El estrés oxidativo es uno de los precursores significativos de diversas enfermedades metabólicas, parte 2

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3. Discusión

Los radicales libres pueden atacar las proteínas, los lípidos o el ADN para obtener un electrón, lo que provoca varios problemas de salud. Por ello, es fundamental equilibrar el sistema antioxidante del organismo y los radicales libres formados por la oxidación. En caso de deterioro de este equilibrio, surge el estrés oxidativo [29]. El estrés oxidativo es uno de los principales factores que dan lugar a diversos trastornos crónicos como el cáncer, la diabetes, las enfermedades cardiovasculares, la enfermedad de Alzheimer, etc. Si bien existen sistemas autoantioxidantes en el cuerpo humano para combatir el daño oxidativo en los tejidos y órganos, estos sistemas de defensa los sistemas pueden perder su eficiencia debido a diferentes condiciones, como el consumo excesivo de alcohol, el tabaquismo, el estrés, el uso crónico de drogas y la radiación, etc. [30]. Varios informes científicos han indicado que los metabolitos secundarios de las plantas juegan un papel importante en la prevención del estrés oxidativo y sus efectos nocivos [13,14,31] Si bien la biodisponibilidad es un parámetro importante que afecta la bioactividad de estos compuestos, no se ha tenido en cuenta en la mayoría de los estudios. Sin embargo, es bien sabido que los metabolitos secundarios están sujetos a transformaciones estructurales debido a diferentes condiciones de pH, actividad enzimática y temperatura corporal en el sistema gastrointestinal. Además, las características químicas de los metabolitos secundarios, como el peso molecular, la polaridad y el grado de unión a las macromoléculas en la matriz vegetal, también son factores importantes que afectan su biodisponibilidad [13]. En consecuencia, la absorción de los compuestos o sus metabolitos en el torrente sanguíneo una vez ingeridos es esencial para ejercer sus efectos fisiológicos sistémicos. Los modelos de simulación de digestión in vitro pueden proporcionar evidencia para la evaluación de las posibles características de biodisponibilidad de las sustancias. Si bien es necesaria la confirmación en ensayos en humanos para reclamar cualquier propiedad funcional, los modelos de simulación in vitro se utilizan ampliamente como alternativas a los estudios in vivo o ensayos en humanos, que a menudo son éticamente discutibles, requieren muchos recursos, son costosos y consumen mucho tiempo [32].

