La codificación de frecuencia optogenética de las oscilaciones theta del hipocampo disocia la recuperación de la memoria de trabajo de los códigos espaciotemporales del hipocampo, parte 3

La estimulación optogenética de las neuronas de la EM conduce a una sincronía theta no fisiológica

Sorprendentemente, las estimulaciones optogenéticas de 8 Hz que están asociadas con el ritmo de las oscilaciones theta condujeron a una disminución del rendimiento cuando se aplicaron durante la codificación o la recuperación de la memoria episódica en la tarea NPOR, así como la recuperación de la memoria de trabajo espacial en la tarea DNMTS. Para comprender mejor los efectos de la estimulación theta en la fisiología del hipocampo, analizamos el bloqueo de fase de la oscilación theta antes y durante las estimulaciones optogenéticas de 8 Hz (Figura complementaria 7a) y descubrimos que dicha estimulación condujo a una mayor sincronía de fase en las épocas de estimulación (Figura complementaria 7b). Además, analizamos la correlación cruzada de las oscilaciones theta a través del CA1 dorsal (~ 1 mm de distancia entre los electrodos a lo largo del eje septotemporal (Figura complementaria 7c) y descubrimos que la estimulación de los ritmos theta a 8 Hz condujo a una mayor correlación cruzada entre esos dos electrodos ( Figura complementaria 7d).

La genética es la ciencia que estudia la herencia y variación genética, y la memoria es un aspecto que preocupa mucho. Entonces, ¿qué tiene que ver la genética con la memoria? Este artículo explorará cuestiones relacionadas con la memoria desde una perspectiva genética.

En primer lugar, sabemos que los genes genéticos son la base del desarrollo físico e intelectual humano, y que estos genes sean superiores afectará la memoria de las personas. Las últimas investigaciones muestran que el coeficiente intelectual y la memoria de las personas se ven afectados por factores genéticos. Las investigaciones muestran que los genes genéticos desempeñan un papel crucial en la inteligencia y la memoria. Por lo tanto, algunas personas nacen con recuerdos más fuertes, mientras que otras necesitan trabajar duro y entrenar para mejorar su memoria.

En segundo lugar, los factores ambientales también son factores importantes en el desarrollo de la memoria. No sólo necesitamos el apoyo de los genes genéticos sino que también necesitamos mejorar nuestra memoria a través de una formación científica y buenos hábitos de vida. Por ejemplo, podemos insistir en hacer ejercicio todos los días, dormir lo suficiente, seguir principios de combinación de comidas, etc., lo que puede ayudar a mejorar nuestra función cerebral y nuestra memoria.

Por último, la gente corriente no insiste demasiado en la influencia de los factores genéticos en el desarrollo de la memoria. Debido a que los factores genéticos no son absolutos, la memoria y la inteligencia de las personas aún pueden mejorarse mejorando sus esfuerzos y entrenamiento. Siempre debemos mantener una actitud positiva y de aprendizaje continuo, y explorar y desarrollar constantemente nuestro potencial de memoria. Creo que sólo así podremos volvernos más inteligentes y tener una mayor sensación de logro. En resumen, la relación entre genética y memoria es muy estrecha, pero no debemos exagerar los factores genéticos, sino mejorar constantemente nuestra memoria e inteligencia a través de la superación personal y el entrenamiento.

Se puede ver que necesitamos mejorar nuestra memoria. Cistanche deserticola puede mejorar significativamente la memoria porque Cistanche deserticola es un material medicinal tradicional chino con muchos efectos únicos, uno de los cuales es mejorar la memoria. La eficacia de la carne picada proviene de los diversos ingredientes activos que contiene, incluidos ácidos, polisacáridos, flavonoides, etc. Estos ingredientes pueden promover la salud del cerebro de varias maneras.

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Discusión

Within the septohippocampal system, the exact causal relationships between (1) MS activity, (2) hippocampal oscillations, (3) hippocampal neuron activity, and (4) behavior, including memory, remain an active area of research. In particular, whether and how the MS supports encoding of place and time in the hippocampus, as well as its specific contribution to memory function, remain unclear. Here, we leveraged more recent techniques that allowed us to record >1000 neuronas mientras se realiza estimulación optogenética de neuronas de EM con una resolución inferior a un segundo para controlar los ritmos theta y evaluar su papel en la fisiología y la memoria del hipocampo. Es importante destacar que, utilizando una opsina excitatoria y estimulaciones codificadas o de 8 Hz, pudimos abolir o estimular de manera consistente y robusta la theta del hipocampo, respectivamente.

