La inhibición optogenética de las entradas de la corteza entorrinal medial al hipocampo durante un corto período de tiempo justo después del aprendizaje interrumpe la formación de la memoria del miedo contextual

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Resumen

La formación de la asociación temporal.memoriay miedo específico del contextomemoriaSe cree que requiere entradas de la corteza entorrinal medial (MEC) para elhipocampodurante los eventos de aprendizaje. Sin embargo, aún no se ha probado directamente si las entradas de MEC también están involucradas en la formación de la memoria durante un período posterior al aprendizaje. Para examinar esta posibilidad, inhibimos optogenéticamente axones y terminales que se originan en neuronas excitatorias MEC dorsales bilaterales en la región dorsal.hipocampodurante 5 min justo después del condicionamiento del miedo contextual (CFC). Los ratones que expresaban eNpHR3.0 exhibieron una congelación significativamente menor en comparación con los ratones de control que expresaban EGFP solo durante la prueba de recuperación en el contexto condicionado 1 día después del aprendizaje. Por el contrario, la misma inhibición optogenética de las entradas de MEC realizada 30 minutos antes de la prueba de recuperación no afectó la congelación durante la prueba de recuperación, lo que excluye la posibilidad del efecto nocivo no específico de la inhibición óptica en el proceso de recuperación. Estos resultados respaldan que la formación de la memoria del miedo contextual requiere entradas de MEC en el hipocampo durante un período posterior al aprendizaje.

Palabras clave: corteza entorrinal medial, hipocampo, condicionamiento del miedo contextual

Min Soo Kang y Jin-Hee Han

El sistema hipocampo-corteza entorrinal es crucial para el desarrollo episódicomemoriaformación [1]. La evidencia sugiere que la entrada de la capa III de la corteza entorrinal medial (MECIII) alhipocampo, principalmente para el subcampo CA1, es crucial para el aprendizaje asociativo temporal, como el condicionamiento del miedo, pero no para el condicionamiento del miedo contextual y retrasado [2, 3]. Por el contrario, la inhibición optogenética de las células de la capa II de la corteza entorrinal medial (MECII) que se proyectan al giro dentado (DG) y CA3, pero no a las células que se proyectan a CA1, durante la CFC afecta la formación de la memoria [4]. Por lo tanto, se cree que el aporte de MECII a DG o CA3 es necesario para el aprendizaje contextual del miedo. No solo en el aprendizaje, sino que la entrada de MEC al hipocampo también está involucrada en patrones de actividad fisiológica únicos observados en el hipocampo durante el descanso y el sueño, como ondas y picos dentados que están asociados con elmemoriaproceso de consolidación [5-10]. Por lo tanto, la entrada de MEC alhipocampopuede tener un papel en la formación de la memoria durante un período posterior al aprendizaje. Sin embargo, esta posibilidad aún no ha sido probada. Para probar si la entrada de MEC al hipocampo es necesaria durante el período posterior al aprendizaje, adoptamos un enfoque optogenético para silenciar la actividad de entrada de MEC en ratones híbridos 129/C57Bl/6 [11, 12]. Para manipular la entrada de MEC, se inyectó virus adenoasociado (AAV) que contiene genes que codifican eNpHR3.0 fusionado con la proteína fluorescente EYFP bajo el promotor CaMKII (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP) en la región bilateral MEC apuntando a la capa II y III (0.5 µL por lado; AP: - 4.65 mm; ML: ± 3.4 mm; DV: - 3.3 mm) (Fig. 1a). Como control, inyectamos AAV que carece de eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), que solo expresa la proteína fluorescente. La expresión de AAV se restringió a las capas II y III de MEC, que envían proyección al hipocampo (Fig. 1b). En el hipocampo, se detectaron proyecciones axonales de MEC que expresan EYFP en DG y CA3, con origen en MECII, y también en CA1, con origen en MECIII (Fig. 1a). Tres semanas después de la cirugía de inyección de AAV, los ratones fueron anestesiados nuevamente para la cirugía de implante de fibra óptica.