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Varios investigadores también han investigado el potencial antioxidante de extractos preparados a partir de diferentes órganos de especies de Cistus. Según la revisión de la literatura, este es el primer estudio sobre especies de Cistus con respecto a la biodisponibilidad de sustancias fenólicas y su impacto en la actividad antioxidante mediante el empleo de un modelo de simulación de digestión in vitro. Karas et al. [33] sugirieron que el 10 por ciento de los componentes polifenólicos permanecen sin digerir en la matriz vegetal y el 90 por ciento de ellos se someten a digestión en la fase gástrica o intestinal (aproximadamente el 48 por ciento y el 52 por ciento, respectivamente). Como se mencionó anteriormente, todas las cantidades de fenoles en los extractos acuosos se vieron afectadas negativamente por el procedimiento de simulación de digestión humana in vitro. Así, se detectaron pérdidas significativas en el contenido fenólico de las muestras biodisponibles de todos los extractos. Además, las concentraciones totales de proantocianidina de las muestras IN estaban por debajo del límite de detección en todos los extractos acuosos. Varios estudios también señalaron la influencia negativa del procedimiento de digestión en los compuestos fenólicos en los extractos de plantas y, por lo tanto, en las bioactividades relacionadas. Por ejemplo, reportamos el contenido fenólico total de Salvia virgata Jacq. también se vio afectado negativamente por el procedimiento de digestión en nuestro estudio anterior. Además, las cantidades de los principales metabolitos del extracto, es decir, la rutina y el ácido rosmarínico, tendieron a disminuir [13]. En contraste, varios estudios han reportado resultados contradictorios. En el estudio de Celeb et al. [34], observaron el incremento de las cantidades de ácido fenólico total, flavonoides y fenoles en las muestras biodisponibles de extracto metanólico de Hypericum perfoliatum L. De hecho, los principales metabolitos, quercitrina, clorogénico y ácido gálico, tenían índices de bioaccesibilidad superiores a 100 por ciento Estos estudios mostraron que los efectos del procedimiento de digestión pueden variar según los materiales vegetales. Para aclarar estas diferencias, es fundamental considerar el mecanismo de acción del sistema de digestión sobre las sustancias fenólicas. (beneficios de los bioflavonoides) Serra et al.[35] sugirieron que los compuestos fenólicos se encuentran principalmente en glucósidos, polímeros y formas de éster en la matriz vegetal y se hidrolizan en el sistema digestivo antes de la absorción. Varios factores pueden influir en las transformaciones estructurales de los compuestos fenólicos en el tracto gastrointestinal. Por ejemplo, los compuestos con pesos moleculares más altos, como las proantocianidinas o procianidinas, deben hidrolizarse antes de la absorción en el intestino. La estructura de la matriz vegetal también es un factor destacado en la biodisponibilidad de los compuestos fenólicos; (comprar cistancheLos compuestos fenólicos pueden unirse a macromoléculas en la matriz vegetal, como fibras, proteínas y moléculas de lípidos. Por lo tanto, solo los componentes fenólicos liberados de la matriz pueden volverse absorbibles del tracto gastrointestinal. Además, los diferentes valores de pH y las acciones enzimáticas de la microbiota intestinal se encuentran entre otros factores cruciales que afectan la transformación en la estructura química de los compuestos fenólicos [36]. A la luz de estos datos, podemos plantear la hipótesis de que los diferentes resultados obtenidos de tipos similares de estudios experimentales pueden deberse a la complejidad del sistema de digestión y la composición de la matriz vegetal. Como se presenta en la Tabla 3, las muestras biodisponibles de extractos de Cistus exhibieron una actividad antioxidante más débil que las contrapartes no digeridas y posgástricas debido a su menor contenido fenólico.

Cistanchepuedenmejorar la inmunidad

Además, ambos extractos de C. saluifolius mostraron una mejor actividad antioxidante en los ensayos DPPH, CUPRAC, FRAP y TOAC en comparación con otras especies. Además, ambos extractos de C. paroifforus mostraron una mayor actividad secuestrante de radicales DMPD que los extractos de otras especies. Como se indica en la Tabla 1, los fenoles totales, flavonoides,bienfaits de cistanchey los contenidos de ácido fenólico de C. salviifolius fueron más altos que en las otras muestras. Por lo tanto, el mayor potencial antioxidante de los extractos de C. salviifolius puede estar relacionado con su contenido fenólico.

Además, la reducción de los potenciales antioxidantes, las actividades inhibidoras de las enzimas relacionadas con los carbohidratos y los AGE de las muestras biodisponibles pueden estar relacionados con la disminución de los glucósidos flavonoides marcadores. Sin embargo, los extractos de Cistus también contenían otras sustancias fenólicas, como se indica en la Figura 1. Por lo tanto, se requiere un análisis cromatográfico detallado de los extractos para monitorear la influencia de la digestión en la actividad biológica.