En comparación con la inhibición de la EM utilizando una opsina inhibidora o compuestos farmacológicos (por ejemplo, muscimol), nuestro enfoque permite una comparación dentro del sujeto de dos estados opuestos (estimulado vs theta abolido) mientras se mantienen los niveles de actividad en las células MS-PV. Combinamos una tarea de seguimiento lineal con una sola indicación que, junto con enfoques teóricos de la información, nos permitió desenredar los códigos espaciales y temporales del hipocampo. Este método alivia la necesidad de umbrales arbitrarios, lo que permite un enfoque estandarizado para el análisis de imágenes de calcio. Si bien una gran parte de las neuronas piramidales CA1 expresaron una mezcla de códigos espaciotemporales, centramos nuestros análisis en neuronas sintonizadas específicamente para el lugar, el tiempo o la distancia recorrida.

Si bien la codificación espacial se ha investigado ampliamente en CA1, los códigos temporales y de distancia han ganado recientemente más interés. Los códigos temporales28,35–37 y de distancia37 se han extraído mediante la sujeción de señales visuoespaciales o se han extraído analíticamente utilizando modelos lineales generalizados en paradigmas de realidad virtual26,27,38. Aquí, proponemos un enfoque para desenredar los códigos espaciales, temporales y de distancia utilizando un enfoque teórico de la información que, junto con nuestra tarea de alternancia de claves, permite el análisis de códigos espaciotemporales y multiplexados del mundo real en animales que se mueven libremente. Una gran cantidad de neuronas piramidales CA1 codifican información multiplexada de ubicación, distancia y tiempo, como se informó anteriormente26,27,38, además de señales de automovimiento como aceleración, velocidad y orientación60.

Descubrimos que la codificación de frecuencia y las estimulaciones optogenéticas de 8 Hz abolieron o estimularon drásticamente los ritmos theta, respectivamente, y condujeron a una disminución de la actividad general en una subpoblación de células piramidales CA1 sin causar cambios significativos en la actividad celular local, similar a informes anteriores que utilizaron inhibición farmacológica36, 46,47 o estimulación optogenética9,48 de la EM o entradas septales al hipocampo. Como se sabe que las neuronas de la EM son el principal impulsor de las oscilaciones del hipocampo, esperábamos que la estimulación de la EM se asociara con una actividad celular interrumpida en el tiempo o la distancia en condiciones de ritmos theta reducidos, pero no se produjeron cambios cuando se abolió o se estimó theta. Además, el ritmo de las oscilaciones del hipocampo a 8 Hz no provocó cambios en la calidad de los códigos espaciales como se informó anteriormente9 y no alteró los códigos temporales como se observa en nuestro paradigma de comportamiento.

Aunque se informó que las células del tiempo (pero no del lugar) podrían depender directamente de las entradas de la corteza entorrinal medial (MEC)61, la evidencia experimental reciente sugiere que las lesiones de la MEC no conducen a ninguna alteración en la fisiología de las células del tiempo del hipocampo62. En particular, una investigación más reciente encontró que la estimulación optogenética de la EM no alteraba los códigos espaciales de las células de la cuadrícula en la corteza entorrinal63, lo que sugiere además que la actividad de la EM no está directamente involucrada en los códigos espaciales dentro de la formación del hipocampo. Junto con nuestros resultados, esto indica que los códigos temporales podrían ser el resultado de cálculos dependientes de la EM dentro de la corteza entorrinal63 (1) o generarse intrínsecamente dentro del propio hipocampo (2).

Si bien los primeros estudios encontraron que la EM desempeñaba un papel esencial en el mantenimiento de las células del tiempo y el apoyo a la memoria de trabajo36, la evidencia experimental reciente muestra que la contribución exacta de las células del tiempo al rendimiento de la memoria de trabajo podría ser menor de lo que se pensaba anteriormente62. Dado que las neuronas MS-PV probablemente mantienen niveles de actividad significativos durante la estimulación optogenética de codificación de frecuencia (en contraste con los enfoques de inhibición), nuestros resultados respaldan firmemente el papel de la actividad septal sincronizada con precisión en el apoyo a la memoria de trabajo, como se planteó anteriormente. Aunque observamos una reducción del rendimiento de la memoria cuando utilizamos estimulación optogenética durante la recuperación, la estimulación durante la fase de codificación de las tareas DNMTS no se asoció con una reducción de la memoria en la tarea DNMTS. Las oscilaciones theta de ritmo a 8 Hz durante la fase de codificación o recuperación de la tarea NOPR condujeron a una recuperación de la memoria deteriorada. Nuestros análisis electrofisiológicos revelan además que dicha estimulación provocó que regiones distantes de CA1 dorsal fueran arrastradas en la misma fase, con un bloqueo de fase no fisiológico. Si bien no investigamos directamente la relación causal entre los cambios de fase y el rendimiento de la memoria, también se encontró que la sincronización de los picos y la precesión de fases estaban asociadas con la función alterada de la memoria de trabajo a pesar de dejar intacta la codificación del lugar64. Además, se ha demostrado previamente que el bloqueo de fase de las neuronas piramidales a las oscilaciones theta es un predictor del rendimiento de la memoria65.