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Se implantaron fibras ópticas en el hipocampo dorsal (AP: − 2,0 mm; ML: ± 1,3 mm; DV: − 1,5 mm) para la supresión óptica de entradas MEC dorsales con un láser 561-nm. Las puntas de fibra óptica se ubicaron justo encima de la capa molecular lacunosa del estrato CA1 y, por lo tanto, el láser 561-nm podría cubrir tanto los aferentes MECII en la capa molecular DG/estrato radiante CA3 como los aferentes MECIII en la capa molecular lacunosa del estrato CA1 ( Archivo adicional 1: Fig. S1). Durante el período de recuperación de una semana después de la cirugía de implante, los ratones se habituaron a la fibra durante 3 días. Se conectaron a un latiguillo óptico emisor de luz y se colocaron en la jaula de habituación durante 5 min sin suministro de luz. Después de 3 días de habituación, se entrenaron ratones EGFP y eNpHR3.0 para CFC.

Los ratones entraron en la cámara de acondicionamiento y recibieron una descarga eléctrica en las patas ({{0}},5 mA, 2 s) 3 minutos después. Un minuto después de la conmoción en las patas, los ratones se transfirieron inmediatamente a la jaula habituada y recibieron luz 561-nm continua (5 mW en la punta de la fibra) durante 5 minutos (Fig. 1b). Después de la inhibición posterior al aprendizaje, los ratones regresaron a sus jaulas de origen. Para probar si la memoria contextual se formó correctamente, se probó la memoria a largo plazo (LTM). Los ratones volvieron a entrar en la cámara de acondicionamiento 24 h después de CFC. Los niveles de congelación se midieron como un índice de LTM, monitoreados durante 3 min. Los ratones del grupo eNpHR3.0 mostraron una congelación significativamente menor en comparación con los ratones del grupo de control EGFP (Fig. 1c), lo que indica un déficit de 24-h LTM por la inhibición posterior al aprendizaje de las entradas de MEC en el hipocampo. Esta reducción de la congelación no se debió a un efecto nocivo no específico del proceso de inhibición óptica. Cuando se administró la misma inhibición óptica 30 minutos antes de la prueba LTM, no hubo una diferencia significativa en la congelación entre los grupos (Fig. 1d, e).

Aunque la mayoría de los aferentes de MEC se dirigen al hipocampo, se sabe que MEC envía proyecciones a las áreas corticales prefrontales mediales, como la corteza prelímbica e infralímbica [13]. Dado que la expresión de AAV fue aleatoria en MEC, es posible que nuestra inhibición óptica afectara a los axones de MEC que pasan a través del hipocampo, si los hay, para producir su efecto en la formación de memoria de miedo contextual. Para excluir esta posibilidad, etiquetamos retrógradamente las neuronas MEC que se proyectan al hipocampo. Inyectamos el virus CAV2-Cre en el hipocampo, que es captado de forma retrógrada por las neuronas que se proyectan al hipocampo a través de las terminales axónicas (Fig. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP o AAV-Ef1 -DIO-EYFP se inyectó en el MEC, por lo que las neuronas MEC que han absorbido CAV2-Cre pueden expresa eNpHR3.0-EYFP o EYFP (Archivo adicional 1: Fig. S2). Diez, logramos inhibir las entradas de MEC en el hipocampo justo después de CFC. Similar a los resultados anteriores, la inhibición óptica interrumpió la formación de la memoria del miedo del contexto (Fig. 1g, h) en esta condición. Por lo tanto, estos datos fortalecen aún más nuestra conclusión de que las entradas de MEC al hipocampo son cruciales para la formación de la memoria contextual durante un período posterior al aprendizaje. Una limitación de este estudio es la falta de especificidad espacial en la inhibición óptica utilizada.

