La codificación de frecuencia optogenética de las oscilaciones theta del hipocampo disocia la recuperación de la memoria de trabajo de los códigos espaciotemporales del hipocampo, parte 2

Combinando estimulación optogenética de EM e imágenes de calcio en el hipocampo

Para estudiar los efectos de las manipulaciones theta en los códigos espaciales y temporales del hipocampo, combinamos la estimulación optogenética de la EM con imágenes de calcio en CA1. Este paradigma experimental plantea dos cuestiones potencialmente importantes: los implantes de lentes GRIN implican daño tisular que podría alterar el estado fisiológico de las oscilaciones theta, y el espectro de longitud de onda del LED de excitación utilizado para excitar GCaMP6f podría superponerse potencialmente con el de la opsina ubicada en las fibras terminales de las fibras MS GABAérgicas en el hipocampo.

El hipocampo es una estructura muy importante en el cerebro. Es el principal responsable de almacenar y procesar la información de la memoria. Como todos sabemos, la memoria es una parte importante de las actividades intelectuales humanas y una forma importante para que nos comuniquemos e interactuemos con el entorno que nos rodea. Por tanto, la función del hipocampo es crucial para nuestras vidas.

El espacio del hipocampo es una forma de describir cómo se procesa la información espacial en nuestro cerebro. Se refiere al área activa de un grupo de neuronas de nuestro cerebro que procesa información espacial. Esta zona se llama zona parahipocampal y está estrechamente relacionada con el caballito de mar. Las investigaciones muestran que el área cercana al hipocampo procesa información relacionada con el espacio y la memoria y es una parte clave de nuestro proceso de memoria.

Específicamente, el procesamiento de información espacial por parte del hipocampo incluye principalmente dos aspectos. El primer aspecto es nuestro sentido de dirección y capacidad para navegar. Cuando caminamos, el hipocampo registra nuestros pasos y posición, manteniendo nuestra orientación en el espacio. Si nuestro hipocampo está dañado puede provocar problemas como desorientación o no poder encontrar el camino a casa.

Otro aspecto es la capacidad de memoria. Las personas utilizan la información espacial proporcionada por el hipocampo para ayudarse a recordar. Si experimentamos algo en un lugar determinado, el hipocampo almacenará esta información y podemos aprender sobre estas experiencias o personas a través del recuerdo.

Constantemente fortalecemos nuestras capacidades de memoria a través del aprendizaje, y el hipocampo juega un papel crucial en este proceso. Debido a la importancia del hipocampo, debemos prestar atención a su salud y protegerlo mediante algunos métodos. El sudoku, correr, aprender nuevas habilidades, etc. pueden mejorar nuestra memoria y proteger la salud de nuestro hipocampo.

Por tanto, la dieta, el ejercicio y mantener un buen sueño pueden ayudarnos a proteger nuestro hipocampo y mejorar nuestra capacidad de memoria. Cuando tenemos una mente clara y una memoria fuerte, podemos comprender mejor el mundo y crear una vida mejor. Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria, porque Cistanche deserticola también puede regular el equilibrio de los neurotransmisores, como aumentar los niveles de acetilcolina y factores de crecimiento. Estas sustancias son muy importantes para la memoria y el aprendizaje. Además, la carne también puede mejorar el flujo sanguíneo y promover el suministro de oxígeno, lo que puede garantizar que el cerebro reciba suficientes nutrientes y energía, mejorando así la vitalidad y la resistencia del cerebro.

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Para verificar si los implantes de lentes GRIN alteraron la fisiología de theta, primero implantamos a ratones una lente GRIN en el hipocampo derecho y dos electrodos en los hipocampos izquierdo y derecho, y encontramos señales theta comparables en ambos hemisferios (Fig. 3a). Comparamos las oscilaciones theta durante la exploración de campo abierto en ratones con una lente GRIN y un electrodo LFP adjunto, con ratones con electrodos solo, y no encontramos diferencias significativas entre ambos grupos (Fig. 3b). No encontramos ninguna diferencia significativa entre la potencia theta relativa en ratones a los que se les implantó una lente GRIN y un electrodo LFP (0.14 ± 0.007) versus un electrodo solo ( 0,154 ± 0,008; prueba t, t54=1.060, p=0.29).