En particular, una limitación de nuestro enfoque para establecer propiedades de sintonización temporal y de distancia es que requiere cuatro veces más muestreo que una pista lineal normal, lo que aumenta las posibilidades de fotoblanqueo al agregar condiciones de estimulación a la línea de tiempo experimental. Si bien descubrimos que los códigos espaciales no se vieron afectados por las estimulaciones optogenéticas dentro de la misma sesión, el hardware de imágenes más reciente que incluye sensores con mayor sensibilidad podría ayudar a prevenir el fotoblanqueo y permitir sesiones de grabación más largas, tomando así muestras de células temporales y distantes junto con las estimulaciones. También descubrimos que el conjunto de neuronas que codifican significativa y específicamente sólo una variable es pequeño en comparación con el número de neuronas conjuntivas, lo que hace que los requisitos de muestreo para estas neuronas altamente específicas sean mucho mayores.

Proporcionamos evidencia experimental de que la manipulación de MS no altera la velocidad locomotora y que, a la inversa, la velocidad locomotora sí dicta la frecuencia theta. Aunque los códigos de lugar y tiempo se conservaron durante nuestras estimulaciones de EM, una porción (~6%) de las células se moduló directamente y podría explicar los deterioros de la memoria observados en nuestros ensayos de comportamiento. Anteriormente se había informado que las interneuronas PV en el hipocampo eran parte de un microcircuito esencial para regular la consolidación de la memoria66,67, y nuestras manipulaciones optogenéticas podrían estar asociadas con el silenciamiento de una porción de estas células. Además, aunque no observamos cambios en bandas de frecuencia distintas de theta, no podemos excluir que la sincronización del pico de la neurona piramidal CA1 pueda alterarse drásticamente al codificar las oscilaciones theta, mientras que se demostró que la estimulación de 8 Hz no produce un aumento de la actividad del hipocampo18, lo que podría explicar los efectos diferenciales de esos patrones de estimulación en el rendimiento de la memoria de trabajo. Los deterioros de la memoria que observamos probablemente no fueron colinérgicos: en primer lugar, en nuestros experimentos inmunohistológicos, prácticamente no encontramos expresión de ChrimsonR en las neuronas ChAT de la EM. En segundo lugar, nuestras estimulaciones optogenéticas no se asociaron con cambios en las ondas del hipocampo, mientras que informes anteriores indican que la estimulación de Las neuronas ChAT se asocian con una frecuencia de ondulación reducida45,57. La transfección con ChrimsonR de neuronas MS VGLUT2 también es improbable ya que la activación de estas neuronas se asocia con un aumento directo en la actividad locomotora 68, que no observamos.

Aunque la disposición temporal precisa de los picos piramidales CA1 podría explicar, al menos parcialmente, los efectos de la estimulación de la EM en la memoria, se deben tener en cuenta mecanismos alternativos. En particular, además del hipocampo y la corteza entorrinal, las neuronas PV de la EM se proyectan a la corteza retroesplenial y podrían ser responsables de algunos de los trastornos de la memoria observados aquí.

En resumen, utilizando imágenes de calcio, optogenética y electrofisiología, encontramos que los ritmos theta pueden marcarse o abolirse mediante la estimulación de la EM. Tal estimulación perjudicó la recuperación de la memoria episódica y de trabajo. Estos efectos no fueron colinérgicos y no alteraron la actividad ondulada del hipocampo. Finalmente, mientras que una pequeña fracción de neuronas del hipocampo respondió directamente a la estimulación optogenética de la EM, las células de lugar, tiempo y distancia no fueron alteradas por las manipulaciones de las oscilaciones theta. En conjunto, estos resultados sugieren que, si bien la entrada de MS al hipocampo desempeña un papel esencial en la memoria, los códigos multiplexados en las neuronas piramidales CA1 podrían no ser el sustrato directo para tales funciones.

