En el presente estudio, exopolisacárido de galactano (EPS) deCistancheKR780676 fue evaluado por su potencial paraaliviar el estrés oxidativousando ensayos in vitro y estudios in vivo, saccharomyces cerevisiae (tipo salvaje) y suantioxidante(sod14, sod24, tsa14, cta2 y ctt12)antiapoptótico(pep4 y fs14) yantienvejecimiento(sod24, tsa1 y ctt12)) mutantes por deleción de genes isogénicos. Galactan exhibió un fuerte DPPH yactividad de eliminación de óxido nítricocon un valor de lCso de 450 y 138 ug/mL respectivamente. En el modelo mutante de levadura, el estrés oxidativo generado por H2O fue ampliamente eliminado por galactano en el medio, como se confirmó utilizando ensayos puntuales seguidos de tinción fluorescente DCF-DA y estudios microscópicos. El tratamiento con galactano resultó en una reducción de las ROS generadas en las células mutantes de levadura, como lo demuestra la disminución de la intensidad de la fluorescencia. Además, la galactana mostró protección contra el daño oxidativo a través de la inhibición de la apoptosis inducida por H,O, en las cepas mutantes de levadura (pep4 y fs1), lo que condujo a una mayor tasa de supervivencia al neutralizar el estrés oxidativo. En el ensayo de duración de la vida cronológica, las células WT tratadas con galactanEPS mostraron un aumento del 8 % en la viabilidad, mientras que el mutante sod2 mostró un aumento del 10-15 %, lo que indica efectos antienvejecimiento pronunciados. Galactan de W. confuse KR780676 tiene un inmenso potencial para ser utilizado como antioxidante natural para aplicaciones tecnológicas nutracéuticas, farmacéuticas y alimentarias. Según nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre una evaluación en profundidad de las propiedades antioxidantes in vivo del EPS abacteriano en un sistema modelo de eliminación de levadura.

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La oxidación es un proceso esencial para mantener los procesos biológicos y también para la producción de energía en todos los organismos vivos. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) y las especies reactivas de nitrógeno (RNS) se producen a partir del catabolismo normal de las moléculas de oxígeno y nitrógeno, respectivamente. El estrés oxidativo severo conduce a varias condiciones degenerativas como daño en el ADN, degeneración celular y carcinogénesis. Estos pueden resultar en muchos problemas de salud tales comoenvejecimiento, enfermedades cardiovasculares, cáncer, cirrosis, aterosclerosis, diabetesy la artritis reumatoide2-6, los antioxidantes son las moléculas que eliminan los radicales libres generados en los alimentos o el sistema vivo y conducen a la prevención de las condiciones de salud relacionadas con el daño oxidativo-9. Aunque muchos antioxidantes sintéticos están disponibles como potentes eliminadores de radicales, algunos de ellos se han relacionado con algunos efectos secundarios indeseables. En vista de esto, ha aumentado el interés y la demanda de antioxidantes naturales en las industrias de alimentos y farmacéutica. Se ha informado que la mayoría de los polisacáridos a base de plantas y hongos son importantes agentes protectores contra ROS11–21. También se han informado varios exopolisacáridos microbianos (EPS), incluidos los de bacterias del ácido láctico (LAB), por sus propiedades antioxidantes sustanciales. Estos se consideran alternativas más seguras a los sintéticos. En los últimos años, muchos EPS de LAB han sido estudiados por su potencial antioxidante y prevención del daño oxidativo22,23. El potencial antioxidante y el papel protector de Weissella EPS también se han informado de una variedad de EPS aislado de Weissella muchas cepas como Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 y W. cibaria SJ1424–29. Las propiedades antioxidantes in vivo se pueden estudiar utilizando varios sistemas modelo, como líneas celulares30, C. elegans31, levadura32 y ratones33. Previamente, varios compuestos han sido evaluados por sus propiedades antioxidantes potenciales utilizando el sistema modelo mutante de eliminación del gen de la levadura Saccharomyces cerevisiae32,34–37.