Recientemente, el potencial inhibitorio de los extractos de plantas sobre las enzimas digestivas ha atraído más atención debido a la preocupación por la seguridad de los inhibidores sintéticos. Por lo tanto, el efecto inhibitorio de los extractos de plantas se determinó en varios estudios, y este efecto generalmente se asoció con sustancias fenólicas como flavonoides, ácidos fenólicos, proantocianidinas, etc. Sun et al. [37] sugirió que los compuestos polifenólicos muestran sus efectos inhibidores al unirse a las enzimas mencionadas anteriormente con la ayuda de fuerzas hidrofóbicas y enlaces no covalentes. Por lo tanto, la inhibición de la actividad de las enzimas o-amilasa y a-glucosidasa por parte de los polifenoles está relacionada con sus estructuras moleculares. Si bien este mecanismo de interacción se ha estudiado utilizando diferentes técnicas, como la cinética de inhibición, el acoplamiento molecular, la extinción de la fluorescencia, etc., aún no se ha obtenido una conclusión cierta [38]. Sin embargo, numerosos estudios han informado que las inhibiciones de las enzimas digestivas de los extractos de plantas están directamente relacionadas con su contenido fenólico. También se han informado previamente estudios similares sobre las actividades inhibidoras de enzimas de especies de Cistus. Sayah et al. [39] investigaron las actividades inhibidoras de -amilasa y -glucosidasa del 8{{10}} por ciento de extractos metanólicos y acuosos de C. monspeliensis y C. saluifolius. Sus resultados estuvieron de acuerdo con el presente estudio, revelando que el extracto acuoso de C. salvifolius demostró una mayor o-glucosidasa (ICso ug/mL:0.95±0.14) y -amilasa (IC5{ {55}} ug/mL:217.1±0.15) de actividad inhibitoria que el extracto acuoso de C. monspeliensis （IC50 ug/mL∶ 14.58±1.26） y （IC50 4g/mL:886.10±0.10), respectivamente. Las tasas de inhibición de ambos extractos acuosos sobre estas enzimas fueron más altas que las del compuesto de referencia acarbosa (ICso ug/mL:18.01±2.00) Similar a nuestro estudio, encontraron una correlación con las tasas de inhibición de la enzima y el total cantidades de fenoles y flavonoides. Tanto el contenido total de fenoles como el total de flavonoides del extracto acuoso de C. saloijfolius (408,43±1,09 mg GAE y 140.00±1,15 RE, respectivamente) fueron superiores a los del extracto acuoso de C. monspeliensis (261,76±1,9 mg GAE y 78.00±1.15 RE respectivamente). Orhan et al. [40] también investigó los potenciales inhibidores de las enzimas digestivas del 80 por ciento de los extractos acuosos y etanólicos de las hojas de C. laurifolius. Según sus resultados, el 80 % del extracto etanólico (71,7 % ±0,6) mostró una fuerte actividad inhibidora de la -amilasa en comparación con el extracto acuoso (39,3 % ±2,2) a una concentración de 1 mg/ml. Sugirieron que los compuestos fenólicos, especialmente los flavonoides, afectan directamente la secreción de insulina al prevenir la apoptosis de las células beta y respaldar la actividad antidiabética. Esta hipótesis, correlacionada con nuestros resultados, marca que la muestra ND de extractos acuosos de C. salviifolius ejerció los mayores contenidos totales de flavonoides y fenoles y las mayores actividades inhibidoras de -amilasa y o-glucosidasa. Como se indica en la Tabla 4, el extracto acuoso de C. salviifolius exhibió mejores actividades inhibidoras sobre las enzimas digestivas que los otros extractos. Además,colesterol cistancheLas muestras IN de los extractos acuosos contenían cantidades más bajas de fenoles y flavonoides que las muestras ND y, por lo tanto, revelaron actividades inhibitorias enzimáticas más bajas en el presente trabajo. Si bien el contenido fenólico de los extractos se vio afectado negativamente por el procedimiento de digestión, aún exhibieron una actividad inhibidora de enzimas digestivas significativa. En varios estudios, los glucósidos flavonoides se informaron como los principales metabolitos de los extractos de plantas con fuertes potenciales inhibidores de -amilasa y -glucosidasa. Se han realizado estudios de relación de actividad sobre algunos componentes fenólicos como flavonoides, ácidos fenólicos, proantocianidinas y taninos. Los estudios de relación estructura-actividad sobre los flavonoides mostraron que el doble enlace C2=C3 del anillo C mejora el potencial de inhibición de las enzimas digestivas de dichos compuestos. Dado que este enlace eleva la densidad de electrones, aumenta la fuerza de interacción entre el flavonoide y la enzima [44]. Además, los grupos hidroxilo en C-5 y C-7 facilitan el potencial inhibidor de la -amilasa de los flavonoides. También se sugirió que la hidroxilación del esqueleto de los flavonoides afecta positivamente sus potenciales inhibidores de las enzimas a-amilasa y -glucosidasa [45]. Como se indicó anteriormente, todos los flavonoides marcadores en el presente estudio eran glucósidos de flavonol que tenían estos requisitos estructurales descritos anteriormente. Sin embargo, después del procedimiento de digestión in vitro, sus actividades relacionadas disminuyeron significativamente en las muestras biodisponibles de los extractos acuosos.

