión 525 nm).

2.8 Detección de NO, MDA, SOD, CAT, LDH y GSH

Después del tratamiento celular correspondiente, se recogió el sobrenadante del cultivo celular para medir el NO adoptando la reacción de Griess. Las células adheridas se lavaron con PBS preenfriado, se lisaron en hielo y el sobrenadante del lisado celular se recogió después de la centrifugación (10 000 r/min, 4 grados, 5 min). El kit BCA determinó la concentración de proteína total de cada muestra. Los contenidos de MDA, GSH y los indicadores de actividad enzimática SOD, CAT, LDH se analizaron siguiendo estrictamente los manuales operativos del kit.

2.9 Determinación ELISA de citocinas proinflamatorias

Las células RAW264.7 recibieron un tratamiento previo de muestra y estimulación con LPS durante un total de 16 h. El sobrenadante del cultivo celular se recogió y se centrifugó. Las concentraciones de TNF-, IL-1, IL-6 en el sobrenadante se cuantificaron mediante kits ELISA comerciales.

2.10 Análisis de transferencia Western

Después de 45 minutos de LPS y la coincubación de la muestra, las células RAW264.7 se lisaron utilizando tampón de lisis RIPA suplementado con un cóctel inhibidor de proteasa-fosfatasa. El lisado celular se centrifugó a 10 000 r/min a 4 grados durante 5 min. El kit BCA cuantificó la concentración de proteína total. Las proteínas de la muestra (50 ug por carril) se desnaturalizaron en un baño metálico a 100 grados durante 5 minutos. La electroforesis en gel SDS-PAGE separó las proteínas diana, que luego se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon durante 1 h con una solución de TBST de leche desnatada al 5 %. Los anticuerpos primarios dirigidos a p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 y GAPDH se incubaron durante la noche a 4 grados. Después del lavado con TBST, los anticuerpos secundarios correspondientes se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavados repetidos, se aplicó el reactivo quimioluminiscente ultrasensible ECL para obtener imágenes de bandas de proteínas. Se implementó un análisis cuantitativo de banda en escala de grises para evaluar el nivel relativo de expresión de la proteína de fosforilación.

2.11 Análisis estadístico

Se utilizó el software GraphPad Prism 8.0.2 para cálculos estadísticos y trazado de gráficos. Los resultados de los datos cuantitativos experimentales se expresaron como media ± desviación estándar (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Para la comparación entre grupos se aplicó ANOVA unidireccional seguido de pruebas de comparación múltiple post hoc. \\(PAG<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Resultados experimentales

3.1 Resultados de los experimentos de un solo factor

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) impidió la liberación de la sustancia interna, lo que redujo el contenido final de componentes detectables. Con un tiempo de cocción al vapor fijo (10 min) y una temperatura de secado (60 grados), un grosor de rebanada de 0,4 cm logró la puntuación de evaluación integral más alta.

Resultados de la duración del tratamiento con vapor: cuando el grosor de la rebanada se fijó en 0,4 cm y la temperatura de secado se mantuvo en 60 grados, el tiempo de vaporización insuficiente no pudo destruir lo suficiente la estructura de las células vegetales, por lo que fue difícil disolver los compuestos activos. Una vez que el tiempo de vaporización superó los 6 minutos, el vapor excesivo dañó el tejido herbario e indujo la degradación del equinacósido y el actósido. Por lo tanto, se identificó preliminarmente 6 minutos como duración preferible del procesamiento de vapor.

Para los experimentos de gradiente de temperatura de secado en horno: se fijaron un grosor de rebanada de 0,4 cm y un tiempo de cocción al vapor de 6 minutos. El contenido de los componentes aumentó con el aumento de la temperatura de secado dentro de cierto rango. Una vez que la temperatura de secado superó los 60 grados, la descomposición térmica a alta temperatura provocó una disminución notable del contenido de la sustancia objetivo. Por lo tanto, se eligió 60 grados como condición de temperatura de secado óptima inicial para la optimización posterior de la superficie de respuesta.

3.2 Optimización y verificación de la superficie de respuesta de Box-Behnken

Se terminaron diecisiete grupos de corridas experimentales de Box-Behnken de acuerdo con la matriz de diseño. Los resultados del análisis de varianza indicaron que los modelos de regresión para el contenido de acteosidos y equinacósidos alcanzaron significación estadística (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >espesor de la rebanada.

