Optimización del proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche Deserticola mediante la mejora de la tasa de supervivencia de Drosophila envenenada con acetaldehído

Abstracto:Objetivo Tomar la drosófila envenenada con acetaldehído como modelo para la detección y optimización del proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola, de modo que el polisacárido óptimo pueda mejorar significativamente la tasa de supervivencia de la drosófila envenenada con acetaldehído.

MétodosEl polvo bruto de Cistanche deserticola se extrajo sucesivamente con acetato de etilo y etanol. Se añadieron papaína, celulasa y pectinasa al polvo de Cistanche deserticola desgrasado, y los polisacáridos se extrajeron mediante el método ortogonal L9 (34 ) y la enzimólisis combinada con el método ultrasónico. El proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola ma fue evaluado con la mejor actividad farmacodinámica por el modo envenenado con acetaldehído de Drosophila.

Experimento Cistanche deserticola

ResultadosLas condiciones óptimas de extracción del polisacárido de Cistanche deserticola fueron papaína (2.00 por ciento), celulasa (2.00 por ciento), pectinasa (0.40 por ciento), proporción sólido-líquido de 1∶25, temperatura de 54,1 grados, pH de 5,2, hidrólisis enzimática de 2 horas, tiempo de extracción única de 45 minutos y tiempos de extracción de 3.

ConclusiónNo hubo diferencia significativa en el proceso de extracción de polisacáridos por métodos tradicionales. La tasa de supervivencia de la drosófila envenenada con acetaldehído se utilizó como índice para proporcionar una base teórica científica y razonable para la extracción de polisacáridos.

Palabras clave: polisacárido de Cistanche deserticola; drosófila; acetaldehído envenenado; proceso de extracción

El alcohol genera acetaldehído bajo la acción de la etanol deshidrogenasa, que es un factor de riesgo importante para el alcoholismo [1-2]. Si se puede reducir la toxicidad del acetaldehído, se pueden ralentizar una serie de reacciones adversas provocadas por el alcoholismo.

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MADrosophila es un organismo modelo genético ampliamente estudiado y altamente domesticado, con una genética fuerte, un mecanismo molecular altamente conservador, un ciclo reproductivo corto, un costo de alimentación muy bajo y otras características, que puede usarse ampliamente para la detección de drogas de alto rendimiento. [4].

La selección del proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola a menudo utiliza el método ortogonal y el análisis de superficie de respuesta, con el contenido de glucosa y la tasa de extracción como indicadores [5-7] para el cribado, sin diferencias significativas entre grupos [8-9] . Este estudio evaluó el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola usando la farmacodinámica como indicador para obtener polisacáridos vegetales con mejor actividad biológica; Usando Drosophila envenenada con acetaldehído como modelo [10-11], evalúe y optimice el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola que puede mejorar significativamente la tasa de supervivencia de Drosophila envenenada con acetaldehído.

Cistanche en polvo

1 Material y Métodos

1.1 Materiales

1.1.1 Animales de experimentación

Drosophila proviene del FlyBase Stock Center en Indiana, EE. UU. Después de la compra, las condiciones de cultivo son una temperatura de 25 grados C, una humedad del 60 % al 70 % y un ciclo de luz y oscuridad de 12-horas/12-horas.

1.1.2 Reactivos e instrumentos

Celulasa 1 × 104 U/g (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., número de lote: C11894650), papaína (8,0 × 105 U/g) y pectinasa (4,0 × 105 U/mg) de Beijing Solaybao Biotechnology Co., Ltd., con lotes de producción de 810079005 y 329C0210, respectivamente. Cistanche deserticola proviene de Gansu Huiqin Biotechnology Co., Ltd. (número de lote: 20200101), y ha sido identificado por el profesor asociado Yang Zhigang de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Lanzhou como un tallo seco, escamoso y suculento de Cistanche deserticola YC Ma, una planta de la familia Orobaceae. Limpiador ultrasónico de control numérico (Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Ltd.), centrífuga CR22G (Hitachi, Japón), liofilizador (LABCONCO, EE. UU.), espectrofotómetro ultravioleta UV-1700 (Shimadzu, Japón), balanza analítica electrónica (Sartorius Scientific Instrument Co., Ltd.), mezclador de vórtice GL-88B (Qilinbel Instrument Manufacturing Co., Ltd., ciudad de Haimen), microscopio estereoscópico Xk-3 (Phoenix Optics Co., Ltd.), SHP{ {17}} incubadora bioquímica (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.).