En general, el potencial inhibitorio de los extractos de plantas sobre los AGE está relacionado con varios factores, es decir, su contenido fenólico, potencial antioxidante, capacidades de quelación de metales, interacciones de proteínas y actividades de bloqueo del receptor de AGE [13]. Como se presenta en la Tabla 4, las muestras biodisponibles de los extractos acuosos mostraron actividades inhibidoras de AGE más bajas en comparación con las muestras ND, ya que el procedimiento de digestión in vitro afectó negativamente el contenido de fenoles de los extractos. De acuerdo con los resultados del estudio actual, la muestra ND de extracto acuoso de C. (cistanche y tongkat ali reddit) saluifolius poseía la actividad inhibidora de AGE más alta, así como el contenido total de fenoles y flavonoides. En comparación, la muestra IN de extracto acuoso de C. monspeliensis mostró el potencial de inhibición de AGE más débil, lo que puede atribuirse a su contenido total más bajo de flavonoides y fenoles. Dado que los flavonoides tienen una amplia distribución en extractos de plantas, frutas, verduras y bebidas, se han intensificado varios estudios sobre el potencial de inhibición de los flavonoides en las formaciones de AGE. Los mismos flavonoides asignados como marcadores fenólicos en este estudio también se informaron como compuestos marcadores en otros estudios[46-48].

Similar a la inhibición de las enzimas digestivas, las actividades inhibidoras de AGE de los flavonoides fueron estimuladas por el doble enlace C2=C3 y la hidroxilación de los anillos A y C. Sin embargo, la unión del azúcar al esqueleto de flavonoides conduce a una disminución de la actividad inhibidora [49]. Por otro lado, Cervantes-Lauren et al.[50] sugirió que el flavon-3-de los glucósidos poseía un mayor potencial de inhibición de AGE que los otros glucósidos flavonoides. Esta hipótesis puede ser una explicación de la disminución de la inhibición de AGE en muestras biodisponibles. Por ejemplo, no se detectaron quercitrina e hiperósido en muestras biodisponibles del extracto acuoso de C. monspeliensis, lo que explica la menor actividad de las muestras IN de C. monspeliensis en comparación con los extractos de otras especies. Aunque no se detectó quercitrina en el extracto acuoso de C. saloifolius, cantidades significativamente más altas de hiperósido y salidrosido pueden ser la causa de su alta actividad de inhibición de AGE. En general, se observó una correlación positiva entre los contenidos de flavonoides marcadores de las muestras y sus potenciales inhibitorios sobre los AGE.

4. Material y Métodos

4.1.Químicos

Todas las referencias, enzimas y productos químicos empleados en los experimentos se adquirieron de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EE. UU.). En los experimentos se utilizaron materiales de grado analítico.

4.2.Muestras de plantas

Se recolectaron partes aéreas de C.creticus y C.saloifolius del campus de la Universidad de Yeditepe (Kayisdagi, Estambul) durante la última semana de abril de 2018. Se recolectaron partes aéreas de C.mon-speliensis y C. paroiflorus cerca de Alacant Kutlu Aktas Balaji, Cesme, Izmir en la segunda semana de mayo de 2018. Se recolectaron partes aéreas de C. laurifolius de la carretera Kemer-Doganhisar, Konya, en la primera semana de junio de 2018. El Prof. Dr. Erdem Yesilada autenticó los materiales vegetales. Se almacenaron especímenes de C. creticus (YEF18013), C. Lauri folium (YEF18017), C. monspeliensis (YEF18015), C. paroiflorus (YEF18016) y C. salvifolius (YEF18014) en el Herbario del Departamento de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia, Universidad Yeditepe, Estambul, Turquía. 4.3.Procedimiento de extracción

Se optó por la extracción acuosa ya que se utiliza comúnmente como técnica de preparación en la medicina tradicional. Las partes aéreas de la especie Cistus (100 g) se secaron al aire y se pulverizaron con agua destilada caliente (80 grados, 1,5 L) utilizando un dispositivo de agitación durante 15 min. Luego, los extractos acuosos se filtraron a través de un papel de filtro y se evaporaron a sequedad bajo presión reducida. Después de completar el procedimiento de liofilización, los extractos se disolvieron en agua destilada para su posterior procesamiento (muestra no digerida: ND) (rendimiento de extractos: 13,04 % para C.creticus, 15,7 % para C.laurifolus, 12,8 % para C.monspeliensis ,14,94 por ciento para C.parviflorus, 14,74 por ciento para C.salvifolius). 4.4.Método de simulación de digestión humana in vitro