Métodos

animales

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad McGill y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales (protocolo 2015-7650). Un total de n=41 machos (n=20) y hembras (n=21) de 8 a 16 semanas de edad, B6;129P2 ratones PV-Cre (Jackson Laboratory, RRID: IMSR{{ 10}}JAX:017320) se utilizaron en este estudio. Se utilizaron n=5 ratones para combinar la optogenética con imágenes de calcio; Se implantaron n=3 ratones para imágenes de calcio, optogenética y controles electrofisiológicos; Se utilizaron n=4 ratones en estudios electrofisiológicos; Se transfectaron e implantaron n=29 ratones para ensayos de comportamiento. Los ratones se alojaron individualmente en un ciclo de luz/oscuridad de 12- h a 22 grados y 40 % de humedad con alimento y agua ad libitum. Todos los experimentos se llevaron a cabo durante la parte luminosa del ciclo de luz/oscuridad.

Vectores virales adenoasociados

En todos los experimentos de imágenes de calcio se utilizó el virus adenoasociado AAV5.CamKII.GCaMP6f.WPRE.SV40 (Addgene# 100834, obtenido de Vector Core de la Universidad de Pensilvania). El virus adenoasociado (AAV) del serotipo dj (cápside híbrida creada a partir de ocho serotipos de AAV diferentes) AAVdj-hSyn-ChrimsonR-tdTomato se obtuvo del Vector Core Facility de la Oregon Health and Science University en Portland, Oregon. Aunque es un gen de mantenimiento, no observamos la transfección en células colinérgicas (ver "Resultados" y Fig. 2b-e). Se utilizó una construcción eYFP sin la secuencia ChrimsonR como control (denominado control YFP en este manuscrito).

Procedimientos quirúrgicos

Los ratones se anestesiaron con isoflurano (5 % de inducción, 0. 5–1 % de mantenimiento) y se colocaron en un marco estereotáxico (David Kopf Instruments). La temperatura corporal se mantuvo con una almohadilla térmica y los ojos se hidrataron con gel (Optixcare). y se administró carprofeno (10 ml/kg) por vía subcutánea. Se limpió completamente el cráneo de todo tejido conectivo y se realizaron pequeñas craneotomías utilizando un taladro dental para su posterior inyección o implante.

Inyecciones virales. Todas las inyecciones virales se realizaron utilizando una pipeta de vidrio conectada a un inyector Nanoject III (Drummond). Se entregaron 500 nl de AAVdjhSyn-ChrimsonR-tdTomato (o control eYFP) en el MS a una velocidad de 1 nL/s, en las siguientes coordenadas basadas en el atlas estereotáxico del ratón de referencia69 (distancia de Bregma en mm): anteroposterior (AP) 0,85, mediolateral (ML) 0, dorsoventral (DV) −4,50 utilizando un ángulo de 5 grados en el plano ML. Después de la cirugía, los animales fueron monitoreados hasta su recuperación.

Implante de fibra óptica. Dos semanas después de la inyección, los ratones fueron anestesiados para la implantación siguiendo el mismo procedimiento quirúrgico. En las mismas coordenadas se implantó una fibra óptica de 200 μm de diámetro con virola cerámica (Thorlabs). Los implantes se cementaron en su lugar utilizando C&B-Metabond® (Patterson dental). Se aplicó esmalte de uñas negro sobre el cemento dental para bloquear la emisión de luz durante la estimulación optogenética.

Implantes de electrodos. Se bajó una serie de 7 microelectrodos de tungsteno (~ 1 MΩ de impedancia) en el CA1 dorsal que abarca el estrato piramidal (pyr), el estrato radiatum (rad) y el estrato lacunosummoleculare (lm). Los tornillos colocados en el hueso por encima de la corteza frontal y el cerebelo sirvieron como base y referencia, respectivamente. Después de colocar el electrodo, la tierra y la referencia, se aplicó cemento dental para fijar el implante de forma permanente al cráneo.

Implante para imágenes de calcio. Inyectamos el virus AAV5.CamKII.GCaMP6f (200 nL a 1 nl s−1) en el hipocampo CA1 usando las siguientes coordenadas: anteroposterior (AP) − 1,86 mm desde bregma, mediolateral (ML) 1,5 mm, dorsoventral (DV) 1,5 mm. Dos semanas después de la inyección, se anestesió a los ratones con isoflurano y se les limpió el cráneo. A<2 mm diameter craniotomy was performed in the skull above the injection site. An anchor screw was placed on the posterior plate above the cerebellum. The dura was removed, and the portion of the cortex above the injection site was aspirated using a vacuum pump until the corpus callosum was visible. These fiber bundles were then gently aspirated without applying pressure on the underlying hippocampus, and a 1.8 mm diameter gradient index (GRIN; Edmund Optics) lens was lowered at the following coordinates: AP − 1.86 mm from bregma, ML 1.5 mm, DV 1.2 mm. The GRIN lens was permanently attached to the skull using C&B-Metabond (Patterson Dental), and Kwik-Sil (World Precision Instruments) silicone adhesive was placed on the GRIN to protect it. Four weeks later, the silicone cap was removed and CA1 was imaged using a miniscope mounted with an aluminum base plate while mice were under light anesthesia (<0.5% isoflurane) to allow the visualization of cell activity. When a satisfying field of view was found (large neuronal assembly, visible landmarks), the base plate was cemented above the GRIN lens, the mini scope was removed, and a plastic cap was placed on the base plate to protect the GRIN lens.