Este estudio se centra en lapotencial antioxidante de la galactana EPSproducido por la cepa probiótica Cistanche KR780676 a partir de un alimento fermentado tradicional indio (rebozado Idli)38,39. En este artículo, se analiza el potencial antioxidante in vitro del EPS de galactano mediante ensayos de captación de radicales hidroxilo, óxido nítrico y DPPH y antioxidantes in vivo,antiapoptóticoypropiedades antienvejecimientoutilizando un sistema modelo mutante por deleción del gen de levadura.

Materiales y métodos

Todos los productos químicos, incluidos los suplementos de medios, se obtuvieron de Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., India, y DCF-DA (diacetato de 2,7 diclorodihidrofluoresceína) de Sigma.

Cultivo microbiano.CistancheKR780676 aislado de un alimento fermentado ácido de la India (masa Idli), que se informó que produce galactán EPS, se utilizó en este estudio 38.

Detección de producción de EPS. La producción de EPS de W. confusa se observó a nivel de colonia. Brevemente, la cepa se cultivó en agar MRS (suplementado con sacarosa al 2 por ciento). Después de 48 horas a 30 grados, se observó la aparición de colonias viscosas/mucosas. La producción de galactán EPS se verificó aún más mediante análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM).

Extracción de EPS. El proceso de extracción de EPS se realizó según el método descrito en Kavitake et al.38. Se añadió inóculo fresco (10 por ciento) de W. confusa a medio MRS mejorado con sacarosa al 2 por ciento a 30 grados durante 48 h en condiciones estáticas. La suspensión se centrifugó de esta manera (12,000xg durante 15 min) para aislar la biomasa y luego se trató con ácido tricloroácido para eliminar los restos de proteína. El galactano-EPS se precipitó utilizando etanol helado (tres veces el volumen), se centrifugó (19 200 xg durante 15 min) y el EPS resultante se disolvió en agua Milli-Q. El EPS crudo se dializó a 12-14 kDa (48 h, 4 grados) y se liofilizó por liofilización durante 48 h.

Propiedades antioxidantes in vitro del galactano EPS. El ensayo DPPH para galactano se ejecutó de acuerdo con el informe anterior de Ye et al.9 y el porcentaje de actividad depuradora (porcentaje) se calculó mediante la siguiente ecuación.

donde Ao y As es la absorbancia del control (blanco, sin EPS) y la muestra respectivamente. El ensayo de eliminación de radicales de óxido nítrico (NO) para galactano se realizó de acuerdo con Sreejayan et al.40 y se calculó como la siguiente ecuación,

donde Ao es la absorbancia del control (blanco, sin EPS) y As es la absorbancia en presencia del EPS. Se midió la actividad de poder reductor para galactano EPS según lo informado por Ye et al.9. La absorbancia se leyó a 700 nm y el potencial reductor está indicado por una alta capacidad de absorbancia de la mezcla de reacción. Se utilizó ácido ascórbico (Vc) como control positivo. La actividad eliminadora de radicales hidroxilo del galactano EPS se evaluó según lo descrito por Yang et al.41. La absorbancia se leyó a 536 nm y el porcentaje de barrido se calculó como:

donde A muestra es la absorbancia de la muestra, A blanco es una absorbancia en ausencia de una muestra y solución de H2O2, y A control es una absorbancia en ausencia de la muestra

Propiedades antioxidantes in vivo de galactano EPS en cepas mutantes de levadura.

La levadura, S. cerevisiae, BY4741 de tipo salvaje (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) y las cepas mutantes con deleción génica se obtuvieron de Thermo Fisher Scientific, EE. UU. Las cepas de levadura se cultivaron en medio de peptona dextrosa de levadura (YPD) suplementado con o sin 200 µg/mL de Geneticina (sulfato G418) para la selección de mutantes. El medio sólido YPD se preparó mediante la adición de agar Bacto al 2 % al medio líquido YPD42.