El modelo de simulación de digestión humana se aplicó a muestras de Cistus in vitro, siguiendo el método detallado anteriormente por Celeb et al.[34]. En primer lugar, se disolvieron 1 g de NaCl y 1,6 g de pepsina en 500 mL de agua destilada para obtener una solución de fluido gástrico simulado (SGF). Posteriormente, el pH de la solución de SGF se ajustó a 2 con HCl (5 M); 17,5 mL de esta solución se mezcló con 2,5 mL de muestras de plantas, y esta mezcla se colocó en el baño de agua con agitación a 37 grados durante 2 h para imitar los movimientos peristálticos del sistema de digestión. Después de 2 h, las muestras se colocaron en un baño de hielo para inactivar las reacciones enzimáticas; se reservaron 2 ml de las muestras como muestra "postgástrica" ​​(PG) para experimentos posteriores. Se colocó una membrana de diálisis celulósica cargada con una cantidad adecuada de NaHCO3 (1 M, pH 7) en las soluciones de muestra frías; por tanto, se mimetizó la absorción gastrointestinal. Luego, se combinaron 4,5 ml de solución de ácidos biliares/pancreatina con las soluciones, y la mezcla se incubó durante otras 2 horas a 37 grados. Finalmente, el fluido dentro de la membrana de diálisis se adquirió como muestra "biodisponible" (IN). Una vez finalizado el procedimiento, todas las muestras se conservaron a -20 grados para realizar más experimentos. 4.5.Estimación in vitro del perfil fenólico 4.5.1. Ensayo de contenido fenólico total La determinación espectrofotométrica del contenido fenólico total de las muestras se realizó en una plantilla de placa de pocillos 96-de acuerdo con el método detallado anteriormente por Barak et al.【32】;75 uL de NagCO3（20 por ciento en H2O ） se añadió a 20 μL de muestras recién preparadas y soluciones de referencia. Luego, se combinaron con la mezcla 100 μL del reactivo de Folin-Ciocalteu. Después de un período de incubación de 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad, se midió la absorbancia a 690 nm. El ácido gálico se utilizó como solución de referencia a diferentes concentraciones para establecer una curva de calibración y los contenidos fenólicos totales se expresaron como equivalentes de ácido gálico (GAE). 4.5.2. Ensayo del contenido total de flavonoides La determinación espectrofotométrica del contenido total de flavonoides de las muestras se realizó en una plantilla de placa de pocillos 96-de acuerdo con el método explicado anteriormente por Bardakci et al. 【51】;150 μL de etanol al 75 %, 10 μL de cloruro de aluminio y 10 μL de trihidrato de acetato de sodio 1 M se combinaron con 50 μL de soluciones de muestra y de referencia, por separado. Luego, estas mezclas se incubaron a temperatura de cuarto oscuro durante 30 min. Después del período de incubación, se calculó la absorbancia a 405 nm. Se empleó quercetina como solución de referencia a diferentes concentraciones para establecer una curva de calibración y los contenidos totales de flavonoides se representaron como equivalentes de quercetina (QE).

4.5.3. Ensayo de contenido de ácido fenólico total

El contenido total de ácido fenólico de las muestras se midió espectrofotométricamente siguiendo el procedimiento informado anteriormente por Barak et al. [52]. En primer lugar, se disolvieron cantidades adecuadas de nitrito de sodio y molibdato de sodio en agua destilada para obtener el reactivo de Arnow. Luego, 1 ml de las muestras se combinó con 1 ml de reactivo de Arnow, 1 ml de 0.1 M HCl y 1 ml de 1 M NaOH, por separado. Posteriormente se ajustó el volumen de la mezcla a 10 ml con agua destilada y se leyó inmediatamente la absorbancia a 490 nm. El ácido cafeico se empleó como solución de referencia a diferentes concentraciones para obtener una curva de calibración, y los contenidos totales de ácido fenólico se dieron como equivalentes de ácido cafeico (CAE).

