Abstracto

cistanche tubulosaEs una preciosa hierba tónica ampliamente aplicada en la Medicina Tradicional China. Los glucósidos feniletanoides representados por el equinacósido y el acteósido son sus sustancias bioactivas principales. Esta investigación tiene como objetivo optimizar los parámetros de procesamiento modernos paracistanche tubulosapiezas de decocción para mejorar el rendimiento de equinacósido y acteósido, y explorar más a fondo su mecanismo antiestrés oxidativo y antiinflamatorio a nivel celular.

Se realizaron experimentos de un solo factor, seguidos de una optimización de la superficie de respuesta de Box-Behnken con el grosor de la rebanada, el tiempo de cocción al vapor y la temperatura de secado como factores influyentes. Se adoptó la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para detectar el contenido de dos compuestos marcadores. Se construyó el modelo de lesión de macrófagos RAW264.7 inducida por LPS para evaluar las actividades farmacológicas. Se determinaron especies reactivas de oxígeno (ROS), óxido nítrico (NO), malondialdehído (MDA), actividades de enzimas antioxidantes, incluido el contenido de SOD, CAT, LDH y glutatión (GSH). Se utilizó ELISA para evaluar el nivel de secreción de las citoquinas proinflamatorias TNF-, IL-1 e IL-6. Se realizó un ensayo de transferencia Western para analizar el estado de fosforilación de proteínas clave en la vía de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB.

Las condiciones óptimas de procesamiento fueron un espesor de rebanada de 0,6 cm, un tiempo de cocción al vapor de 6 minutos y una temperatura de secado de 57 grados. En esta condición, el contenido de acteósido alcanzó el 7,25 % y el de echinacósido alcanzó el 31,62 %. Los extractos de piezas de decocción optimizadas podrían reducir significativamente la sobreproducción de ROS, NO y MDA intracelulares en células RAW264.7 estimuladas con LPS. Mejoró las actividades de SOD, CAT, LDH y aumentó el nivel intracelular de GSH, mientras tanto inhibió notablemente la liberación de TNF-, IL-1 e IL-6. Los resultados de la transferencia Western indicaron que el extracto regulaba negativamente la relación de fosforilación de p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK y p‑NF‑κB/NF‑κB.

La tecnología optimizada de procesamiento de secado al vapor puede aumentar eficazmente la tasa de recuperación de los principales glucósidos feniletanoides decistanche tubulosa. Las piezas de decocción ejercen efectos antioxidantes y antiinflamatorios contra el daño celular desencadenado por LPS al inhibir la vía de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB. Este estudio proporciona parámetros técnicos prácticos para el procesamiento industrial estandarizado decistanche tubulosay ofrece evidencia experimental para el desarrollo de alimentos funcionales y productos nutracéuticos derivados de este recurso herbario.

Palabras clave: cistanche tubulosa; tecnología de procesamiento de piezas de decocción; actósido; equinacósido; estrés antioxidante; macrófago RAW264.7; Vía p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Introducción

cistanche tubulosa(Schenk) Wight pertenece a la familia Orobanchaceae y su parte medicinal es el tallo carnoso seco con hojas escamosas. En China, esta planta se planta principalmente en las regiones áridas del noroeste, con la mayor superficie de plantación en el sur de Xinjiang. Como conocida medicina herbaria tónica, su función es tonificar el yang del riñón, reponer la esencia y la sangre y humedecer los intestinos para aliviar el estreñimiento. Clínicamente, se utiliza para el tratamiento de la deficiencia de yang de riñón, la insuficiencia de sangre esencial, la infertilidad, el dolor y la debilidad de la cintura y las rodillas, así como la sequedad intestinal y el estreñimiento.