Efecto del EPS sobre el crecimiento de la levadura. El cultivo de levadura de tipo salvaje (WT) de crecimiento exponencial (aproximadamente 1 × 104 células) se trató con diferentes concentraciones (0–400 ug/mL) de EPS en una placa de micropocillos y el volumen final se completó hasta 200 μL con caldo YPD. El cultivo se incubó durante 18 horas a 30 grados seguido de una dilución en serie y se esparció en placas de agar YPD. Las placas se incubaron a 30 grados durante 2 días y se contaron las unidades formadoras de colonias (CFU) y la viabilidad se expresó como porcentaje de CFU43.

Medición de biomarcadores de estrés oxidativo. Se pretrataron células WT de levadura de crecimiento exponencial con o sin 300 ug/ml de EPS durante 2 h. Diez células se expusieron a H2O2 1 mM durante 1 hora a 30 grados en una incubadora con agitación y se procesaron para medir la actividad de SOD y los niveles de peroxidación lipídica según el método descrito en informes anteriores44–46

La propiedad antioxidante del EPS en mutantes por deleción del gen de S. cerevisiae.

Los cultivos de levadura WT y cepas mutantes deficientes en antioxidantes (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ y yhb1∆) en crecimiento exponencial se trataron con 300 ug/mL de EPS durante 2 h seguidos de exposición a H2O2 1 mM durante 1 h. Las células diluidas en serie se esparcieron en placas de agar YPD, se incubaron durante 2 días a 30 grados y se calculó la viabilidad. Para el ensayo puntual, los cultivos se diluyeron en serie en 10-pliegues, 4 μL de los cuales se colocaron en placas de agar YPD, se incubaron a 30 grados durante 2 días y se fotografiaron43,47. Detección y medida de ROS. Las cepas mutantes deficientes en antioxidantes y WT de crecimiento exponencial (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ y ctt1∆) se pretrataron con o sin EPS durante 2 h y se expusieron a H2O2 1 mM durante 1 h a 30 °C. Los sedimentos celulares después de la centrifugación a 5000 rpm durante 5 min se lavaron dos veces con tampón PBS, se resuspendieron en 200 μL de PBS y se incubaron con DCF-DA 20 μM en la oscuridad durante 15–20 min a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS, se montaron en los portaobjetos y se observaron con un microscopio de fluorescencia Olympus Ix71 con un objetivo de 40x usando un filtro azul. Para la cuantificación de ROS, las células teñidas con DCF DA se resuspendieron en 200 μL de PBS después del lavado y la intensidad de la fluorescencia DCF se midió usando un espectrofluorómetro en el máximo de excitación y longitudes de onda de emisión de 495/529 nm. Las unidades de fluorescencia se representaron frente a cada cultivo tratado y no tratado y se compararon48,49.

Actividad antiapoptótica de la galactana.

Ensayos Spot y CFU. Las células WT y mutantes deficientes en antiapoptóticos (pep4∆ y fs1∆) cultivadas exponencialmente se trataron previamente con EPS y se incubaron junto con los respectivos controles no tratados durante 2 h. Para el recuento de UFC, los cultivos se trataron o no con EPS durante 2 h y se incubaron con 0,5 mM H2O2 durante 1 h. Cada cultivo diluido en serie se esparció en placas de agar YPD y se incubó a 30 grados durante 2 días y la viabilidad celular se representó como porcentaje de CFU. Para el ensayo de puntos, los cultivos se diluyeron en serie seguidos de puntos en placas de agar YPD con o sin H2O2 1 mM. Las placas se incubaron a 30 grados durante 2 días y se fotografiaron47.

