El estrés oxidativo, el metabolismo energético disfuncional y los neurotransmisores desestabilizadores alteraron el perfil metabólico cerebral en un modelo de rata de buceo de saturación de heliox simulado a 4.0 MPa

Abstracto

El objetivo principal del presente estudio fue determinar los cambios en el perfil metabólico en el cerebro de ratas después de un buceo saturado con heliox (HSD) simulado a 400 metros de agua de mar en comparación con los controles en blanco. Las alteraciones en el metaboloma polar en el cerebro de rata debido a HSD se investigaron en elcorteza, hipocampo, ytejido estriadomuestras mediante la aplicación de un enfoque metabolómico basado en RMN junto con detección bioquímica en la corteza. Elreducción de los niveles de glutatión y taurinapuede hipotéticamenteaumentar las defensas antioxidantesdurante el buceo de saturación, que también fue probado por elaumento del nivel de malondialdehído, eldisminución de la superóxido dismutasa, y eldisminución de la glutatión peroxidasaen la corteza. La disminución concomitante de las vías metabólicas aeróbicas y anaeróbicas comprendió un metabolismo energético regulado a la baja, lo que también se demostró mediante la cuantificación bioquímica de las enzimas metabólicas Na-K ATPasa y LDH en el tejido de la corteza cerebral. Elanormalidades metabólicas significativas de los neurotransmisores de aminoácidos, como GABA, glicina y aspartato, disminución de aminoácidos aromáticos, incluidostirosinay fenilalanina, ambos involucrados en lametabolismo de la dopaminay noradrenalina, que están reguladas a la baja en la corteza. En particular, una disminución en el aspartato de N-acetilo se asocia con daño neuronal. En resumen, la descompresión hiperbárica de un HSD de 400 msw afectó lametaboloma cerebralen un modelo de rata, que podría incluir una amplia gama de alteraciones de la homeostasis de los aminoácidos, metabolitos relacionados con el estrés oxidativo y el metabolismo energético, y componentes neurotransmisores desestabilizadores. Estosdisturbiospuede contribuir a laneuroquímicoyfenotipos neurológicos de HSD.

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Introducción

Se induce una presión alta por encima de 1,3 MPa (a aproximadamente 120-metros de agua de mar) en humanos y mamíferos con riesgo de cambios en el sistema nervioso central (SNC) [1, 2]. El SNC podría ser uno de los objetivos más sensibles a la presión atmosférica excesiva, las burbujas de gas en el cuerpo y la enfermedad por descompresión (DCS) causada por el buceo en aguas profundas. En tales condiciones, una serie de manifestaciones psicomotoras y cognitivas son altamente complejas, con temblores distales y proximales, anomalías electroencefalográficas, fasciculaciones, mioclonías, trastornos del sueño, náuseas, dolor de cabeza, mareos y disminución del rendimiento en las pruebas cognitivas [2–4]. Moen et al. midió las anomalías neurológicas regionales mediante resonancia magnética nuclear (RMN) ponderada por difusión y perfusión. Se encontraron déficits de perfusión en la función microvascular cerebral con microémbolos arteriales [5] en buceadores del Mar del Norte, lo que se demostró por la reducción del tiempo medio de transición debido a la reducción de la complejidad del sistema microvascular o capilar. Alvhild Alette Bjørkum et al. encontraron alteraciones en la homeostasis de las proteínas, por ejemplo, en vesículas sinápticas, y componentes del citoesqueleto desestabilizadores después del buceo con saturación de heliox en un modelo de rata. Sin embargo, Arvid Hope et al. informaron que no se observaron lesiones visibles del SNC de cambios morfológicos en la resonancia magnética en ratas con síntomas neurológicos masivos de enfermedad por descompresión después de la descompresión por saturación de heliox [6]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que podrían observarse alteraciones potenciales del perfil molecular detrás de anomalías fisiológicas tan significativas pero ambiguas en el tejido del SNC después de una inmersión de saturación con heliox.