Imágenes de calcio simultáneas y registros electrofisiológicos. Para controlar los efectos de los implantes GRIN en theta del hipocampo, así como la interferencia entre el miniscopio y las luces de excitación optogenéticas, conectamos microelectrodos de tungsteno a las lentes GRIN. Para ello, colocamos lentes GRIN horizontalmente bajo un microscopio de bajo aumento en un ambiente libre de polvo. Se colocó suavemente un microelectrodo de tungsteno en el borde superior de la lente GRIN utilizando un micromanipulador. Utilizamos el diámetro conocido de la lente GRIN como unidad de referencia para estimar la protuberancia deseada del electrodo (~ 50 µm, evaluada digitalmente después de tomar una microfotografía de la preparación) según nuestras coordenadas de implantación planificadas. Se depositaron pequeñas cantidades (~50 µL) de superpegamento en el borde superior de la lente GRIN con el electrodo en su lugar y se dejaron secar durante ~10 minutos, antes de aplicar la siguiente capa de pegamento. Se utilizaron cinco capas finas para mantener el electrodo adherido a la lente GRIN. Después de la implantación de estos conjuntos de electrodos GRIN utilizando el protocolo descrito anteriormente, los cables que sobresalían se doblaron suavemente y se ocultaron debajo de una tapa protectora (de 1 a 1,5 cm de altura) extraída de la pera de una pipeta de succión manual como reemplazo de Kwik-Sil.

Procedimientos conductuales in vivo.

Habituación. Los ratones fueron manipulados suavemente durante aproximadamente 5 minutos durante una semana, con una habituación progresiva al procedimiento de taponamiento (fibra óptica, miniscopio y ataduras electrofisiológicas preamplificadas). Luego se programó el suministro de agua a los animales (acceso de 2 h por día).

Grabaciones con miniscopio. Los miniscopios (V3) se ensamblaron utilizando instrucciones de código abierto (miniscope.org). Los datos de imágenes se adquirieron utilizando un sensor de imágenes CMOS (Aptina, MT9V032) y se multiplexaron a través de un cable coaxial liviano. Los datos se adquirieron utilizando una caja de adquisición de datos (DAQ) conectada a través de un controlador host USB (Cypress, CYUSB3013). El comportamiento animal se registró utilizando una cámara web de consumo (Logitech) montada sobre el entorno. Los datos de calcio y de comportamiento se registraron utilizando miniscope.org, software de adquisición personalizado de DAQ. El DAQ adquirió simultáneamente flujos de imágenes celulares y de comportamiento a 30 Hz como archivos.avi sin comprimir de 1000 cuadros para sesiones de grabación de 15- minutos, junto con las marcas de tiempo correspondientes para permitir una alineación temporal precisa de los datos de imágenes de calcio y de comportamiento.

Registros electrofisiológicos in vivo. Después de 1 semana de recuperación posquirúrgica y una semana de habituación a la configuración de anclaje, se registró la LFP de los ratones implantados. Todas las señales registradas de los electrodos implantados fueron amplificadas por el preamplificador de correa antes de digitalizarse a 22 kHz utilizando un sistema de grabación digital (Neuralynx, EE. UU.). Las grabaciones de la señal de cada canal se guardaron junto con las videograbaciones y las señales TTL del Diodo Láser para su posterior análisis.

Estimulación optogenética. La estimulación láser se administró a través de un cordón de fibra óptica (200 μm de diámetro) utilizando una fuente de luz de fibra de diodo láser (Doric Lenses). La intensidad de la luz se calibró y la longitud de onda se corrigió utilizando el paquete de medidor de potencia con la consola PM100D y la luz con sensor de fotodiodo delgado S130C (Thorlabs). Cada estimulación de estimulación (incluidos 8 Hz) se realizó utilizando pulsos cuadrados de 5 ms. Para aplicar estimulación de luz codificada, utilizamos un microcontrolador Arduino para generar una señal de oscilación de ruido blanco directamente alimentada a la entrada analógica del controlador de diodo láser. Para realizar una estimulación de frecuencia seleccionada al azar, utilizamos un protocolo estándar de 5 s ON, 5 s OFF, pero para cada época de estimulación, utilizamos un microcontrolador Arduino para seleccionar aleatoriamente una frecuencia de estimulación en la banda theta. Al aplicar estimulación optogenética durante el comportamiento, se colocó un trozo suelto de tubo termorretráctil alrededor de la unión entre el cable de conexión y el implante de férula del ratón para limitar la emisión de luz visible. Las intensidades de la luz se expresan como potencia nominal, medida en la punta del conjunto de cable-implante de fibra óptica (antes de la colocación quirúrgica) y corregida para la longitud de onda adecuada.