Aunque informes anteriores han descrito que es posible combinar la estimulación optogenética de ChrimsonR en cuerpos celulares con imágenes de neuronas internas GCaMP en las proximidades de las terminales con una interferencia mínima53, a continuación monitoreamos cualquier activación potencial de opsina de las terminales de MS en el hipocampo mediante el registro de CA1- LFP mientras emite luz de excitación con nuestro miniscopio a través de una lente GRIN. Después de calibrar la potencia de salida de luz del miniscopio (Fig. 3c), no encontramos ningún efecto de la luz de excitación azul del miniscopio sobre la potencia theta endógena (1ANOVA, F(4,295)= 0.7729, p=0.5435 ; Fig. 3d).Dado que se ha informado que la luz de excitación del miniscopio puede inducir una ligera despolarización de los terminales transfectados con ChrimsonR53, lo que podría dificultar una mayor despolarización inducida por optogenética, a continuación aplicamos estimulaciones MSoptogenéticas mientras se obtenían imágenes con ~0.3mW /mm2 de potencia del LED del miniscopio y fueron capaces de interrumpir o estimular significativamente theta usando estimulación codificada o de 8 Hz respectivamente (prueba de Friedman χ2=6.000,p=0.0278; Fig. 3e). .

La alteración de los ritmos theta modula una pequeña porción de las células CA1

Luego realizamos estimulaciones optogenéticas fásicas (5 s ON, 5 s OFF) de MS mientras registramos células piramidales CA1 mientras los ratones exploraban libremente un campo abierto (Fig. 4a). Descubrimos que una parte de las células registradas se excitaron constantemente en estas condiciones, mientras que otras se inhibieron (Fig. 4b; ver Métodos). La actividad de las células piramidales durante las estimulaciones fue en general menor en comparación con el valor inicial, tanto para la estimulación codificada durante la carrera (correlación de Pearson, R2=0.567, p menor o igual a 0.0 0{{20}}1) y descanso (R2=0.521, p Menor o igual a 0.0001), así como para estimulación de 8 Hz (R{{ 14}}.6, p Menor o igual a 0,0001 para períodos de descanso; R2=0.632, p Menor o igual a 0,0001 para períodos de ejecución; n=1849 celdas, N=5 ratones; Fig. 4c). En general, ~ 6, 42 ± 0, 52% del total de células fueron moduladas significativamente por estimulaciones optogenéticas codificadas (Fig. 4d). Entre esas células moduladas, 50,56 ± 6,38% fueron inhibidas mientras que 49,43 ± 6,38% fueron excitadas (n=1849 células, N=5ratones; Fig. 4e).

A continuación, analizamos los efectos de la estimulación optogenética en la sintonización espacial de las neuronas del hipocampo mientras los ratones exploraban libremente el campo abierto. Con este fin, calculamos mapas de tasa de actividad utilizando épocas dentro o fuera de los períodos de estimulación (para la condición inicial, incluimos épocas que siguieron el mismo patrón de 5 s ON, 5 s OFF utilizado para la estimulación real; Fig. 4f). Luego se calculó la estabilidad como la correlación entre los mapas de tasas para las épocas de referencia y de estimulación. A pesar de los cambios antes mencionados en la actividad general, los mapas de frecuencia no mostraron cambios en la estabilidad espacial para estimulaciones codificadas o de 8 Hz (Kruskal-Wallis H 3=3. 5, p=0. 1773; Fig. 4g).