Detección de un marcador antiapoptótico de EPS

utilizando cepas mutantes de levadura. Para confirmar aún más la acción de rescate de EPS en células de levadura de la muerte celular apoptótica inducida por peróxido de hidrógeno en levadura, WT y cepas mutantes deficientes antiapoptóticas (pep4∆ y fs1∆) se examinaron en busca de marcadores de apoptosis. Células WT, pep4∆ y fs1∆ de crecimiento exponencial se trataron o no con 300 µg/mL de EPS durante 2 hy luego se expusieron a H2O2 1 mM durante 1 h. Tanto las células tratadas como las no tratadas se tiñeron con naranja de acridina y bromuro de etidio (AO/EB) y se observaron bajo un microscopio fluorescente para determinar la condensación de la cromatina50,51. Para la tinción con DAPI, las células tratadas y no tratadas se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se incubaron con 1 ug/mL de DAPI durante 5 a 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Las células se montaron en los portaobjetos después de lavarlas con PBS y se observaron con un microscopio de fluorescencia Olympus IX71 (filtro UV, objetivo 40x) para determinar la fragmentación nuclear52,53.

Efecto antienvejecimiento de EPS por ensayo de vida útil cronológica.

Los cultivos de levadura de tipo salvaje y mutantes deficientes en antioxidantes (sod2∆, tsa1∆ y ctt1∆) se cultivaron para alcanzar la fase estacionaria y se incubaron con o sin EPS para el ensayo de vida útil cronológica (CLS). La capacidad de supervivencia de cada cepa se calculó en diferentes intervalos de tiempo de 0 a 30 días. La viabilidad celular se expresó como porcentaje de UFC para cultivos tratados y no tratados54,55. Análisis estadístico. Todos los experimentos se realizaron por triplicado (±SD) y se analizaron estadísticamente utilizando el software IBM SPSS 20 en un modelo ANOVA unidireccional. Prueba de comparación HSD de Tukey (p<0.05) was used to measure the significance level. 

Resultados y discusión Las bacterias del ácido láctico (BAL) aisladas de alimentos fermentados han captado la atención de los tecnólogos de alimentos en los últimos años debido a sus propiedades probióticas comprobadas. Entre las bacterias aisladas de los alimentos fermentados de la India se encuentran Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. y la menos explorada Weisella spp. Al igual que las otras BAL beneficiosas, se ha informado que la cepa Cistanche KR780676 que se aisló de la masa idli fermentada en nuestro laboratorio actúa como un posible candidato a probiótico39. En informes anteriores, este galactano se caracterizó como un homopolisacárido lineal y también se evaluó por sus propiedades fisicoquímicas, funcionales y emulsionantes38,56–58. También informamos que las células y los sobrenadantes celulares de W. confusa KR780676 mostraron una fuerte actividad antioxidante39. La producción de EPS de W. confusa KR780676 se observó en una placa de agar MRS enriquecida con sacarosa al 2 %, incubada durante 48 h (Fig. 1A-i), lo que reveló colonias viscosas de Weissella y se confirmó aún más en la imagen SEM (de la colonia de Weissella) mostrando la presencia de galactano EPS junto con células (Fig. 1A-ii). La producción de EPS paso a paso se resume con la representación pictórica en la Fig. 1B.

Propiedades antioxidantes in vitro del galactano EPS. Como se muestra en la Fig. 2A, se observa que la actividad depuradora de DPPH depende de la concentración, la actividad depuradora aumentó con la concentración de galactano. La mitad de la concentración efectiva máxima (IC50) de ácido ascórbico fue de 8,8 µg/mL, mientras que el galactano EPS fue de 450 µg/mL. 1,1-difenil-2-picrilhidrazilo (DPPH) es un radical libre estable que deslocaliza los electrones no apareados contra la molécula en su conjunto, evitando así que las moléculas se dimericen y dando como resultado un color violeta intenso59. Cuando se agrega solución de DPPH a diferentes concentraciones (50 a 500 µg/mL) de galactano, se produce una reducción del color violeta a medida que aumenta la concentración. Los antioxidantes al reaccionar con un electrón de DPPH, el color violeta intenso de DPPH se vuelve de color violeta claro; y la intensidad del color depende de la actividad antioxidante del sustrato60. Galactan mostró un potencial de eliminación de DPPH del 60 por ciento, que es más alto que el EPS de la bacteria endofítica Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