1.2 Pretratamiento de la hierba Cistanche deserticola [12]

Triture las hierbas medicinales de Cistanche deserticola a través de un tamiz de malla 10, desengrase tres veces con 8 veces la cantidad de acetato de etilo y 95 por ciento de etanol, cada vez durante 2 horas, y séquelas para su uso posterior.

Cistanche en polvo

1.3 Método para determinar la fracción de masa de polisacáridos de Cistanche deserticola

El método del ácido fenolsulfúrico se utilizó para determinar la fracción de masa de polisacáridos de Cistanche deserticola [12]. Dibuje una curva estándar con la concentración de glucosa en el eje x y la absorbancia en el eje y. Ecuación de regresión obtenida: Y=6.4719X más 0.006 4, R2=0.9991. El polisacárido de Cistanche deserticola mostró una buena relación lineal con la absorbancia a una concentración de masa de 1.275-12.800 mg/L. Fracción de masa de polisacárido=(C1V1/1000M1) × 100 por ciento, donde C1 es la concentración de masa de la solución de polisacárido obtenida de la ecuación de regresión, V1 es el volumen de la muestra de polisacárido liofilizado a volumen constante y M1 es la cantidad de muestra del polisacárido liofilizado.

1.4 Preparación de polisacáridos de Cistanche deserticola

Mediante hidrólisis enzimática compuesta combinada con el método de ultrasonidos [12], se añadieron 10 g de Cistanche deserticola en polvo desgrasada con la enzima correspondiente, de manera que m (material): m (agua)=1:25. El total de m (material): m (agua) se extrajo usando 10, 8 y 7 veces el solvente, y el total de m (material): m (agua) alcanzó 25 veces. Debido a la absorción de agua del material medicinal, los tres solventes de extracción fueron diferentes. Temperatura 54,1 grados C, pH 5,2, hidrólisis enzimática durante 2 horas, extracción ultrasónica 3 veces, cada extracción durante 31,5 minutos, filtrar con gasa, fusionar el filtrado, centrifugar a 5000 r/min durante 10 minutos para obtener el líquido claro superior y concentrar a 1/10 del volumen original. Vierta etanol al 95 por ciento en la solución concentrada mientras revuelve hasta que la concentración de etanol alcance el 80 por ciento. Deje reposar a temperatura ambiente durante más de 8 horas. Centrifugar, precipitar y liofilizar para obtener polisacáridos de Cistanche deserticola.

Optimización del proceso de preparación de polisacáridos 1.5 Cistanche deserticola

Con el fin de obtener un alto rendimiento y pureza de polisacáridos de Cistanche deserticola, se utilizó un método experimental ortogonal para optimizar el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola. Papaína (2.00 por ciento), celulasa (2.00 por ciento), pectinasa (0.40 por ciento), temperatura 54,1 grados C, pH 5,2, enzimólisis durante 2 h. De acuerdo con el principio de diseño experimental ortogonal L (934) en la Tabla 1, el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola se seleccionó en función de la relación de m (material) a m (agua), el tiempo de extracción y la frecuencia de extracción. El contenido de azúcar y la tasa de extracción se utilizaron como indicadores de evaluación para evaluar el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola.

Tabla 1 Factores que afectan la extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola usando enzima compuesta combinada con el método de ultrasonido

1.6 Experimentos farmacodinámicos en moscas de la fruta

La solución de polisacáridos es un medicamento preventivo y este estudio debe repetirse al menos 3 veces. Una solución de sacarosa al 5 por ciento es la solución nutritiva para las moscas de la fruta, y una solución de acetaldehído al 4 por ciento se usa para crear un modelo.

Se realizaron experimentos con machos de moscas de la fruta con 20 ratones en cada grupo. Coloque la mosca de la fruta en una botella para moscas de la fruta y agregue 150 μ. Coloque un trozo de papel de filtro de solución de polisacárido L o agua destilada en un tubo para moscas de la fruta, tápelo con algodón e incúbelo en una incubadora a 24 grados C durante 24 horas. Retire la mosca de la fruta; Transferido para transportar 150 μ Incubar durante 2 horas en un tubo para moscas de la fruta que contenga una solución de sacarosa al 5 % en papel de filtro; Retire el papel de filtro del tubo de mosca de la fruta y reemplácelo con 150 μ Continúe cultivando el nuevo papel de filtro de la solución de acetaldehído L y observe los resultados; Cuente el número de muertes de Drosophila en cada tubo una vez cada 12 horas hasta que la tasa de supervivencia del grupo de solución de sacarosa al 5 % en el grupo de modelado se acerque al 50 % y calcule la tasa de supervivencia de Drosophila en cada grupo.