La estimulación optogenética de la EM altera el comportamiento pero no los códigos espaciotemporales

Para evaluar los efectos de la alteración theta en los códigos temporales y espaciales, monitoreamos la actividad de la neurona piramidal CA1 en la pista lineal de tono 3- (Fig. 5a). Aquí, aprovechamos una de las principales ventajas de las imágenes de calcio, que es la capacidad de registrar células registradas durante varios días mientras se realizan estimulaciones codificadas o de 8 Hz en días seleccionados (Figs. 5b, c, panel inferior). Centramos nuestro análisis en pares de días con la misma cantidad de tiempo (48 h) entre pruebas (Fig. 5c, panel superior). Para cada condición, evaluamos la porción de células totales que codifican significativamente una o varias variables y no encontramos ningún efecto de 8 Hz o estimulación codificada en la codificación espacial y temporal (RM-ANOVA; F2=0.807, p {{11 }}.453 para el efecto principal de las estimulaciones; F6=1.283, p=0.285 para la interacción entre la estimulación y la variable codificada, n=5 ratones; Fig. 5d).

Si bien la porción de células no cambió bajo las condiciones de estimulación, evaluamos el efecto de la estimulación con MS en la estabilidad de las curvas de sintonización de las células moduladas en lugar, tiempo y distancia. Con este fin, rastreamos las neuronas a lo largo de los días (Fig. 5c; ver Métodos) y calculamos la estabilidad de los campos de lugar y tiempo como la correlación por pares entre los campos a lo largo de 48 h. Debido a que se sabe que CA1 muestra una reasignación prominente a lo largo de los días, también utilizamos un par de días sin estimulación para calcular una puntuación de estabilidad inicial que se utilizará como referencia (Fig. 5e-g). No encontramos cambios en la estabilidad durante la estimulación con MS para células moduladas por lugar (1ANOVA, F2=1.907, p=0.1511; n=205 pares de células agrupadas de N=5 ratones independientes; Fig. 5h), células moduladas en el tiempo (1ANOVA, F2=2.201, p=0.113; n=227 pares de células agrupadas de N=5independientes ratones; Fig. 5i), y células con distancia modulada (1ANOVA,F2=0.6962, p=0.5024; n=64 pares de células agrupadas a partir de N=5 independientes ratones; Fig. 5j). También ampliamos el mismo análisis a las neuronas conjuntivas (es decir, neuronas que pueden codificar más de una variable; figuras complementarias 5a-f) y no encontramos efectos de la estimulación optogenética en la estabilidad espacial conjuntiva (1ANOVA, F 2=3.731, p=0.0661;N=4 ratones independientes; Fig. complementaria 5g), temporal (1ANOVA,F2=1.993, p=0.8228; N {{47 }} ratones independientes; Fig. complementaria 5h), y celdas de distancia (1ANOVA, F2=0.469, p=0.6400; N=4 ratones independientes; Fig. complementaria 5i).

Luego evaluamos la calidad de los códigos espaciotemporales utilizando un clasificador bayesiano ingenuo para decodificar la ubicación (Fig. 6a, b), el tiempo (Fig. 6cd) y la distancia recorrida (Fig. 6e, f), utilizando muestras de arranque aleatorias (n {{3 }} muestras de arranque, n=160 celdas por muestra). Los errores decodificados fueron sistemáticamente más bajos que los sustitutos mezclados, incluso durante 8 Hz o estimulación codificada para la ubicación (2ANOVA, F5=2172, p menor o igual a 0.0001; n=50 muestras de arranque de un ratón representativo; Fig. 6a), tiempo (2ANOVA, F5=1292, p menor o igual a 0,0001; n=50 muestras de arranque de un ratón representativo; Fig. 6c) y distancia (2ANOVA, F5=1964, p menor o igual a 0,0001; n=50 muestras de arranque de un ratón representativo; Fig. 6e), lo que indica que los códigos espaciotemporales se conservaron durante la estimulación. Para estimar la importancia interindividual de los códigos espaciotemporales, se puntuó el error de decodificación con wez utilizando los resultados reales y aleatorios (ver Métodos) para un día determinado, para cada ratón (Fig. 6b, d, f). El control optogenético de MS no alterar significativamente la codificación de la ubicación (1ANOVA, F2,11=2.2332, p=0.1432; N=5 ratones; tamaño del efecto η2=0.29; Fig. 6b), tiempo (1ANOVA, F2,11=0.4561, p=0.6452; N=5ratones; tamaño del efecto η2=0.07; Fig. 6d), o distancia ( 1ANOVA,F2,11=0.6102, p=0.5606; N=5 ratones; tamaño del efecto η2=0.09; Fig. 6f).