Ensayos de comportamiento

Pista lineal de tono secuencial. Los ratones tenían un horario de agua y podían acceder al agua solo durante 2 horas al día, de 6 a 8 p. m. Para desenredar los códigos espaciales, temporales y de distancia, construimos una pista lineal de 134 cm de largo usando ladrillos Lego® de color gris medio, que permite modificaciones e implementaciones fáciles sin la Necesito modificar permanentemente la estructura del laberinto. Se colocaron sensores piroeléctricos en cada extremo de la pista lineal y se conectaron a un microcontrolador Arduino. Cada detección activaba un nuevo tono en secuencia, indicando el progreso hacia la entrega de la recompensa. Se utilizaron y emitieron los siguientes tonos mediante un altavoz piezoeléctrico: pitidos de 1 segundo a 2000 Hz, pitidos de 250 ms a 3000 Hz y tono continuo a 4000 Hz. Cuando se activó el último tono continuo, se entregó una recompensa (10 % de sacarosa en agua) en el extremo inicial de la pista lineal en la tapa de un tubo Falcon de 15 ml. Los cambios en la dirección de carrera antes de activar el siguiente tono se consideraron errores y no desencadenaron la entrega de recompensa. El rendimiento se midió como el número de intentos correctos (sin error) dividido por el número de intentos totales.

Reconocimiento de lugares de objetos novedosos. El primer día, a los ratones se les permitió explorar libremente un campo abierto de color gris oscuro de 45 × 45 cm que contenía señales visuales (grandes rejillas blancas horizontales y verticales) en sus paredes durante 10 minutos. El segundo día, se presentaron dos objetos idénticos (base de mano amiga) durante 10 min. Al tercer día, se permitió a los ratones explorar el mismo campo abierto mientras se desplazaba la ubicación de uno de los dos objetos. Para controlar posibles sesgos de preferencia espacial, se aleatorizaron tanto la posición inicial como la posición desplazada de los objetos. A los ratones se les atribuyó un orden de prueba aleatorio que se mantuvo idéntico durante los tres días de prueba. El comportamiento fue registrado con una cámara de vídeo (Logitech) y analizado fuera de línea. El análisis de comportamiento se realizó ciego al genotipo y al tratamiento. Las exploraciones de objetos se definieron como épocas en las que los ratones tienen la nariz a 1 cm de un objeto. El RI se calculó de la siguiente manera:

No coincidencia retrasada automatizada con la tarea de muestra. Los ratones fueron programados en agua y entrenados en un laberinto en T continuo para una tarea de muestra retrasada que no coincidía con la muestra. Brevemente, cada ensayo se dividió en dos fases: muestra y prueba. En la fase de muestra, se bloqueó un brazo y los ratones se vieron obligados a explorar el brazo opuesto, donde recibieron una recompensa de 50 µL de agua con un 10% de sacarosa. Después de completar la fase de muestra, los ratones fueron sometidos a un retraso (10 s) en el compartimento inicial. Luego, durante la fase de prueba, se pudieron explorar ambos brazos, pero solo se cebó el brazo opuesto (inexplorado), de modo que los ratones tuvieron que alternar ubicaciones entre las fases de muestra y prueba. Los ratones fueron sometidos a 10 ensayos (muestra + prueba) por día, durante 10 días consecutivos, y la tasa de éxito diaria se calculó como el número de ensayos correctos dividido por el número total de ensayos.

Análisis histológicos post mortem.

Después de completar las pruebas de comportamiento, los ratones fueron anestesiados profundamente con una mezcla de ketamina/xilazina/acepromazina (100, 16, 3 mg/kg, respectivamente, inyección intraperitoneal) y perfundidos transcardialmente con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS. Los cerebros se extrajeron y se fijaron durante la noche en PFA a 4 grados y posteriormente se lavaron en PBS durante 24 horas adicionales a 4 grados. Los cerebros y las secciones se crioprotegieron en una solución de 30% de etilenglicol, 30% de glicerol y 40% de PBS hasta su uso. Luego, cada cerebro se seccionó a 50 µm usando un vibratomo: cada sección se recogió secuencialmente en 4 tubos diferentes de 1,5 ml para permitir diferentes análisis. (ubicación de electrodos, inmunohistoquímica).