El óxido nítrico se produce cuando el nitroprusiato de sodio se descompone en una solución acuosa a un pH de 7,2. El nitrato y el nitrito se producen en condiciones aeróbicas cuando el óxido nítrico se une al oxígeno61. Como se muestra en la Fig. 2B, el galactano tiene el potencial de reducir la generación de óxido nítrico a partir del nitroprusiato de sodio, ya que la concentración efectiva media máxima (IC50) es de 138 µg/mL, mientras que el ácido ascórbico estándar era de 11 µg/mL. Como se muestra en la Fig. 2C, la actividad de poder reductor de EPS se correlaciona positivamente con su concentración en orden creciente. El estándar (ácido ascórbico) mostró una mayor capacidad reductora que el galactano EPS, lo que concuerda con Ye et al.9. La actividad de poder reductor de la galactana indica la potencial actividad antioxidante. Cuando se agrega ferricianuro de potasio [K3Fe (CN)6] en galactán EPS, los antioxidantes presentes se reducen a ferricianuro de potasio [K4Fe(CN)6]

Figura 2. Propiedades antioxidantes in vitro de la galactana. (A) Actividad de eliminación de radicales DPPH, (B) Ensayo de óxido nítrico, (C) Ensayo de poder reductor y (D) Actividad de eliminación de radicales hidroxilo de galactán EPS.

La actividad de eliminación de radicales hidroxilo de galactano se muestra en la Fig. 2D. Galactan mostró 41,93 por ciento como la actividad más alta, mientras que 58,10 por ciento por el estándar a la misma concentración (1 mg/mL). La tendencia de los resultados está de acuerdo con informes anteriores para EPS de Lactobacillus plantarum C88 (85,21 % para una concentración de 4 mg/ml de EPS)62 y Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 % para una concentración de 1 mg/ml de EPS)63. En comparación con los estándares, el galactano mostró una eficiencia del 72,16 %, mientras que el EPS de Lactobacillus plantarum C8862 y Paenibacillus polymyxa EJS-363 mostró una eficiencia del 95,19 y el 68,55 %, respectivamente.

Propiedades antioxidantes in vivo del galactano EPS en un modelo de levadura. Informes anteriores han mostrado diferentes propiedades biológicas que promueven la salud, como actividades antiproliferativas, antiulcerosas, reductoras del colesterol, antioxidantes, antiinflamatorias e inmunomoduladoras del EPS derivado de LAB64. Desde este punto de vista, se vuelve importante evaluar en detalle el efecto antioxidante de los EPS que podría apoyar su potencial prebiótico y/o probiótico, principalmente para mantener la homeostasis intestinal aliviando el estrés oxidativo. La maquinaria antioxidante celular juega un papel fundamental en el alivio de las inevitables ROS generadas a través de vías metabólicas celulares cruciales. El desequilibrio entre la defensa antioxidante innata de la célula y las ROS generadas puede ser muy perjudicial para las células. El estrés oxidativo severo causa daño potencial a los componentes vitales celulares, proteínas, ácidos nucleicos y moléculas de lípidos que, a su vez, afecta muchas vías de señalización esenciales e induce la apoptosis. Se ha demostrado que la ingesta dietética de antioxidantes reduce la frecuencia de los marcadores de daño celular, como los niveles de ROS, el daño del ADN mediado por ROS, la apoptosis y la transformación celular, lo que da como resultado una menor incidencia de los trastornos asociados con la edad65 EPS microbianos como xantano y levanos han demostrado actividad antioxidante en ensayos in vitro (ensayos de radicales hidroxilo y DPPH)5 y contra células de cáncer gástrico humano BGC-823, respectivamente66. Anteriormente, en este estudio, evaluamos los efectos antioxidantes, antiapoptóticos y antienvejecimiento ejercidos por el galactano EPS aislado de W. confusa KR780676 utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae BY4741 como organismo modelo.