En el paradigma conductual utilizado para analizar la modulación temporal de la actividad neuronal, se programa el agua de los ratones y se los entrena para recolectar recompensas. Con base en esta suposición, cuantificamos el número de devoluciones a un sitio de recompensa vacío como errores y calculamos el porcentaje de pruebas correctas respecto del total de pruebas como un indicador del rendimiento (Fig. 6g). En estas condiciones, encontramos un efecto significativo de la estimulación optogenética sobre el rendimiento a lo largo de los días (prueba de Friedman χ2=6.000, p=0.0278) y, en particular, una diferencia significativa en el rendimiento durante la línea de base. (78,70 ± 2,45%) y estimulación revuelta (44,44 ± 5,56%; comparaciones múltiples, p=0.0429;N=3 ratones; Fig. 6h). En este análisis sólo se incluyeron ratones con un mínimo de 12 series. Debido a las limitaciones de esta tarea (baja carga cognitiva y un bajo número de ratones evaluados), a continuación nos propusimos evaluar el efecto de la estimulación optogenética de la EM en tareas de memoria estandarizadas.

La alteración de las señales theta perjudica el reconocimiento espacial y la recuperación de la memoria de trabajo.

Para probar el papel de las señales theta en la memoria espacial, utilizamos un grupo dedicado de ratones a los que se les inyectó ChrimsonR y se les implantó una fibra óptica en la EM (Fig. 7a, panel izquierdo). Los ratones fueron sometidos a una tarea de reconocimiento de objetos novedosos (NPOR) (Fig. 7a, panel derecho). Para evaluar el papel de las oscilaciones theta en la codificación y recuperación de la memoria, Fig. 7|Las estimulaciones optogenéticas de la EM interrumpen el mantenimiento y la recuperación, pero no la codificación de la memoria episódica y de trabajo. a A los ratones se les implantaron fibras ópticas en la EM después de transfectar ChrimsonR (arriba). Luego fueron sometidos a la nueva tarea de reconocimiento del lugar del objeto (abajo, ver Métodos). b En esta tarea, tanto las estimulaciones codificadas (rojas) como las de 8 Hz (azul) durante la recuperación, así como las estimulaciones de 8 Hz (verde) pero no codificadas (amarillas) durante la codificación alteraron el rendimiento de la memoria (2ANOVA, F4, 31=3. 283 para el efecto principal del tratamiento, p=0.0097; tamaño del efecto para el efecto principal del grupo, η2p=0.306; N=12 ratones). C

Para examinar más a fondo el efecto de la estimulación de la EM en la codificación, el mantenimiento y la recuperación de la memoria, se entrenó a ratones en una tarea de no coincidencia retardada con la muestra (DNMTS) en un laberinto en T automatizado. d Se entrenaron ratones transfectados con ChrimsonR (rojo) o YFP (negro) (en ausencia de estimulación) para elegir el brazo correcto y no coincidente hasta que el desempeño superó un criterio de 0.8 porciones de elecciones correctas por día, para al menos dos días consecutivos (banda verde; RM-ANOVA, F8=8.738,p menor o igual a 0.0001 para el efecto principal de los días de entrenamiento; pruebas de comparación múltiples de Tukey por pares entre grupos, p=0.420; N=17 ratones). e – g Rendimiento durante la estimulación en diferentes fases de la tarea para ratones inyectados con controles ChrimonR (arriba) o YFP (abajo). El sombreado rojo indica las regiones estimuladas del laberinto. e Rendimiento promedio diario al realizar estimulaciones de MS solo durante la codificación (RMANOVA, F11=2.197, p=0.547; N=17 ratones). f Rendimiento diario promedio al realizar estimulaciones MS durante el período de retraso de 10 s únicamente (RM-ANOVA, F11=3.483,p=0.0495; tamaño del efecto para el efecto principal del tratamiento, η2p {{ 25}}.109; N=17 ratones).g Rendimiento diario promedio al realizar estimulaciones MS durante la recuperación solamente (RM-ANOVA, F11=3.265, p=0.050; N { {33}} ratones).