Cada muestra de polisacárido se dividió en una dosificación y un grupo de dosificación. La dosificación y el grupo de dosificación recibieron {{0}}.001 por ciento de solución de polisacáridos más una solución de sacarosa al 5 por ciento más una solución de acetaldehído al 4 por ciento, mientras que el grupo de dosificación recibió una solución de polisacáridos al 0.001 por ciento más una solución de sacarosa al 5 por ciento. La toxicidad de la muestra de polisacáridos se explicó por la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta en el grupo de dosificación. Configure un grupo de solución de sacarosa al 5 por ciento, que se divide en un grupo de modelado y un grupo en blanco. El grupo de modelado recibió una solución nutritiva de sacarosa al 5 por ciento y una solución de acetaldehído al 4 por ciento, mientras que el grupo en blanco recibió una solución nutritiva de sacarosa al 5 por ciento. Al comparar las tasas de supervivencia de las moscas de la fruta tratadas con muestras de polisacáridos, se encontró que la muestra de polisacáridos mejoró la capacidad de supervivencia de las moscas de las frutas envenenadas con acetaldehído.

2 resultados

2.1 Resultados de la detección de tipos y dosis de enzimas compuestas

2.1.1 Selección de tipos de enzimas compuestas

En el pasado, la celulasa y la pectinasa [3, 5] se utilizaron en la selección del proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola, mientras que Yang Xiuyan et al. [12] creía que la papaína tenía un buen efecto rompemuros. Por lo tanto, este estudio se centró en la detección combinada de celulasa, papaína y pectinasa, y polisacáridos extraídos de acuerdo con los métodos anteriores, con el fin de evaluar qué combinación de enzimas complejas extraídas de polisacáridos de Cistanche deserticola tiene mejor contenido de azúcar y tasa de extracción. Como se muestra en la Tabla 2, cuando la enzima compleja es una combinación de celulasa, papaína y pectinasa, la tasa de extracción y el contenido de azúcar de los polisacáridos extraídos de Cistanche deserticola es el más alto, por lo que la enzima compleja compuesta por celulasa, papaína y pectinasa es seleccionado.

2.1.2 Selección de la dosis de enzima compuesta

El proceso de extracción de polisacáridos varía según el número de enzimas complejas utilizadas. Configure 5 juegos de detección de dosis de enzimas compuestas y extraiga polisacáridos de Cistanche deserticola utilizando el método mencionado anteriormente.

Como se muestra en la Tabla 3, los resultados de la detección de la dosis de enzima compuesta mostraron que la tasa de extracción y el contenido de azúcar de papaína (2.00 por ciento), celulasa (2.00 por ciento) y pectinasa ({ {5}}.40 por ciento) fueron los más altos, por lo que se usó la dosis de enzima del compuesto del grupo 2.

Tabla 2 Resultados de detección de tipos de enzimas compuestas

Tabla 3 Resultados de detección de dosis de enzima compuesta

2.1.3 Evaluación del método de extracción

Los métodos de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola no solo usan enzima compuesta combinada con ultrasonido, sino que también incluyen remojo en agua tibia, agua hirviendo y ultrasonido sin enzima compuesta [3,5-7]. Este estudio comparó la enzima compuesta combinada con ultrasonido, remojo tibio, agua hirviendo y ultrasonido sin la enzima compuesta.

Tome 10 g de Cistanche deserticola en polvo desgrasado utilizando el mismo método y agregue la cantidad óptima de enzimas compuestas mediante inmersión en agua tibia y agua hirviendo, respectivamente. No agregue enzimas compuestas a través de ultrasonido sin la adición de enzimas compuestas. Otras condiciones son las siguientes: después de la hidrólisis enzimática, la temperatura es de 54,1 grados C para el remojo tibio, y el método de ebullición del agua se coloca en un horno eléctrico para la extracción con agua hirviendo. La extracción se lleva a cabo bajo condiciones ultrasónicas sin la adición de enzimas complejas.