4.5.4. Ensayo de contenido de proantocianidina total

La determinación espectrofotométrica del contenido total de proantocianidina de las muestras se realizó en una plantilla de placa de pocillos 96-siguiendo el método de Barak et al. [11]. Brevemente, se mezclaron 25 uL de las soluciones de muestra con 150 uL de vainillina al 4 por ciento y 75 uL de soluciones de HCl (32 por ciento), respectivamente. Después de un tiempo de incubación de 15 min a temperatura de cuarto oscuro, la absorbancia se ajustó a 492 nm. El hidrato de catequina se utilizó como solución de referencia a diferentes concentraciones para obtener una curva de calibración. Se empleó metanol como solución de control. El contenido total de proantocianidina de las muestras se expresó como equivalentes de catequina (CE).

4.6.Ensayos de actividad de eliminación de radicales libres 4.6.1.Ensayo de actividad de eliminación de radicales DPPH

La actividad de captación de radicales DPPH de las muestras se determinó en una plantilla de placa de pocillos 96- siguiendo el método modificado por Celeb et al.[53]. En primer lugar, se prepararon 150 uM de solución de DPPH recién preparada. Luego, se mezclaron 200 μL de solución de DPPH con 25 μL de soluciones de muestra. Luego, esta mezcla se incubó a temperatura de cuarto oscuro durante 50 min. La absorbancia se calculó a 540 nm. Se empleó hidroxitolueno butilado (BHT) como solución de referencia a diferentes concentraciones. Se utilizó metanol como solución de control. La actividad de las muestras se presentó como EC50, correspondiente a la concentración que muestra una actividad del 50 por ciento.

4.6.2.Ensayo de actividad de captación de radicales de DMPD

La actividad de captación de radicales DMPD* (N, N-dimetil-p-fenilendiamina) de las muestras se llevó a cabo en una plantilla de placa de pocillos 96-de acuerdo con el método descrito anteriormente por Inan et al. [13]. En primer lugar, DMPD 10{{10}} mM más solución, FeCl 0,05 M; La solución de 6H2O y el tampón de acetato 0,01 M se prepararon recientemente. Luego, se mezclaron 1 mL de solución de DMPD, 100 mL de tampón de acetato y 0.2 mL de solución de FeCl3-6H2O, y luego se combinaron 15 uL de soluciones de muestra con 210 μL de esta mezcla. Después del período de incubación a temperatura ambiente oscuro durante 50 min, se midió la absorbancia a 492 nm. Se utilizó Trolox como solución de referencia a diferentes concentraciones para obtener una curva de calibración. Las concentraciones de las soluciones de muestra fueron de 1 mg/mL. Las actividades de captación de radicales de DMPD de las muestras se expresaron como equivalentes de Trolox (TE). 4.7. Ensayos de actividad reductora de metales

4.7.1. Ensayo de poder antioxidante reductor férrico (FRAP)

La determinación de la actividad FRAP de las muestras se realizó en una plantilla de placa de 96 pozos siguiendo el procedimiento informado anteriormente por Bardakci et al. [54]. Al comienzo del experimento, el reactivo FRAP se formó mezclando tampón de acetato, tripiridiltriazina férrica y soluciones de FeCl;6H2O. Después de eso, el reactivo FRAP se colocó dentro del horno a 37 grados durante 30 min. Luego, 10 ul de las soluciones de muestra se combinaron con 30 ul de agua destilada y 260 ul de reactivo FRAP, respectivamente. Después del tiempo de incubación a 37 grados durante 30 min, la absorbancia se ajustó a 593 nm. Se construyó una curva estándar empleando diferentes molaridades de solución de sulfato ferroso (0,25-2 mM) para evaluar los resultados. Se utilizó BHT como solución de referencia a diferentes concentraciones. Las actividades FRAP de las muestras se presentaron como mM FeSO4 en 1 g de extracto seco.