Todos los diagramas de barras y de líneas representan la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes. Artículo https://doi.org/10.1038/s41467-023-35825-5Nature Communications|(2023) 14:410 10realizó estimulaciones optogenéticas específicamente durante las fases de muestra y prueba y calculó el índice de reconocimiento (RI; ver Métodos). Al estimular durante la recuperación, el rendimiento de la memoria se redujo significativamente tanto para los ratones codificados (0.472 ± 0.048 RI, n {{10}} ratones) como para 8 Estimulaciones Hz (0.435 ± {{40}}.057 RI, n=6 grupos de ratones), en comparación con los controles YFP que mostraron un aumento significativo en la exploración de objetos durante las pruebas (0,61 ± 0,018 RI; 2ANOVA, F4,31=3.283 para el efecto principal del tratamiento, p=0.0097; tamaño del efecto para el efecto principal del grupo, η2p=0.306; N {{30 }} ratones; Fig. 7b). Por otro lado, las estimulaciones codificadas durante la codificación no afectaron la memoria en el momento de la prueba (0,60 ± 0,034 RI, p=0.0157, n=6 ratones), pero la estimulación de 8 Hz durante la codificación redujo el rendimiento de la memoria a niveles aleatorios. (0,39 ± 0,074 RI, p=0.8740, n=6 ratones).

Para examinar el efecto del control optogenético de la EM en fases específicas de la función de la memoria de trabajo (codificación, mantenimiento y recuperación), se transfectó a ratones con ChrimsonR y se les implantó fibra óptica en la EM y se los entrenó en una tarea retardada de no coincidencia con la muestra (DNMTS). . En la fase de muestra, los ratones fueron obligados a correr hacia un brazo designado al azar para recoger una recompensa. Después de un retraso (10 s), podían correr en el brazo opuesto (elección correcta) para recibir otra recompensa o correr en el mismo brazo sin recompensa (brazo incorrecto; Fig. 7c). La ventaja de esta tarea es permitir pruebas repetitivas, aislamiento específico de las fases de la tarea (entrenamiento, retraso, pruebas) y controles dentro del sujeto. Los ratones fueron entrenados en esta tarea sin estimulación hasta que se alcanzó un criterio de desempeño de 0.8 (una parte de las pruebas correctas) durante al menos dos días. Tanto los ratones de control ChrimsonR como YFP mostraron una mejora significativa con el tiempo (RM-ANOVA, F8=8.738,p Menor o igual a 0.00{{21} }1 para el efecto principal de los días de entrenamiento). Es importante destacar que no encontramos diferencias en la tasa de aprendizaje entre los dos grupos (Tukey por pares;p=0.420; Fig. 7d). Una vez que los ratones aprendieron la regla asociada con la tarea DNMTS, evaluamos el rendimiento mientras entregaban datos codificados (0.792 ± 0.045) u 8 Hz (0. 850 ± 0.036) estimulación optogenética solo en la fase de codificación (elección forzada), y no observó ninguna diferencia en el rendimiento en comparación con el valor inicial (0.825 ± 0.030, RMANOVA, F11=2.197, p=0.547, N=17; Fig. 7e). Cuando se estimularon solo durante el período de retraso, solo las estimulaciones codificadas disminuyeron significativamente el rendimiento de la memoria (0,733 ± 0,057) en comparación con el valor inicial (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3.483, p=0.0495; tamaño del efecto para el efecto principal del tratamiento, η2p=0.109; Fig. 7f). Por el contrario, cuando se estimularon durante la recuperación, los ratones estimulados con 8 Hz mostraron un rendimiento de memoria significativamente reducido (0,675 ± 0,049) en comparación con el valor inicial (0,825 ± 0,030, RM-ANOVA, F11=3.265, p=0. 050; figura 7g). Por el contrario, los ratones de control YFP no se vieron afectados por estimulaciones durante la codificación (RM-ANOVA, F2=0.1314, p=0.8781), el período de retraso (RMANOVA, F2=0.2020, p=0.8197), o recuperación (RM-ANOVA, F2=0.0454,p=0.9557; tamaño del efecto para el efecto principal del tratamiento, η2p=0 .196) de la memoria de trabajo.