Los resultados experimentales mostraron que la tasa de extracción (12,91 por ciento) y el contenido de azúcar (70,81 por ciento) de polisacáridos de Cistanche deserticola sin el método de ultrasonido de enzimas compuestas fueron significativamente más altos que los del método de remojo tibio (7,26 por ciento) y el contenido de azúcar (44,79 por ciento ), así como la tasa de extracción (10,74 por ciento) y el contenido de azúcar (66,33 por ciento) del método de ebullición en agua. Esto indica que la eficiencia de extracción del método de ultrasonido sin enzima compuesta es mayor que la de los métodos de remojo en agua tibia y agua hirviendo. La tasa de extracción y el contenido de azúcar (27,79 por ciento y 99,26 por ciento, respectivamente) de los polisacáridos de Cistanche deserticola usando enzima compuesta combinada con el método de ultrasonido son más altos que aquellos sin enzima compuesta. Por lo tanto, la combinación de la enzima compuesta y el método de ultrasonido es beneficiosa para extraer polisacáridos de Cistanche deserticola.

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2.2 Resultados de la prueba ortogonal

Los resultados del experimento ortogonal para la extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola se muestran en la Tabla 4.

2.3 Resultados del análisis de la varianza

According to the factors and levels in Table 1, the orthogonal experimental results and mathematical statistics were obtained by using the combined enzyme ultrasound method according to Table 4. From the variance analysis results of the sugar content and extract rate of the polysaccharides extracted from Cistanche deserticola in Table 5 and Table 6, it can be seen that the difference in m (material): m (water), extraction time, and extraction times were not statistically significant (P>0.05). Por lo tanto, es necesario seguir analizando el proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola en función de indicadores farmacológicos.

2.4 Resultados experimentales farmacodinámicos

El uso de animales de experimentación como ratas o ratones para experimentos farmacodinámicos tiene la desventaja de los altos costos de alimentación, mientras que Drosophila tiene las ventajas de ciclos cortos y costos de alimentación muy bajos, que pueden usarse de manera efectiva para la detección de fármacos de alto rendimiento y el descubrimiento de objetivos. Por lo tanto, este estudio utiliza acetaldehído, el principal producto tóxico del metabolismo del etanol, para establecer un modelo de Drosophila que simule el alcoholismo. El proceso de extracción óptimo para mejorar la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta envenenadas por acetaldehído se seleccionó del experimento ortogonal de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola. .

Tabla 4 Resultados experimentales ortogonales de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola

Z1~Z9 corresponden a muestras obtenidas de 9 procesos ortogonales. K1, K2, K3 y R (1) son los valores calculados para el rendimiento de pasta, mientras que k1, K2, k3 y R (2) son los valores calculados para el contenido de azúcar.

Tabla 5 Análisis de varianza del contenido de azúcar en experimento ortogonal para extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola

Tabla 6 Análisis de varianza de tasa de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola en experimentos ortogonales

2.4.1 Detección de diferentes concentraciones de acetaldehído

Después de varias comparaciones experimentales, en comparación con otros grupos (2 por ciento, 3 por ciento y 5 por ciento), el grupo de acetaldehído al 4 por ciento mostró la tendencia más lenta en el crecimiento de la tasa de mortalidad a lo largo del tiempo, y después de 5 días, la tasa de mortalidad alcanzó el 100 por ciento. Por lo tanto, en este experimento de determinación de la concentración de acetaldehído, se determinó el 4 por ciento como la concentración óptima de acetaldehído.

2.4.2 Cribado de diferentes concentraciones de dosificación

Estableciendo diferentes concentraciones de polisacáridos ({{0}}.000 5 por ciento, 0.001 por ciento, {{10 }}.002 por ciento) para el extracto de polisacárido experimental, la Drosophila melanogaster en el grupo de control experimentó una muerte rápida en cada concentración de polisacárido de 0.002 por ciento, posiblemente debido a una concentración excesiva de polisacárido. Por lo tanto, la concentración de polisacáridos se redujo al 0,001 0 por ciento, y la Drosophila melanogaster del grupo de control no murió. Posteriormente, la concentración de polisacáridos se redujo al 0,000 5 por ciento, y la drosófila en el grupo de tratamiento experimentó una muerte rápida, lo que indica que la concentración del tratamiento fue insuficiente para prevenir eficazmente la toxicidad del acetaldehído. La concentración óptima de polisacáridos finalmente se determinó en 0,001 por ciento.