Los glucósidos feniletanoides, principalmente equinacósido y acteósido, son los principales componentes activos decistanche tubulosa. De acuerdo con los requisitos de la farmacopea china, el contenido total de equinacósido y acteósido en materias primas medicinales calificadas no debe ser inferior al 1,50 %, lo que sirve como indicador crítico de evaluación de la calidad. Enfoques de procesamiento tradicionales paracistanche tubulosaen su mayoría adoptan métodos de remojo-humedecimiento, corte-secado o cocción al vapor de vino. Muchos estudios se centran en mejorar el rendimiento de los componentes activos, mientras que las investigaciones que combinan la optimización de la tecnología de procesamiento con la verificación de la actividad biológica siguen siendo insuficientes.

El estrés oxidativo actúa como base patológica común para múltiples enfermedades metabólicas e inflamatorias. Las investigaciones existentes han demostrado que los glucósidos totales extraídos decistanche tubulosaPuede suprimir la respuesta inflamatoria y activar la vía Nrf2/HO-1 para aliviar la lesión hepática en animales con sepsis. Las fracciones de glucósidos de lignano de esta hierba pueden mitigar la inflamación de los macrófagos al regular la señalización de PI3K/AKT. Sin embargo, la propiedad farmacológica de las piezas de decocción procesadas modernas y su mecanismo molecular subyacente aún requieren mayor exploración.

En este estudio, se aplicó el diseño de superficie de respuesta de Box‑Behnken basándose en pruebas de factor único, tomando el grosor de la rebanada, el tiempo de cocción al vapor y la temperatura de secado como variables para optimizar el flujo de trabajo de procesamiento. Después de obtener parámetros técnicos óptimos, se estableció el modelo celular de daño oxidativo RAW264.7 inducido por LPS para evaluar el estrés antioxidante y la capacidad antiinflamatoria y analizar el mecanismo de señalización relevante. Este trabajo tiene como objetivo proporcionar parámetros de procesamiento estables y operables para la producción a escala piloto y sentar las bases experimentales para la utilización integral decistanche tubulosarecursos.

2. Materiales y métodos

2.1 Material vegetal, reactivos e instrumentos

Tallos carnosos frescos decistanche tubulosase cosecharon en otoño en Hotan, Xinjiang. Las células de leucemia de monocitos y macrófagos de ratón RAW264.7 se adquirieron de Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, China).

El acetonitrilo y el metanol de calidad HPLC se obtuvieron de la empresa Merck. Los estándares de referencia de equinacósido (mayor o igual al 98 %) y actósido (mayor o igual al 98 %) fueron suministrados por el Instituto de Metrología Weiye del Norte de Beijing. El dimetilsulfóxido (DMSO) se adquirió de Sigma-Aldrich. El medio DMEM con alto contenido de glucosa, el suero bovino fetal (FBS), la solución de doble anticuerpo de penicilina-estreptomicina, el kit de cuantificación de proteínas BCA, los kits de ensayo para NO, MDA, SOD, CAT, GSH y LDH, el lipopolisacárido (LPS), el reactivo MTT y los kits ELISA para citoquinas inflamatorias fueron todos productos comerciales.

Los instrumentos experimentales incluyeron un cromatógrafo líquido de alto rendimiento Shimadzu, un evaporador rotatorio, un pulverizador de hierbas chinas, un horno termostático de secado rápido, un cocedor de vapor, un lector de microplacas de longitud de onda completa, una balanza analítica electrónica, una centrífuga refrigerada, una cabina de bioseguridad y un microscopio óptico invertido.

2.2 Experimento de procesamiento de un solo factor

Frescocistanche tubulosaLos tallos carnosos se cortaron en rodajas con un espesor de 0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm y 1,2 cm. Las rebanadas se cocieron al vapor durante 3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min y 21 min respectivamente, y se secaron en diferentes gradientes de temperatura, incluida temperatura ambiente (25 grados), 40 grados, 50 grados, 60 grados, 70 grados y 80 grados. Las muestras de piezas de decocción secas se trituraron y tamizaron a través de un tamiz de malla 40 para su posterior detección. Se adoptó una fórmula de puntuación compuesta para una evaluación integral: puntuación compuesta=contenido de equinacósido × 50 % + contenido de acteósido × 50 %.