Efecto del EPS sobre el crecimiento de la levadura. Las células de levadura de tipo salvaje tratadas con diferentes concentraciones de EPS no mostraron ningún defecto de crecimiento, lo que confirma que la galactana no indujo ninguna citotoxicidad ni defectos de crecimiento en ninguna de las concentraciones que oscilaron entre 0 y 400 ug/mL (Fig. 3A ). Las células tratadas con 300 ug/mL o una concentración mayor de galactano mostraron un crecimiento significativamente mayor, lo que indica que el galactano tenía actividad estimuladora del crecimiento de la levadura.

Se utiliza una concentración de galactano de 300 ug/mL para experimentos posteriores con cepas de levadura. Galactan reduce la actividad de la enzima SOD. Después de la fuerte actividad antioxidante in vitro mostrada por el galactano EPS, se sometió a un análisis adicional de su efecto sobre la actividad de SOD en las células WT de levadura. Nuestros resultados (Fig. 3B) muestran que el estrés oxidativo inducido por el tratamiento con H2O2 provocó un fuerte aumento en la actividad de SOD de las células WT tratadas con H2O2- en comparación con las células no tratadas. Por el contrario, el pretratamiento con galactana de las células WT seguido de la exposición a H2O2 dio como resultado una reducción del doble en la actividad de SOD en comparación con las células tratadas con H2O2 solo, lo que indica que la galactana ayuda a las células de levadura a controlar la actividad oxidativa inducida por radicales superóxido. estrés47,67.

Estrés oxidativoinducida por el tratamiento con peróxido activa la enzima superóxido y un cambio en el nivel de actividad de SOD es una medida directa del nivel de estrés oxidativo celular. En este estudio se utilizó el método de reducción de NBT, donde NBT es un indicador de la producción de radicales superóxido. La inhibición de la reducción de NBT es una medida directa de SOD. Dado que SOD compite con NBT por los radicales superóxido generados al exponer la riboflavina a la luz visible en presencia de oxígeno y metionina, que es un donante de electrones. El superóxido reduce el NBT a un producto de color azul, formazán, que puede medirse colorimétricamente a 560 nm.

Informes anteriores indican que LAB EPS ha ejercido un efecto antioxidante de manera dependiente de la concentración en ensayos in vitro y en líneas celulares de cáncer de colon y modelos in vivo. La capacidad del EPS para eliminar las ROS podría atribuirse a sus diversos grupos químicos68. Se ha demostrado que otros EPS (500 µg/ml) de Bacillus amyl liquefacient influyen en gran medida en la actividad de SOD y protegen las células HepG2 del estrés oxidativo inducido por H2O2 68. De manera similar, el EPS de L. plantarum mostró un efecto dependiente de la concentración sobre la actividad de SOD en células Caco2 contra el estrés oxidativo inducido por H2O2-69. Nuestros resultados, en concordancia con estos informes, muestran que el pretratamiento con EPS de galactana elimina los radicales superóxido inducidos por el tratamiento con H2O2 en células WT de levadura.

EPS disminuye la peroxidación lipídica celular. El malondialdehído (MDA) es el biomarcador de peroxidación lipídica celular más estudiado que indica el nivel de estrés oxidativo. El MDA es un dialdehído químicamente estable y altamente reactivo que puede unirse fácilmente a proteínas, ácidos nucleicos y lipoproteínas. Es altamente mutagénico y puede afectar en gran medida las propiedades bioquímicas de estas biomoléculas, lo que es perjudicial para varias vías de señalización70. Un aumento en los niveles de MDA es un indicador de daño tisular inducido por ROS y sus niveles aumentados se detectan en varias patologías humanas46. En este estudio, para examinar cómo el pretratamiento con EPS influye en la peroxidación de lípidos inducida por H2O2 en células WT de levadura, se estimaron los niveles de MDA. Los resultados mostraron una reducción de aproximadamente 1,5- veces en el nivel de MDA en células pretratadas con EPS, en comparación con aquellas expuestas a H2O2 solo, como se muestra en la Fig. 3C.