El control optogenético de las neuronas de la EM no altera la locomoción

Es importante destacar que se informó anteriormente que las oscilaciones theta del ritmo podrían disminuir la velocidad locomotora y su variabilidad10, lo que podría explicar al menos en parte los efectos de las estimulaciones optogenéticas en la memoria de trabajo y episódica. Para evaluar exhaustivamente la especificidad de la estimulación optogenética de la EM en la memoria, realizamos experimentos adicionales para descartar los efectos directos de las estimulaciones optogenéticas sobre la velocidad locomotora. A un subconjunto de ratones inyectados con ChrimsonR e implantados con fibra óptica en el MS, así como con electrodos LFP en CA1 se les permitió explorar un campo abierto libremente mientras se los sometía a estimulaciones optogenéticas de 5 s ON y 5 s OFF (Figura complementaria 6a). Estimulación de 8 Hz condujo a una estimulación constante de las oscilaciones del hipocampo a esa frecuencia (Figura complementaria 6b). Esas estimulaciones no se asociaron con ningún cambio aparente en el comportamiento locomotor (Figura complementaria 6c), incluida la velocidad media (prueba t de dos colas no apareada, t116=0.4140, p=0.6796; Figura complementaria. 6d) y coeficiente de variación de velocidad (CV; prueba t de dos colas no apareada, t116=0.8296,p=0.4095, n=59 épocas de estimulación; figura complementaria 6e) . De manera similar, la estimulación codificada condujo consistentemente a la abolición de las oscilaciones theta (Figura complementaria 6f), pero no hubo cambios aparentes en el comportamiento locomotor (Figura complementaria 6g), incluida la velocidad media (prueba t de dos colas no apareada, t118=0.2268 , p=0.8210; n=60 épocas de estimulación; Fig. complementaria 6h) y velocidad CV (prueba t de dos colas no apareada, t118=1.838, p {{36 }}.686; n=60 épocas de estimulación; Figura complementaria 6i).

Si bien la frecuencia theta natural y la velocidad locomotora están correlacionadas59, la dirección exacta de la causalidad entre estas variables sigue siendo poco comprendida. Para responder a esta pregunta, realizamos estimulación optogenética utilizando un paradigma de 5 s ON, 5 s OFF, y se seleccionó una frecuencia aleatoria para cada época de estimulación (Figura complementaria 6j). Estas frecuencias de estimulación cubrieron la totalidad del espectro thetaband (Figura complementaria 6k). Como era de esperar, encontramos que las frecuencias de oscilaciones theta naturales están directamente correlacionadas con la velocidad de carrera para un ratón de ejemplo (R 2=0. 1114, p Menor o igual a 0. 0001; Figura complementaria 6l). Es importante destacar que cuando la frecuencia de oscilación theta resulta del control optogenético, la correlación cae por debajo del nivel de probabilidad (R2=0.0006779, p=0.6244; Figura complementaria 6m), lo que sugiere que la locomoción dicta la frecuencia theta, pero no la opuesto. Replicamos sistemáticamente estos resultados en ratones y observamos una caída en la correlación entre la frecuencia theta y la velocidad locomotora bajo control de estimulación optogenética (prueba t pareada, t3=3.922, p=0.0295;N {{20 }} ratones; Fig. complementaria 6n). En conjunto, estos resultados respaldan que nuestra estimulación optogenética no altera el comportamiento locomotor, lo cual es muy relevante para los próximos ensayos de comportamiento.

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