2.4.3 Resultados experimentales farmacodinámicos

La tasa de supervivencia de los grupos de administración de 10 polisacárido fue del 100 % , lo que indica que la toxicidad de la muestra de polisacárido de Cistanche deserticola de cada proceso fue muy baja a una concentración del 0,001 % . La diferencia en las tasas de supervivencia entre el grupo Z5 y el grupo 1 de solución de sacarosa al 5 por ciento en la Tabla 7 es la más significativa, lo que indica que los polisacáridos obtenidos en el grupo Z5 tienen la mayor capacidad para mejorar la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta causadas por el envenenamiento con acetaldehído. . El proceso de extracción correspondiente para el grupo Z5 es un tiempo ultrasónico de 45 minutos, m (material): m (agua)=1:25, y la extracción se realiza 3 veces.

Las tasas de supervivencia de las moscas de la fruta en los grupos Z1 y Z2 del Cuadro 7 son ligeramente más altas que las del grupo 1 en solución de sacarosa al 5 por ciento, lo que indica que los polisacáridos obtenidos de estos dos procesos de extracción también tienen cierta capacidad para mejorar la tasa de supervivencia de moscas de la fruta envenenadas por acetaldehído; No hubo diferencia significativa en la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta entre los grupos Z3 y Z8 y los 2 grupos tratados con solución de sacarosa al 5 por ciento; Los polisacáridos obtenidos de otros procesos de extracción no tienen la capacidad de mejorar la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta envenenadas por acetaldehído. El grupo de solución Z10 es un polisacárido extraído del agua tradicional y no tiene la capacidad de mejorar la tasa de supervivencia de las moscas de la fruta envenenadas por acetaldehído.

Tabla 7 Tasa de supervivencia de Drosophila melanogaster tratada con 10 polisacáridos y grupos de modelado

Al combinar el método de experimento ortogonal tradicional con el experimento de farmacodinámica de Drosophila melanogaster, se seleccionó el proceso de extracción óptimo del polisacárido Cistanche deserticola como papaína (2.00 por ciento), celulasa (2.00 por ciento), pectinasa (0.40 por ciento), m (material): m (agua)=1 ∶ 25, temperatura 54,1 grados C, pH 5,2, enzimólisis durante 2 h, tiempo de extracción única 45 min, tiempos de extracción 3 veces .

3 Discusión

Debido a que Drosophila es un organismo móvil, contar una vez cada 12 horas no puede determinar con precisión el momento en que la tasa de supervivencia del grupo 1 de solución de sacarosa al 5 por ciento alcanza el 50 por ciento. Solo puede estar cerca del valor y no puede ser completamente consistente. En la Tabla 7, el grupo 1 de solución de sacarosa al 5 por ciento y el grupo 2 de solución de sacarosa al 5 por ciento se completaron en dos experimentos, con tasas de supervivencia cercanas al 50 por ciento. Esto se debe a que el número de moscas de la fruta que cumplen las condiciones experimentales es limitado y es necesario dejar suficientes moscas de la fruta para el paso. Por lo tanto, los 10 compuestos de polisacáridos se dividieron en dos experimentos para completar. Al analizar el nivel de proceso ortogonal y los factores de polisacáridos, se encontró que el tiempo de extracción ultrasónica de 45 minutos juega un papel decisivo. Si el tiempo de extracción es demasiado corto, las sustancias eficaces no se extraen por completo y no serán eficaces; Si el tiempo de extracción es demasiado largo y la cadena larga de polisacáridos se rompe en exceso, pueden convertirse fácilmente en monosacáridos u oligosacáridos, pero no en polisacáridos de cadena corta, que también es ineficaz.

ginseng del desierto

Usar Drosophila envenenada con acetaldehído como modelo y mejorar la tasa de supervivencia de Drosophila envenenada con acetaldehído como indicador farmacodinámico puede mejorar significativamente la pertinencia y viabilidad del proceso de extracción de polisacáridos de la medicina tradicional china.La detección y optimización del proceso de extracción de polisacáridos de Cistanche deserticola que pueden mejorar significativamente la tasa de supervivencia de Drosophila envenenada con acetaldehído proporciona cierta importancia de referencia para la detección de procesos de extracción de polisacáridos de plantas y sienta las bases para el desarrollo y la utilización de polisacáridos de Cistanche deserticola.

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