Inmunohistología. Utilizando un tubo de secciones de cerebro recolectadas (muestreo del 25%) para cada análisis, las secciones se lavaron durante 3 × 5 minutos en PBS para eliminar la solución crioprotectora. Las secciones se incubaron durante la noche con PGT (0.45% gelatina y 0.25% Triton en PBS) a 4 grados. A continuación, las rebanadas se incubaron con anticuerpos primarios: anti-colina-acetilo de cabra 1:200. -transferasa de Millipore o IgG1 anti-PVmonoclonal de ratón 1:500 de Sigma-Aldrich en PGT a temperatura ambiente durante 48 ho 2 h respectivamente. Después de lavados de 10, 20 y 30 minutos, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios [anti-cabra de burro 1:2000 acoplado con Alexa 488 o IgG1 anti-ratón de cabra 1:500 acoplado a Alexa 488 (Life Technologies)] en PGT para 45 min. Después de lavados de 10, 20 y 30 minutos en PBS, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio y se cubrieron permanentemente con medio de montaje Fluoromount que contenía DAPI. En este estudio solo se incluyeron ratones con la colocación de implantes confirmada histológicamente. Para GRINlenses, la superficie de la lente tenía que ser<100 µm above stratum pyramidale, and GCaMP6f expression was validated using fluorescence microscopy. Electrophysiological implants had to include at least one microelectrode in CA1 stratum radiatum or stratum pyramidale. Finally, the tips of fiber optics had to be within 100 µm of the MS region, and proper construct expression was assessed using fluorescence microscopy.

Análisis de los datos

Except for analyses of SWRs and the explicit impact of locomotion on physiological recordings, electrophysiological and calcium imaging analyses were performed only on periods of locomotion (>2 cm s−1 in the open field; >5 cm s−1 en la pista lineal).

Seguimiento automatizado del comportamiento. Para extraer información sobre la posición, velocidad y dirección de la cabeza de los ratones, utilizamos DeepLabCut70,71. Brevemente, entrenamos un modelo para detectar las orejas, la nariz, el cuerpo y la base de la cola de los ratones. La dirección de la cabeza se estimó utilizando el ángulo entre cada oreja o la nariz y el cuerpo, según la disponibilidad de mediciones. Los datos de ubicación se interpolaron a la frecuencia de muestreo de imágenes de calcio mediante interpolación lineal. La velocidad se extrajo calculando Δd/Δt donde d es la distancia y t tiempo y posteriormente se suavizó el resultado aplicando un filtro gaussiano con sigma=33 ms para eliminar los artefactos de detección. Se utilizaron señales de velocidad para identificar períodos de actividad locomotora y calcular la modulación de la actividad en lugar, tiempo y distancia específicamente para esos períodos.

Análisis de imágenes de calcio. El análisis de datos de imágenes de calcio se realizó con MATLAB 2020a y Python 3.8.4. Las grabaciones de video se analizaron utilizando el canal de análisis Miniscope (https://github.com/etterguillaume/MiniscopeAnalysis). Brevemente, se aplicó una corrección de movimiento rígido (rotación y traducción) usando NoRMCorre72, y los videos se redujeron espacialmente (3×) antes de la concatenación. Las trazas de calcio se extrajeron utilizando CNMFe51 utilizando los siguientes parámetros: gSig=3 píxeles (ancho del núcleo gaussiano), gSiz=20 píxeles (diámetro aproximado de la neurona), fondo_modelo='anillo', algoritmo_espacial='hals', min_corr=0.8 (umbral mínimo de correlación de píxeles), min_PNR {{17 }} (umbral mínimo de relación pico-ruido).

Las trazas de calcio sin procesar se filtraron para eliminar las fluctuaciones de alta frecuencia y se binarizaron: brevemente, las neuronas se consideraron activas cuando la amplitud de la señal de calcio normalizada excedía dos desviaciones estándar y la derivada de primer orden estaba por encima de 0 (consulte la referencia 52 para obtener detalles adicionales). sobre la metodología52). Para extraer neuronas que se sintonizan con variables específicas, se agruparon la ubicación, el tiempo y la distancia (ubicación: intervalos de 3 cm; tiempo: intervalos de 1 s; distancia: intervalos de 3 cm). A partir de señales binarizadas, calculamos la probabilidad marginal de que las células estén activas P Að Þ que utilizamos como indicador de la actividad neuronal. Más importante aún, luego derivamos la probabilidad de actividad o la 'probabilidad de estar activo dado el estado de la variable' PA j Si usando variables agrupadas:

donde M es el número total de posibles estados de comportamiento y P (Si∩Aj) es la probabilidad conjunta de que el animal esté en el contenedor I al mismo tiempo que el nivel de actividad j (0 o 1). Para evaluar la importancia del valor MI obtenido, luego generamos 1000 sustitutos barajados utilizando permutaciones circulares aleatorias. Elegimos permutaciones circulares porque eliminan la relación temporal entre la actividad neuronal y el comportamiento, al mismo tiempo que preservan la estructura temporal de los transitorios de calcio y, por lo tanto, conducen a resultados más conservadores (a diferencia de la aleatorización completa de cada punto de datos, que infla el valor significativo de los resultados). Debido a que los sustitutos barajados no tenían una distribución normal sistemática, utilizamos un enfoque no paramétrico donde el valor p (pN) corresponde al número de puntos de datos de la distribución barajada que es mayor que los datos reales para cada contenedor, dividido por el número de permutaciones52. 73.

Para determinar la modulación de las células mediante estimulaciones optogenéticas, utilizamos un enfoque similar pero calculamos el IM entre la actividad neuronal y las señales de estimulación binarizadas (por lo tanto, tratadas como un estado de comportamiento). Luego se utilizó el mismo procedimiento de barajado circular para extraer significación estadística.

where P(S|A) is the posterior probability distribution of states given neuronal activity. Using only epochs with velocity >5 cm s-1, se generó un conjunto de datos de entrenamiento utilizando el 90% de los datos. El 10% restante de los datos se utilizó para realizar pruebas. Se calculó un error de decodificación utilizando 50 sustitutos iniciados y un grupo de 160 células utilizando puntos de datos elegidos al azar con reemplazo. Se supone que cada neurona es independiente entre sí, lo que en la práctica no es el caso y conduce a mayores errores de reconstrucción, pero disminuye el tiempo de cálculo. La probabilidad posterior de la población se derivó de la siguiente ecuación:

Seguimiento de células durante varios días. Se realizó un seguimiento de las neuronas durante varios días utilizando CellReg74: https://github.com/zivlab/CellReg (v1.5.3). En resumen, las huellas espaciales se alinearon mediante una alineación rígida para corregir rotaciones y traslaciones. Después de la alineación, consideramos que los conjuntos de células candidatas eran la misma neurona si su distancia máxima era<12 µm, and used the modeled spatial correlation threshold (usually in the range 0.6–0.8) to determine the identity of cell pairs across days. Finally, we assessed the stability of the spatial representation using pairwise field correlation (Pearson correlation of tuning curves).

Análisis electrofisiológico. El análisis de datos electrofisiológicos se realizó utilizando MATLAB 2020a utilizando tanto el procesamiento de señales como la caja de herramientas wavelet. La convolución de ondas se aplicó a señales LFP utilizando ondas de Morlet complejas ('cmor1–1.5' en MATLAB) cuando se requería precisión tanto en el dominio del tiempo como en el de la frecuencia. La convolución de Fourier de ventana móvil (ventana de 2 s en la banda theta, ventana de 5 s en la banda gamma, pasos móviles de 10 ms) se utilizó cuando se privilegió la precisión del dominio de la frecuencia sobre la precisión del dominio del tiempo (p. ej., frecuencia dominante en el gráfico superior cuando se marca el ritmo mediante optogenética). El análisis de las densidades espectrales de potencia se realizó cuando los ratones corrían a 5 cm s-1 o más, a menos que se indique lo contrario.

Fuerza de oscilación. La OS se calculó como la relación entre la densidad espectral de potencia acumulada alrededor de la frecuencia de oscilación máxima ± 1 Hz y la potencia de banda acumulada en la banda theta (4–12 Hz). Esta métrica se vuelve 1 cuando toda la densidad espectral de potencia cae dentro de la frecuencia de oscilación máxima (por ejemplo, 8 Hz si se estimula a esa frecuencia).

Detección y análisis de ROE. Para monitorear las ROE, se permitió a los ratones explorar libremente un campo abierto durante 10 min mientras grababan. Las estimulaciones (codificadas u 8 Hz) se realizaron con un paradigma de 5 s ON, 5 s OFF. Para el análisis sólo se consideraron períodos de reposo tranquilo. Para este fin, calculamos la relación de puntuación z de la potencia theta/delta después de filtrar para cada banda de frecuencia, realizando una transformada de Hilbert y solo consideramos los períodos en los que el valor resultante estaba por debajo de 0. Para detectar SWR, filtramos señales LFP en el rango 150-250. Banda de frecuencia Hz y posteriormente puntuación z. Las ondas se detectaron utilizando la función findpeaks en MATLAB, con los siguientes parámetros: umbral=4 sd, minpeakwidth=0 s, minpeakdistance=0.03 s.

Referencias

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