La identificación de biomarcadores para monitorear el estado de los mecanismos fisiológicos celulares es importante para comprender los eventos bioquímicos. Siempre es un desafío considerar la complejidad y diversidad de rutas moleculares involucradas en la respuesta de los sistemas biológicos a diversos factores en un momento o condición específica. Los intentos anteriores de vincular biomarcadores individuales con la perturbación funcional del SNC han proporcionado cierta información sobre el daño oxidativo y la inmersión posterior a la saturación del metabolismo energético [3, 4, 7]. Del mismo modo, varios estudios han comparado los perfiles de neurotransmisores de aminoácidos de ratas con síndrome neurológico de alta presión con los de individuos sanos [2]. Ilustrar la huella digital metabólica neurológica del ocio del SNC podría favorecer las hipótesis etiológicas [8, 9], la prevención [10] y los enfoques terapéuticos [11]. Sin embargo, no se ha investigado la perturbación metabólica neurológica integrada inducida por una gran profundidad de buceo de saturación con heliox. Tal salida de información de sistemas biológicos complejos se puede registrar rápidamente gracias a los avances en los medios tecnológicos [12]. La aplicación de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de alta resolución puede proporcionar cantidades extremas de datos de perfiles metabólicos sólidos, pero interpretables y de alta complejidad. Los datos espectrales de biofluidos y extractos de metabolitos tisulares se pueden obtener mediante métodos quimiométricos y bioinformáticos para revelar información sobre el estado fisiológico o patológico. La espectroscopia de RMN brinda información cualitativa y cuantitativa inmediata sobre aproximadamente 102 moléculas pequeñas diferentes presentes en una muestra biológica. La detección por RMN permite un enfoque amplio e imparcial sin una selección a priori de rutas bioquímicas específicas. Además, la RMN permite análisis de alto rendimiento y alta reproducibilidad, y es una técnica intrínsecamente cuantitativa en un amplio rango dinámico debido a la respuesta lineal de las señales de RMN dentro de una concentración. Esta tecnología se ha aplicado con éxito a enfermedades neurológicas como la ataxia cerebelosa [13], la enfermedad de Huntington [14, 15] y la enfermedad de Alzheimer [16, 17] tanto en estudios preclínicos como clínicos.

A pesar de la prometedora aplicabilidad de la metabolómica basada en RMN, no se ha informado su aplicación para evaluar los efectos de perturbación metabólica del sistema nervioso central del buceo de saturación con heliox. El objetivo del presente estudio fue investigar los cambios metabolómicos en diferentes compartimentos anatómicos del cerebro (corteza, hipocampo y cuerpo estriado) y los cambios en el nivel del índice bioquímico en la corteza en un modelo de rata después de un buceo de saturación con heliox de 400 metros simulados de agua de mar (MSW). , como se muestra en el diseño experimental esquemático de la presente investigación en la Fig. 1. La ilustración de la huella digital metabólica del órgano objetivo podría proporcionar un conjunto de biomarcadores disponibles que podrían contribuir a mejorar los procedimientos de buceo.

Fig 1. Diseño experimental esquemático de la presente investigación.

Procedimientos experimentales

Confirmamos que hemos leído la posición de la Revista sobre los temas relacionados con la publicación ética y afirmamos que este informe es consistente con esas pautas.

Reactivos y materiales El cloruro de sodio de grado analítico, DMSO, NaN3, NaH2PO4•2H2O y Na2HPO4•12H2O se adquirieron de Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China). Se obtuvieron CHCl3 y CH3OH de grado HPLC de Merck (Darmstadt, Alemania). Sigma-Aldrich proporcionó D2O (99,9 por ciento en D) que contiene 3-(trimetil-silil) propionato de sodio-2, 2, 3, 3, d4 (TSP) como estándar interno para referencia de desplazamiento químico. (Missouri, EE. UU.). Se preparó un sistema tampón que contenía 0.2 M Na2HPO4/NaH2PO4 en D2O a pH 7.4 para evitar el efecto del pH en los cambios químicos de los metabolitos a diferentes concentraciones. Los kits de ensayo para la determinación de sodio-potasio ATPasa (Na-K-ATPasa), colinesterasa (AChE) y lactato deshidrogenasa (LDH) se adquirieron de Abcam (EE. UU.). Los kits de ensayo para dopamina (DA) se adquirieron de RD, EE. UU., los kits de ensayo para epinefrina (E) y norepinefrina (NE) fueron de Abnova, Taiwán, los kits de ensayo de 5-hidroxitriptamina (5HT) fueron de BioSource y Los kits de ensayo de ácido gamma-aminobutírico (GABA) procedían de Santa Cruz, EE. UU. Los kits de ensayo de superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA) y glutatión peroxidasa (GPx) se adquirieron en Cayman, EE. UU.