4.7.2. Ensayo de capacidad antioxidante reductora cúprica (CUPRAC)

La actividad CUPRAC de las muestras se determinó en una plantilla de placa de pocillos 96- siguiendo el método modificado por Celeb et al. 【31】; Se agregaron 85 μL de soluciones de CuSO4 （10 mM）, neocupraína y acetato de amonio y 51 μL de agua destilada a 43 μL de soluciones de muestra, por separado. Después de un período de incubación (20 min) a 50 grados en un baño de agua, se midió la absorbancia a 450 nm. Se utilizó ácido ascórbico como solución de referencia a diferentes concentraciones para adquirir una curva de calibración. Las actividades de CUPRAC de las muestras se presentaron como equivalentes de ácido ascórbico (AAE). 4.8.Ensayo de actividad antioxidante total (TOAC)

La determinación de la actividad antioxidante total de las muestras se realizó en una plantilla de placa de pocillos 96- siguiendo el procedimiento de Celeb et al. [55]. Al principio, se mezcló una cierta cantidad de fosfato de sodio monobásico, tetrahidrato de molibdato de amonio y ácido sulfúrico para adquirir la solución de TOAC. Luego, se agregaron 300 μL de solución de TOAC a 30 μL de soluciones de muestra. Después del período de incubación a 95 grados en un baño de agua durante 90 min, se determinó la absorbancia a 690 nm. Se utilizó ácido ascórbico como solución de referencia a diferentes concentraciones para adquirir una curva de calibración. Las actividades de TOAC de las muestras se representaron como equivalentes de ácido ascórbico (AAE). 4.9.Estimación del Índice de Biodisponibilidad

El índice de biodisponibilidad (BAvI) se calculó según la ecuación teórica descrita por Inan et al.[13]:

BAVI=CIN/CND El "índice de biodisponibilidad" (BAvI) se describió como la relación entre el número de compuestos fenólicos en la muestra biodisponible (IN) y el de la muestra no digerida (ND). 4.10. Cuantificación de Flavonoides Marcadores por HPTLC

La determinación cuantitativa de las concentraciones de salidrosido, hiperósido y quercitrina en todas las muestras de simulación (ND, PG, IN) de los extractos acuosos de especies de Cistus se llevó a cabo mediante cromatografía de capa fina de alta resolución (HPILC) (CAMAG, Muttenz, Suiza) siguiendo el método validado por Guzelmeric et al. [dieciséis]. Se prepararon hiperósido, salidrosido y quercitrina en concentraciones de 25,50 y 10{{30}} ug/mL, y las concentraciones de soluciones de muestra recién preparadas se ajustaron a 10 mg/ml. Estas soluciones se aplicaron a placas de gel de sílice con respaldo de vidrio de fase normal (20 cm × 10 cm, Merck, Darmstadt, Alemania) con ciertos volúmenes (1-5 μL de soluciones estándar y 5 μL de soluciones de muestra) utilizando jeringas de 100 μL ( Hamilton, Bonaduz, Suiza） El procedimiento de aplicación se realizó con el aplicador de muestras Linomat 5. El proceso de desarrollo se realizó en Cámara de Desarrollo Automatizado (ADC 2) y acetato de etilo: diclorometano, ácido acético, ácido fórmico: agua (10:25:10 :10:10:10me) como fase móvil, luego las placas se derivatizaron con Natural Product Reagent (NPR) (1g de ácido difenilbórico 2-aminoetilo en 200mL de acetato de etilo) en el dispositivo de inmersión (CAMAG) Mientras que el hiperósido y la quercitrina se analizaron espectrofotométricamente a 260 nm, la cantidad de salidrósido se midió a 330 nm mediante un escáner UV. Los valores Rf de los estándares se determinaron como hiperósido (≈0,35), quercitrina (c0,45), tilirósido (≈ 0.65）. Se encontró que los coeficientes de correlación (r²) ser ×0,98 para la cuantificación de los flavonoides marcadores.