A través del cálculo matemático del modelo, los parámetros de procesamiento óptimos teóricos fueron: espesor de la rebanada 0,600 cm, tiempo de tratamiento con vapor 5,685 min, temperatura de secado 57,009 grados. Teniendo en cuenta la viabilidad real de la operación industrial, los parámetros se ajustaron para un espesor de corte de 0,6 cm, un tiempo de cocción al vapor de 6 minutos y una temperatura de secado de 57 grados. Se realizaron tres experimentos de validación paralelos. En esta condición práctica, el contenido medido de actósidos fue del 7,25 %, el contenido de equinacósidos alcanzó el 31,62 %. La desviación entre los valores medidos y la predicción teórica se mantuvo por debajo del 5 %, lo que demuestra que este modelo de superficie de respuesta era confiable y aplicable para guiar la producción de piezas de decocción en el mundo real.

3.3 Detección de citotoxicidad de productos procesados ​​optimizadoscistanche tubulosaExtraer en células RAW264.7

Los resultados de citotoxicidad de MTT revelaron que la concentración del extracto en el rango de 0 a 100 ug/ml no ejerció ningún efecto tóxico obvio en los macrófagos RAW264.7 e incluso mostró una leve tendencia a promover la proliferación celular. Cuando la concentración del tratamiento aumentó a 200 ug/ml y 400 ug/ml, la tasa de supervivencia celular disminuyó significativamente en comparación con el grupo de control con disolvente, lo que muestra una citotoxicidad dependiente de la concentración. Por lo tanto, se seleccionaron gradientes de concentración de 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml, 100 ug/ml como concentraciones de trabajo seguras para ensayos celulares posteriores de estrés oxidativo y relacionados con la inflamación.

3.4 cistanche tubulosaExtraiga el nivel reducido de ROS intracelular en macrófagos estimulados por LPS

En comparación con el grupo de control con disolvente, la intensidad fluorescente de ROS intracelular del grupo del modelo LPS aumentó de manera extremadamente significativa (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration cistanche tubulosaextracto, la acumulación intracelular de ROS disminuyó de manera dosis-dependiente. Cada grupo de tratamiento farmacológico mostró una reducción estadísticamente significativa de ROS versus el grupo del modelo LPS (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Efectos sobre el contenido de NO y MDA

El NO sirve como mediador inflamatorio clásico liberado por macrófagos activados. MDA es un biomarcador de referencia que refleja el daño oxidativo por peroxidación lipídica. En comparación con el grupo de control con disolvente, la estimulación con LPS elevó notablemente el contenido de NO y MDA en las células RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of cistanche tubulosaEl tratamiento con extracto podría reducir significativamente la concentración de NO. Para el indicador MDA: el grupo de 12,5 ug/ml no produjo una mejora estadísticamente significativa; Los grupos de concentración de 25‑100 ug/mL disminuyeron notablemente el nivel de MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Impactos en los indicadores bioquímicos relacionados con los antioxidantes SOD, CAT, LDH, GSH

Después de la exposición a LPS, la actividad enzimática intracelular de SOD, CAT, LDH y el contenido de GSH disminuyeron drásticamente en relación con el grupo de control con disolvente (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed cistanche tubulosaLos extractos de piezas de decocción podrían restaurar la capacidad de defensa antioxidante endógena celular contra las agresiones oxidativas inducidas por el LPS.

3.7 Efecto inhibidor sobre la liberación de citoquinas proinflamatorias TNF-, IL-1, IL-6

Los resultados de la detección de ELISA mostraron que la estimulación con LPS promovió fuertemente la secreción de TNF‑, IL‑1, IL‑6 de los macrófagos RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of cistanche tubulosaconcentración del tratamiento del extracto, la cantidad liberada de estas tres citocinas proinflamatorias clave se suprimió progresivamente, presentando una clara correlación dosis-respuesta. Confirmó que el extracto de hierbas ejercía una potente función antiinflamatoria al restringir la secreción de citocinas proinflamatorias de los macrófagos activados.

3.8 Regulación sobre la fosforilación de la vía de señalización de p38/AKT/JNK/NF‑κB

Los datos experimentales de transferencia Western mostraron que las proporciones de p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK y p‑NF‑κB/NF‑κB fueron significativamente elevadas en el grupo del modelo LPS versus el grupo de control con solvente (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage cistanche tubulosaLa intervención del extracto disminuyó notablemente la relación p‑p38/p38 y p‑JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that cistanche tubulosaEl extracto de pieza de decocción alivió la lesión oxidativa-inflamatoria mediante la supresión de la activación de la hiperfosforilación de la red de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB.