2.3 Determinación por HPLC de actósido y equinacósido

Preparación de la solución de muestra: pesar con precisión 1,0 g de muestra de polvo, agregar 100 ml de solución de metanol al 50 %. Después de 30 minutos de remojo, se realizó extracción ultrasónica durante 40 minutos. La pérdida de peso se complementó con 50 % de metanol después del enfriamiento. El sobrenadante se filtró mediante una membrana microporosa de 0,22 µm antes de la inyección por HPLC.

Se preparó una solución estándar de referencia mixta de actósido y equinacósido con metanol al 50 % y se diluyó en concentraciones seriadas para trazar la curva estándar. Condiciones cromatográficas: columna cromatográfica COSMOSIL C₁₈; El sistema de fase móvil constaba de una solución acuosa de ácido fosfórico al 0,1 % (A) y acetonitrilo (B); la longitud de onda de detección se fijó en 330 nm; temperatura de la columna 35 grados; caudal 1 ml/min. Se utilizó el método de estándar externo para el cálculo cuantitativo de los compuestos objetivo.

2.4 Diseño experimental de superficie de respuesta de Box-Behnken

Según los resultados experimentales de un solo factor, se seleccionaron como variables independientes el grosor de la rebanada (X₁), el tiempo de cocción al vapor (X₂) y la temperatura de secado (X₃). El contenido de actósido (Y₁, %) y el contenido de echinacósido (Y₂, %) sirvieron como valores de respuesta. Se utilizó el software Design-Expert 13.0 para establecer un esquema experimental Box-Behnken de tres factores y tres niveles con un total de 17 grupos de pruebas. El software completó el ajuste del modelo, el análisis de varianza y la predicción de parámetros. Los experimentos de verificación práctica se llevaron a cabo por triplicado después de ajustar los parámetros teóricos óptimos para adaptarse a la operación de producción real.

2.5 Cultivo celular y preparación de muestras

La muestra de pieza de decocción obtenida en condiciones de procesamiento optimizadas se preparó en extracto en polvo. El polvo se disolvió en DMSO y se diluyó adicionalmente con medio DMEM completo que contenía 10 % de FBS y 1 % de penicilina-estreptomicina para experimentos celulares. Se cultivaron células RAW264.7 en una incubadora humidificada a 37 grados con 5 % de CO₂.

2.6 Ensayo MTT para la viabilidad celular

La suspensión celular se inoculó en placas de 96 pocillos con una densidad celular de 8 x 10⁴ células/ml. Los grupos se establecieron como grupo de control de disolvente (DMSO al 0,1 %), grupo modelo de LPS (LPS de 1 ug/ml) y grupos de concentración múltiple decistanche tubulosaextracto (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Después de una preincubación de las muestras de 2 horas, se añadió LPS con una concentración final de 1 ug/ml, excepto los pocillos de control con disolvente, y se incubó durante otras 24 h. Se añadió solución de MTT (5 mg/ml) durante 4 horas de reacción. Después de eliminar el sobrenadante, se añadió DMSO para disolver los cristales de formazán. El valor de absorbancia a 490 nm se detectó mediante un lector de microplacas para calcular la viabilidad celular. Se seleccionó un rango de concentración seguro para las pruebas funcionales de seguimiento.

2.7 Medición de ROS intracelular

Se sembraron células RAW264.7 en placas de 6 pocillos con una densidad de 4 x 10⁵ células por pocillo. Después de adherirse a la pared, las células se trataron previamente con gradiente de concentración.cistanche tubulosaextracto (12,5, 25, 50, 100 ug/mL) durante 2 h, luego estimulado por 1 ug/mL de LPS durante 24 h. El nivel de ROS intracelular se detectó con un kit de reactivos de sonda fluorescente. La intensidad de la fluorescencia se registró con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm.