Previamente, se ha demostrado que el EPS de L. plantarum C88 reduce los niveles de MDA inducidos por el tratamiento con H2O2, de manera dependiente de la dosis (50-200 ug/ml) en células Caco2, lo que indica que la lesión de la membrana de las células intestinales inducida por peróxido puede aliviarse con la suplementación de EPS69 (zhang 2013). Además, 500 ug/ml de EPS de B. amyloliquefaciens redujeron significativamente la MDA inducida por H2O2-en células HepG271. Nuestros resultados sobre los niveles de MDA inducidos por H2O2-en células de levadura y su reducción significativa después del pretratamiento de las células con galactano EPS indican que el tratamiento con galactano EPS reduce la peroxidación lipídica celular inducida por ROS y, a su vez, puede proteger el células del daño tisular causado por los radicales peróxido y ayuda a mantener la integridad celular

experimentos *representa P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan protege mutantes de genes antioxidantes de levadura bajo estrés oxidativo. Para evaluar la capacidad antioxidante de la galactana, se trataron con galactana diferentes mutantes de levadura deficientes en genes antioxidantes (que carecen de varios genes de respuesta al estrés oxidativo) y luego se expusieron a una dosis subletal de H2O2 42. Mutantes de SOD (sod1∆ y sod2∆), catalasa (cta1∆ y ctt1∆), tiorredoxina peroxidasa (tsa1∆), glutatión reductasa (glr1∆) y óxido nítrico oxidorreductasa (yhb1∆) cuando se tratan con H2O2. mostró una supervivencia baja (sod1∆ 10,8 %, sod2∆ 13,17 %, tsa1∆ 13,55 %, cta1∆ 15,34 %, ct1∆ 17,06 %, glr1∆ 27,37 % y yhb1∆ 33,87 %) frente a WT. Por el contrario, con el pretratamiento con galactano, la tolerancia frente al estrés oxidativo aumentó en todos los mutantes deficientes en genes antioxidantes y su viabilidad aumentó significativamente (sod1∆ 78,43 %, sod2∆ 59,96 %, cta1∆ 87 %, ctt1∆ 87 %, tsa1 ∆ 72,73 por ciento, glr1∆ 75,26 por ciento y yhb1∆ 82,41 por ciento) como se muestra en la Fig. 4A. Estos resultados sugieren que la galactana puede eliminar eficazmente los radicales libres inducidos por H2O2 en mutantes que carecen de genes específicos de respuesta al estrés oxidativo y protege las células contra el estrés oxidativo. Se observó una protección similar en el ensayo puntual, donde la galactana rescató a los mutantes del estrés oxidativo y aumentó la viabilidad, como se muestra en la Fig. 4B.