4. Discusión

Requisitos de procesamiento tradicionales registrados en la farmacopea china paracistanche tubulosaincluyen principalmente la eliminación de impurezas, el lavado, la humectación, el corte en rodajas y el secado, sin especificar parámetros numéricos precisos para el grosor de las rodajas, la duración de la cocción al vapor y la temperatura de secado. El procesamiento manual no estándar provoca grandes fluctuaciones en la calidad de los productos comerciales en piezas de decocción. Los glucósidos feniletanoides (equinacósido y acteósido) son compuestos bioactivos térmicamente lábiles. Un tiempo o temperatura de calentamiento inadecuados provocarán la descomposición química y reducirán el valor medicinal. Nuestros experimentos de factor único revelaron que tanto la vaporización insuficiente como excesiva, así como una temperatura de secado demasiado alta, provocarían la pérdida de los componentes glicósidos objetivo. Una optimización multifactorial adicional de Box-Behnken obtuvo parámetros prácticos de fabricación: espesor de rebanada 0,6 cm, cocción al vapor 6 min, secado 57 grados. En esta condición, el contenido de acteósidos y equinacósidos alcanzó el 7,25 % y el 31,62 %, superando con creces el umbral de calidad mínima de la farmacopea. Este protocolo optimizado proporciona referencias técnicas cuantitativas factibles para el procesamiento industrial estandarizado de origen Xinjiang.cistanche tubulosa.

El estrés oxidativo y la inflamación son procesos patológicos estrechamente interconectados. El exceso de ROS induce la peroxidación lipídica y genera MDA, que activa aún más los macrófagos del sistema inmune innato. Los macrófagos activados secretan abundante NO y múltiples citoquinas proinflamatorias, que a la inversa amplifican la producción intracelular de ROS, formando un círculo vicioso oxidativo-inflamatorio autoamplificado. Las sustancias antioxidantes naturales derivadas de plantas pueden romper este circuito patológico elevando el sistema enzimático antioxidante endógeno y restringiendo la transducción de señales inflamatorias. En este estudio in vitro, procesado de manera óptimacistanche tubulosaLos extractos de piezas de decocción redujeron los niveles de ROS, NO y MDA, al tiempo que mejoraron las actividades de SOD, CAT, LDH y el contenido de GSH en macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS. Al mismo tiempo, inhibió la secreción de citoquinas proinflamatorias TNF-, IL-1, IL-6, demostrando una capacidad antiestrés oxidativa y antiinflamatoria integrada.

Las moléculas de la familia de las proteínas quinasas activadas por mitógenos, p38, JNK, junto con AKT y NF-κB, componen un centro central de transducción de señales que media las respuestas inflamatorias-oxidativas de los macrófagos. Tras la estimulación con LPS, la señal ascendente desencadena la activación de la fosforilación de p38, JNK y AKT, lo que promueve secuencialmente la fosforilación de la subunidad p65 de NF-κB y la translocación nuclear. El NF-κB activado actúa como factor de transcripción e inicia la transcripción de grandes lotes de citocinas proinflamatorias y genes relacionados con el estrés oxidativo. Nuestros resultados de Western-blot demostraron quecistanche tubulosaEl extracto podría suprimir la fosforilación de p38, JNK, AKT y NF-κB p65. Por lo tanto, inferimos que su bioactividad antioxidante y antiinflamatoria se logra, al menos parcialmente, mediante el bloqueo de la sobreactivación del eje de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB.

Existen varias limitaciones dentro de la investigación actual. Todas las verificaciones funcionales se limitan al nivel de cultivo celular in vitro. Se requieren más experimentos in vivo con modelos animales para verificar el rendimiento farmacodinámico in vivo de piezas de decocción optimizadas. Además, este estudio adoptó extracto mixto total de trozos de decocción, por lo que no podemos distinguir la contribución individual de equinacósido, acteósido y otros metabolitos secundarios menores. Las investigaciones de seguimiento pueden aislar compuestos monoméricos para comparar la potencia antioxidante frente al estrés respectivo y realizar investigaciones sobre los efectos de compatibilidad. Aun así, nuestro trabajo actual todavía ofrece parámetros prácticos de tecnología de procesamiento y evidencia mecanicista preliminar para desarrollarcistanche tubulosa-productos relacionados con el cuidado de la salud.

5. Conclusión

En conclusión, el flujo de trabajo de procesamiento modernizado optimizado por la metodología de superficie de respuesta de Box-Behnken (grosor de la rebanada de 0,6 cm, cocción al vapor de 6 minutos, temperatura de secado de 57 grados) puede aumentar significativamente el contenido de acteosidos y echinacósidos decistanche tubulosatrozos de decocción. Los extractos preparados a partir de estas rodajas de hierbas procesadas de manera óptima ejercen importantes efectos antioxidantes y antiinflamatorios contra el daño de los macrófagos RAW264.7 inducido por LPS. El mecanismo subyacente se correlaciona con la restauración del sistema de defensa antioxidante intracelular y la inhibición de la activación excesiva de la vía de señalización inflamatoria p38/AKT/JNK/NF-κB. Este estudio proporciona una base experimental sólida para la producción industrial estandarizada y la explotación de alimentos funcionales decistanche tubulosarecursos.

Referencias

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