2.8 Detección de NO, MDA, SOD, CAT, LDH y GSH

Se recogió el sobrenadante del cultivo celular para detectar el contenido de NO mediante el método de Griess. Las células se lavaron con PBS preenfriado y se lisaron en hielo. El lisado celular se centrifugó a 10 000 rpm a 4 grados durante 5 minutos para adquirir el sobrenadante intracelular. El contenido de MDA, las actividades enzimáticas de los niveles de SOD, CAT, LDH y GSH se midieron estrictamente de acuerdo con las especificaciones del kit. Se aplicó el método BCA para la normalización de proteínas totales.

2.9 Detección ELISA de citoquinas proinflamatorias

Las células RAW264.7 se trataron con muestra y LPS durante 16 h. El sobrenadante del cultivo se recogió y se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min. Las concentraciones de secreción de TNF-, IL-1 e IL-6 se cuantificaron mediante kits de ELISA.

2.10 Análisis de transferencia Western

Después de una intervención de 45 minutos con muestras y LPS, se extrajo la proteína celular total utilizando tampón de lisis RIPA. La concentración de proteínas se cuantificó mediante el kit BCA. Se desnaturalizó una cantidad igual de muestra de proteína (50 ug para cada carril), se separó mediante electroforesis SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó con una solución TBST de leche desnatada al 5 % durante 1 h y luego se incubó con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados. Después de lavados repetidos con TBST, el anticuerpo secundario se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. Las bandas de proteínas diana se visualizaron mediante reactivo de quimioluminiscencia ECL. Se realizó un análisis de bandas en escala de grises para calcular la relación proteína fosforilación/proteína total.

2.11 Análisis estadístico

Se utilizó el software GraphPad Prism 8.0.2 para el trazado de gráficos y el análisis estadístico. Se adoptaron ANOVA unidireccional y prueba t para la comparación de datos.P < 0.05 represented statistically significant difference; P < 0.01 and P < 0.001 stood for higher significance. All experimental data were expressed as mean ± standard deviation (\(\bar{x}\pm s\)).

3. Resultados

3.1 Resultados experimentales de un solo factor

El grosor de la rebanada ejerció una influencia destacada sobre el contenido de glucósidos objetivo. Las rebanadas de 0,2 cm de espesor eran fáciles de cocer al vapor, lo que provocaba la descomposición térmica de los ingredientes activos. Las lonchas demasiado gruesas dificultaron la liberación de sustancias activas internas. Cuando el tiempo de cocción al vapor se fijó en 10 minutos y la temperatura de secado en 60 grados, 0,4 cm fue el parámetro óptimo de espesor de rebanada en el cribado de factor único.

Un tiempo de vaporización insuficiente no pudo destruir completamente la estructura de las células vegetales y condujo a un bajo rendimiento de glucósidos. Cuando el tiempo de vaporización superó los 6 minutos, se produjo la desintegración del tejido y se degradaron el equinacósido y el actósido. Con un grosor de rebanada fijo de 0,4 cm y una temperatura de secado de 60 grados, 6 minutos fue la mejor condición de tiempo de cocción al vapor.

Dentro de un cierto rango, el contenido de glucósidos de feniletanoide aumentó junto con el aumento de la temperatura de secado, pero la degradación tuvo lugar una vez que la temperatura superó los 60 grados. Con un grosor de corte de 0,4 cm y un tiempo de cocción al vapor de 6 minutos, 60 grados mostró el mejor rendimiento integral en el cribado de un solo factor.

3.2 Prueba de verificación y optimización de la superficie de respuesta

El análisis de varianza mostró que los modelos de regresión para el contenido de acteosidos y echinacósidos fueron significativos (P < 0.05, P < 0.01). The lack‑of‑fit term was non‑significant (P >0,05), lo que indica un buen grado de ajuste del modelo. El coeficiente de determinación R² fue cercano a 1, lo que demostró una alta correlación entre el valor previsto y los datos experimentales reales.

El orden de los factores que influyeron en el contenido de actósidos fue espesor de la rebanada > temperatura de secado > tiempo de cocción al vapor. Para el contenido de equinacósido, el orden fue tiempo de cocción al vapor > temperatura de secado > espesor de la rebanada.