Las células evolucionan con sistemas de defensa antioxidantes enzimáticos para resistir el estrés oxidativo endógeno causado por las ERO generadas a través de diversas reacciones fisiológicas, que de otro modo tendrían efectos nocivos sobre el bienestar de la célula. Los informes anteriores y nuestros resultados en este estudio sugieren que los EPS pueden eliminar las ROS y mejorar la viabilidad celular. Nuestros resultados con cepas mutantes de respuesta al estrés oxidativo de levadura sugieren que el tratamiento con galactano EPS elimina los radicales superóxido citosólicos y mitocondriales inducidos por el tratamiento con H2O2, como lo demuestra el aumento de la viabilidad de las cepas mutantes sod1∆ y sod2∆ de levadura, respectivamente. Las SOD son defensas antioxidantes enzimáticas primarias en las células contra el estrés oxidativo endógeno y exógeno y las mutaciones en estos genes se han implicado en el cáncer y los trastornos degenerativos. Asimismo, el rescate antioxidante de cta1∆ y ctt1∆ (mutantes de catalasa) por el tratamiento con EPS indica que el tratamiento con galactán EPS proporciona protección contra el estrés oxidativo peroxisomal y citosólico inducido por H2O2. La catalasa es responsable de la desintoxicación celular del peróxido de hidrógeno y su deficiencia se asocia con la aparición de trastornos relacionados con la edad. TSA1, la tiorredoxina peroxidasa es una proteína citoplasmática libre y asociada a los ribosomas que alivia a las células del estrés del peróxido de hidrógeno. Los informes sugieren que TSA1 también tiene un papel en la reparación del daño oxidativo del ADN. Nuestros resultados sugieren que el tratamiento con EPS rescata las células de levadura tsa1∆ del estrés inducido por peróxido. Las peroxirredoxinas de mamíferos tienen un efecto positivo sobre el crecimiento celular, el metabolismo y las funciones inmunitarias. Su deficiencia da como resultado un estrés oxidativo celular elevado que afecta las vías de señalización cruciales y está implicado en trastornos neurodegenerativos, tumores malignos y enfermedades inflamatorias 72. El mecanismo antioxidante del glutatión es otro sistema de defensa antioxidante enzimático de primera línea presente en las células para superar el estrés oxidativo. GLR1 es el homólogo en levadura de la glutatión reductasa de mamíferos, se localiza tanto en el citosol como en las mitocondrias73. Glr reduce el glutatión oxidado (GSSH) a glutatión reducido (GSH) y desempeña un papel en el mantenimiento de los niveles de GSH en las células, lo que a su vez desintoxica los radicales superóxido e hidróxido, protegiendo así a las células del estrés oxidativo74. Nuestros resultados muestran una alta sensibilidad de la levadura glr1∆ al H2O2 que se alivió con el pretratamiento con galactano EPS, lo que sugiere que galactano EPS podría proteger a las células con deficiencia de GLR1 del estrés oxidativo. Curiosamente, la deficiencia de glutatión reductasa se ha relacionado con el envejecimiento y los trastornos metabólicos, degenerativos y cardiovasculares relacionados con la edad75,76. Como se muestra en la Fig. 4A, yhb1∆ también estaba protegido por galactano EPS contra el estrés por H2O2, lo que sugiere que galactano EPS protege a las células que tienen deficiencia de YHB1 del estrés oxidativo. La levadura YHB1 es una hemoglobina favorita que se ha informado que protege a las células del estrés por óxido nítrico77 y el estrés oxidativo78. La evidencia sugiere que el homólogo humano de YHB1 parece rescatar a las células de la toxicidad de la alfa-sinucleína, que es un biomarcador de la enfermedad de Parkinson79. Estos hallazgos previos y nuestros resultados sugieren que el EPS puede promover la supervivencia celular frente al desarrollo de trastornos degenerativos.

Para evaluar el nivel de ROS en los mutantes de levadura con presencia y ausencia de galactano bajo estrés por H2O2, se observaron células de levadura bajo un microscopio de fluorescencia y se calculó el nivel de oxidación intracelular con un espectrofuorómetro47,48. Los mutantes de levadura tratados con H2O2 solo mostraron más células fluorescentes verdes en comparación con los tratados previamente con galactano. (Figura 4C). La intensidad de fluorescencia de DCF aumentó en aproximadamente un 60 %, mientras que con el pretratamiento con galactano, se redujo a aproximadamente un 30 % en mutantes de levadura tratados con H2O2- en comparación con WT y el control respectivo (Fig. 4D). Tanto los resultados microscópicos como los espectrofotométricos indican un mayor nivel de ROS en las células que carecen de genes antioxidantes específicos en comparación con los controles respectivos. Los cultivos pretratados con galactano y luego expuestos a H2O2 mostraron una fluorescencia disminuida en comparación con aquellos sin pretratamiento con galactano, lo que sugiere que el galactano redujo la exposición al H2O2 de inducción de ROS en células mutantes de levadura y promueve la supervivencia celular. En todos los experimentos anteriores, cuando las células se lavaron antes de la adición de H2O2 no mostraron un rescate significativo (datos complementarios), lo que indica que la eliminación de ROS por parte de la galactana se debe a la eliminación directa en el medio más que a la acción intracelular.