Por lo tanto, no está claro en qué medida y dónde exactamente dentro del circuito del hipocampo se suprimieron las entradas generalizadas de MEC con la inhibición óptica en nuestra condición. La inhibición precisa de las entradas de MEC dirigidas a un subcampo específico como CA1 o DG del hipocampo podría ser necesaria para dilucidar el mecanismo por el cual las entradas de MEC contribuyen a la formación de la memoria del miedo contextual en el estudio futuro. Aunque no probamos el efecto de la inhibición óptica de las entradas de MEC al hipocampo en diferentes puntos de tiempo después del condicionamiento del miedo contextual en este estudio, estudios previos informan un papel dependiente del tiempo de las actividades cerebrales posteriores al aprendizaje para la consolidación de memorias dependientes del hipocampo como condicionamiento del miedo contextual. Por ejemplo, utilizando una estrategia optogenética, un estudio anterior manipuló artificialmente la inducción del sueño de ondas lentas (SWS) en diferentes puntos de tiempo después de diferentes tareas de aprendizaje y pareció que hay una ventana de tiempo crítica (dentro de 30 minutos) durante la cual SWS indujo por la luz puede mejorar los recuerdos dependientes del hipocampo [14].

La inhibición de la Fig. 1 de la entrada de MEC en el hipocampo inmediatamente después de ganar perjudica la formación de la memoria del miedo contextual a largo plazo. a Representación esquemática de la zona de implante de férrula óptica y AAViniección bilateral (izquierda). Imágenes representativas de conkocalmikroscopk que muestran la expresión de EGFP y eNpHR0-EYFP en MEC arriba) y en el hipocampo (abajo). El asterisco indica la posición aproximada de la punta de la fibra óptica. b Esquema de comportamiento. Histograma que muestra el nivel de congelación durante la pruebaNpHR30 alrededor de （3589主 3,21 por ciento, n=】1】 mostró una joya congelada significativamente menor en comparación con el grupo de control EGFP (53,13 ± 265 por ciento, n=12) en Prueba LTM.**p<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005: La prueba t de Student no es significativa, f Estrategia de activación de CAV y AAV o marcaje retrógrado de neuronas MEC que se proyectan hacia el hipocampo (f) Representación esquemática de inyección CW bilateral Inyección AW y esquema de comportamiento del sitio de implante de férula óptica (derecha). h Histograma que muestra el nivel de congelación durante la prueba. El grupo eNpHR3.0 (33,71±4,06 por ciento, n=11) ​​mostró un nivel de congelación significativamente menor en comparación con el grupo de control EYFP (50,13±3,18 por ciento, n=12) en la prueba LIM .**pags<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Curiosamente, otro estudio en ratas mostró que las lesiones electrolíticas selectivas de la proyección entorrinal directa (temporoamónica, TA) al área del hipocampo CA1 24 h pero no 3 semanas después del entrenamiento del laberinto acuático de Morris interrumpieron la formación de la memoria espacial en un nivel remoto. tiempo, lo que sugiere que la interacción MEC-hipocampo a través de la vía de entrada TA durante este período de tiempo es necesaria para la consolidación de los sistemas [15]. Teniendo en cuenta estos hallazgos, es muy probable que las entradas de MEC al hipocampo tengan un papel dependiente del tiempo en la formación de la memoria del miedo contextual reciente y remota.

Es interesante en nuestro estudio que un período tan corto (5 min) de inhibición optogenética posterior al entrenamiento fue suficiente para afectar la formación de la memoria contextual. Una interpretación es que nuestros resultados pueden reflejar un bloque parcial de eventos de consolidación que se requieren para la formación normal de la memoria. De acuerdo con este relato, la memoria se vio parcialmente afectada en nuestra condición. Otra posibilidad es que pueda ocurrir un evento crítico durante este breve punto de tiempo requerido para la formación de la memoria contextual del miedo. Una posibilidad es que la entrada de MEC pueda ser crucial para desencadenar ondas o picos dentados en el hipocampo que se correlacionan con una repetición de eventos experimentados previamente [7, 9, 10, 16] y la inhibición optogenética de la entrada de MEC podría interrumpir dichos patrones de actividad. Alternativamente, la inhibición breve de la entrada de MEC puede haber afectado el sueño de ondas lentas posterior, que también tiene una ventana de tiempo crucial en términos de consolidación de la memoria dependiente del hipocampo [14].

Referencias

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