Los parámetros teóricos óptimos calculados por software fueron un espesor de rebanada de 0,600 cm, un tiempo de vaporización de 5,685 min y una temperatura de secado de 57,009 grados. Teniendo en cuenta las condiciones prácticas de producción, los parámetros se ajustaron a un espesor de rebanada de 0,6 cm, un tiempo de cocción al vapor de 6 minutos y una temperatura de secado de 57 grados. Tres grupos de experimentos de verificación paralelos obtuvieron un contenido de actósidos de 7,25 % y un contenido de echinacósidos de 31,62 %. La desviación entre el valor práctico y el valor teórico previsto fue del 3,89 % y el 4,92 % respectivamente, lo que demostró la fiabilidad de este modelo de superficie de respuesta.

3.3 Resultado del análisis de viabilidad celular

Dentro del rango de concentración de 0 a 100 ug/ml,cistanche tubulosaEl extracto en pieza de decocción no tuvo una citotoxicidad evidente en las células RAW264.7 y mostró un ligero efecto promotor de la proliferación. Cuando la concentración alcanzó 200 ug/ml o más, la viabilidad celular disminuyó significativamente. Por lo tanto, se seleccionaron 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/ml y 100 ug/ml como concentraciones de trabajo para experimentos celulares posteriores.

3.4 Efecto sobre el nivel de ROS intracelular

En comparación con el grupo de control con disolvente, el grupo modelo LPS mostró una intensidad de fluorescencia de ROS intracelular notablemente elevada (P < 0.001), proving the successful establishment of oxidative‑stress injury model. Pretreatment of cistanche tubulosaEl extracto redujo la acumulación excesiva de ROS de forma dosis dependiente (P < 0.001 versus model group).

3.5 Regulación sobre NO, MDA e indicadores relacionados con antioxidantes

La estimulación con LPS indujo un fuerte aumento del contenido de NO y MDA en las células RAW264.7. En comparación con el grupo modelo LPS, la intervención con extracto redujo significativamente el nivel de NO con una tendencia dependiente de la dosis. . 12.5 ug/ml de extracto no produjo un efecto obvio sobre el contenido de MDA, mientras que 25-100 ug/ml de extracto disminuyó notablemente la concentración de MDA (P < 0.001).

Después del tratamiento con LPS, las actividades de SOD, CAT, LDH y el contenido de GSH intracelular disminuyeron notablemente. . 12.5 ug/mL el extracto podría mejorar la actividad de SOD sin mejorar las actividades de CAT y LDH. El extracto a una concentración de 25‑100 ug/ml elevó significativamente las actividades enzimáticas de SOD, CAT, LDH y el contenido de GSH de manera dependiente de la concentración.

3.6 Efecto inhibidor sobre la secreción de citoquinas proinflamatorias

La estimulación con LPS desencadenó la liberación masiva de TNF-, IL-1 e IL-6 en macrófagos RAW264.7.cistanche tubulosaEl pretratamiento con extracto de pieza de decocción suprimió notablemente la secreción de las tres citoquinas proinflamatorias mencionadas anteriormente (P < 0.001), presenting prominent dose‑dependent anti‑inflammatory property.

3.7 Modulación en la vía de señalización p38/AKT/JNK/NF‑κB

En comparación con el grupo de control con disolvente, la intervención con LPS aumentó la relación de fosforilación de p‑p38/p38, p‑AKT/AKT, p‑JNK/JNK y p‑NF‑κB/NF‑κB. Los grupos de extracto en dosis media y alta redujeron significativamente la proporción p‑p38/p38 y p‑JNK/JNK. Todos los grupos de concentración regularon a la baja el nivel de p‑AKT/AKT y p‑NF‑κB/NF‑κB (P < 0.05 or P < 0.001). Results illustrated that optimized cistanche tubulosaEl extracto de pieza de decocción restringió la activación de la vía de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB al inhibir la fosforilación de proteínas.