Aprobación ética

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico Naval de PLA, Universidad Médica Naval (aprobación n.º: SYXK (Shanghái)2017-0019, año de aprobación: 2020). Todos los animales recibieron un buen cuidado de acuerdo a la Guía de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica Naval. Confirmamos que todos los métodos se informan de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org) para el informe de experimentos con animales. Los participantes investigados en este estudio fueron ratas, no humanos; por lo tanto, no hubo consentimiento para participar.

Diseño de animales y agrupaciones.

En esta investigación se incluyeron ratas Sprague-Dawley macho adultas con una edad promedio de 8 semanas y un peso de 200-220 g. Los animales se adquirieron de Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China). Se realizaron los máximos esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales y el número de animales necesarios para capturar datos fiables. Todos los animales disponían de alimento estándar para ratas y agua potable ad libitum. Los animales con 3 ratas por jaula se alojaron en una sala para animales libre de patógenos específicos (SPF) (temperatura, 22–24 ˚C, humedad, 45–55 por ciento) y condiciones de luz controladas (ciclo de luz-oscuridad de 12/12 horas) durante una semana antes del experimento. Antes del comienzo de los experimentos de buceo, las ratas se aclimataron durante cinco días en el entorno del laboratorio, incluida una cámara hiperbárica. Dieciséis ratas fueron pesadas, etiquetadas, restringidas y asignadas aleatoriamente a un grupo de control (exposición al aire normobárico pero soportando luz y ruido similares, denominado grupo CON, n=8) y un grupo experimental (sometido a un buceo de saturación con heliox simulado para 4,0 MPa (400 msw), denominado grupo HSD, n=8).

Buceo de saturación estimulado de 400 msw

Las ratas del grupo HSD se presurizaron con gas helio-oxígeno en una cámara hiperbárica. En resumen, se incluyeron cuatro fases de compresión, almacenamiento, descompresión y control de flexión en

el período de saturación. La tasa de compresión de la rata fue de 1 msw/min hasta 10 msw con mezclas de gases con un 20 % de He O y de 3,54 msw/min desde 10 msw hasta 400 msw con He puro. La compresión del tiempo desde la superficie hasta los 400 msw tomó aproximadamente 120 minutos. La fase inferior a 400 msw fue de 120 minutos. La concentración de oxígeno se complementó con oxígeno puro para mantener la presión parcial de oxígeno entre 35 y 50 kPa durante el proceso de compresión y la profundidad de almacenamiento. El período de vigilancia de la curva de descompresión fue de 40 min a 300 msw, 45 min a 200 msw, 50 min a 105 msw, 60 min a 45 msw, 75 min a 10 msw, 75 min a 3 msw y luego en la superficie. La velocidad de ascenso utilizada en este modelo de descompresión es de aproximadamente 10 metros (33 pies) por minuto. la presión parcial de oxígeno se mantuvo entre 38 y 67 kPa durante la etapa de descompresión. Después de la descompresión a 10 m, la concentración de oxígeno se mantuvo en 20~24 por ciento. La descripción general de la línea de tiempo del buceo de saturación se muestra en la Fig. 2. Las ratas en el grupo de control de aire (Grupo CON, llamado grupo de control, con ocho ratas) se criaron dentro del entorno atmosférico en el mismo laboratorio experimental con la misma cámara que los grupos HSD. El grupo de control no recibió ningún procedimiento de compresión o descompresión, pero soportó un ruido y una luz similares a los del grupo HSD.

Coleccion de muestra

Después del período de descompresión, las ratas se anestesiaron con pentobarbital sódico ({{0}},3 por ciento, 1,0 ml/kg de peso de rata) por vía intraperitoneal, seguido de la extracción del cerebro. Los hemisferios cerebrales izquierdos fueron rápidamente disecados. En dos grupos de animales, los tejidos de la corteza, el hipocampo y el cuerpo estriado se diseccionaron y se abreviaron respectivamente como HSDC, HSDH, HSDS, CONC, CONH y CONS. Como el tejido más grande entre los tres compartimentos, cada muestra de corteza se cortó luego en dos piezas con pesos aproximadamente iguales (una parte de la muestra para análisis metabolómico, las otras piezas de muestras para evaluaciones bioquímicas). Todos los tejidos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su posterior análisis.

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