4. Discusión

Requisitos de procesamiento actuales paracistanche tubulosaregistrados en la Farmacopea China solo describen pasos operativos cualitativos sin parámetros cuantitativos precisos. Investigaciones anteriores indicaron que diferentes métodos de procesamiento causarían grandes diferencias en la composición química y la actividad farmacológica entre el crudo y el procesado.cistanche tubulosamuestras. Los productos procesados ​​muestran un mejor desempeño antioxidante e inmunorregulador en comparación con las materias primas.

En esta investigación, el moderno procesamiento de secado con vapor optimizado mediante la metodología de superficie de respuesta obtuvo un rendimiento mucho mayor de equinacósido y acteósido que muchas técnicas de procesamiento tradicionales. Sugiere que un control preciso sobre el grosor de las lonchas, la duración de la cocción al vapor y la temperatura de secado puede retener y mejorar eficazmente el contenido de feniletanoide-glucósido decistanche tubulosa.

El estrés oxidativo y la inflamación son procesos patológicos estrechamente relacionados. El exceso de ROS da lugar a peroxidación lipídica y acumulación de MDA; mientras tanto activa cascadas inflamatorias posteriores y promueve la generación de NO y múltiples citocinas proinflamatorias. Los mediadores inflamatorios aceleran aún más la producción de ROS y forman un círculo patológico vicioso. Nuestros resultados experimentales celulares demostraron que optimizadoscistanche tubulosaEl extracto de pieza de decocción podría eliminar las ROS redundantes, reducir los marcadores de daño oxidativo NO y MDA, restaurar la actividad del sistema enzimático antioxidante representado por SOD, CAT, LDH y reponer el GSH intracelular, así como inhibir la liberación de citoquinas proinflamatorias con una relación dosis-efecto obvia.

p38, JNK que pertenece a la familia MAPK y el eje AKT-NF-κB son centros centrales de transducción de señales que median la respuesta oxidativa-inflamatoria de los macrófagos. La estimulación con LPS promueve la fosforilación de p38, JNK y AKT, activa aún más NF-κB e induce la transcripción de numerosos genes proinflamatorios. Los datos de transferencia Western revelaron quecistanche tubulosaEl extracto de pieza de decocción bloqueó la activación de la fosforilación de p38, JNK, AKT y NF-κB. Se infiere que el alto contenido de equinacósido y acteósido provenientes del procesamiento optimizado contribuyen conjuntamente a suprimir la cascada de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB, para aliviar el estrés oxidativo y la lesión inflamatoria causados ​​por LPS en macrófagos RAW264.7.

Todavía existen limitaciones en este estudio. Todas las evaluaciones farmacológicas se completaron en un modelo celular in vitro. Se requieren más experimentos a nivel animal para verificar la eficacia in vivo y las características metabólicas de los productos procesados.cistanche tubulosatrozos de decocción.

En conclusión, este estudio estableció una tecnología de procesamiento moderna cuantificable y escalable paracistanche tubulosatrozos de decocción. Bajo los parámetros de procesamiento de espesor de rebanada de 0,6 cm, tiempo de cocción al vapor de 6 minutos y temperatura de secado de 57 grados, el contenido de glucósidos feniletanoides principales mejora considerablemente. Las piezas de decocción procesadas pueden aliviar el estrés oxidativo y el daño inflamatorio en macrófagos RAW264.7 estimulados por LPS al inhibir la vía de señalización p38/AKT/JNK/NF-κB. Esta investigación proporciona una referencia técnica práctica para la producción industrializada y ofrece una base experimental para desarrollar alimentos funcionales y suplementos dietéticos de origen Xinjiang.cistanche tubulosa.

Expresiones de gratitud

Este trabajo contó con el apoyo del Proyecto de cultivo de la capacidad de innovación de la columna vertebral de ciencia y tecnología juvenil de la Academia de Ciencias Agrícolas de Xinjiang (xjnkq‑2022022) y el "Programa Doctor Tianchi" de Xinjiang (2021).

Referencias

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