4.11.Actividad inhibidora de enzimas relacionadas con la diabetes 4.11.1. -Actividad inhibidora de la glucosidasa

-Las actividades inhibidoras de la glucosidasa de las muestras no digeridas y biodisponibles obtenidas de los extractos acuosos de especies de Cistus se examinaron siguiendo el método explicado anteriormente por Balan et al. [56]. En primer lugar, se mezclaron cantidades adecuadas de fosfato monosódico y fosfato disódico con la obtención de tampón de fosfato 100 mM (pH 7). La enzima ac glucosidasa se disolvió en tampón de fosfato para obtener la solución de -glucosidasa （0.2U/mL）. Luego se combinaron 170 uL de tampón de fosfato, 20 μL de la solución de -glucosidasa y 20 μL de las soluciones de muestra y se incubaron en un horno a 37 grados durante 15 min. Después de eso, se añadieron a la mezcla 20 uL de solución de p-nitrofenil- -D-glucopiranósido 2,5 mM en tampón de fosfato de potasio 100 mM (pH 7,0) y se ejecutó otro período de incubación a 37 grados durante 15 min. Luego, se añadieron a la mezcla 80 μL de solución de carbonato de sodio 0,2 M para terminar la reacción. La absorbancia se midió a 405 nm. Se utilizó como referencia la solución de quercetina a diferentes concentraciones. Los resultados se estimaron como el porcentaje de actividad inhibitoria en concentraciones de 1 mg/mL y 0,5 mg/mL de muestras ND e IN de los extractos acuosos de especies de Cistus.

4.11.2. -Actividad inhibidora de la amilasa

La actividad inhibidora de la -amilasa de muestras no digeridas y biodisponibles obtenidas de extractos acuosos de especies de Cistus se determinó siguiendo el procedimiento detallado previamente por Balan et al.[56]. La determinación espectrofotométrica de las actividades inhibidoras de la a-amilasa de las muestras se realizó empleando el reactivo DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico). Como se indica en el método, la maltosa se forma a partir de la conversión del almidón, y el color amarillo del DNS alcalino se convierte en un color rojo anaranjado debido a la maltosa producida a partir del almidón. Así, se preparó una solución de DNS 96 mM a partir de la mezcla de una solución de tartrato de sodio y potasio (disuelta en NaOH 2 M) y una cierta cantidad de DNS (disuelta en agua destilada). Luego, se preparó tampón de fosfato de sodio 20mM con NaCl 6,7 mM (cofactor de la enzima a-amilasa) a 20 grados (pH: 6,9). la enzima a-amilasa (1U/ml) y el almidón (10 mg/ml) se disolvieron en este tampón. Después de eso, se mezclaron 50 μL de tampón de fosfato de sodio y 10 μL de solución de enzima a-amilasa con 20 μL de las soluciones de muestra. Esta mezcla se incubó a 37 grados durante 45 min. Después del período de incubación, se agregaron a la mezcla 20 μL de la solución de almidón. Se inició otro período de incubación a 37 grados durante 45 min. Se aplicó el mismo procedimiento a las muestras sin la adición de una solución de enzima o-amilasa denominada "fondo de muestra". El grupo control se estudió con el mismo procedimiento en ausencia de soluciones de muestra. La absorbancia se midió a 540 nm. Se utilizó acarbosa como solución de referencia a diferentes concentraciones. Los resultados se presentaron como un porcentaje de actividad inhibidora en concentraciones de 1 mg/mL y 0,5 mg/mL de muestras ND e IN de extractos acuosos de especies de Cistus. 4.11.3.Actividad inhibidora de AGE

La actividad inhibidora de AGE de muestras no digeridas y biodisponibles de extractos acuosos de especies de Cistus se determinó siguiendo el método descrito por Starow-icz et al. [57]. Antes de cualquier proceso, se prepararon muestras frescas de 1 mg/mL y 0.5 mg/mL de muestras ND e IN. A continuación, se añadió 1 ml de solución de albúmina sérica bovina (BSA) con una concentración de 10 mg/ml a 1 ml de soluciones de muestra ND e IN. Las muestras de control se prepararon sin agregar soluciones de muestra ND e IN, y las muestras en blanco se prepararon sin agregar glucosa 0,5 M. Luego, todas las muestras preparadas se incubaron durante 40 h en un baño de agua con agitación a 55 grados. Una vez finalizado el período de incubación, se utilizó el lector de microplacas multimodo Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX en el rango de excitación de 370 nm/emisión de 440 nm para calcular la intensidad de la fluorescencia. La quercetina se utilizó como solución de referencia a diferentes concentraciones.

5. Conclusiones

En el presente estudio, los extractos acuosos de todas las especies de Cistus registradas en la flora turca fueron investigados por sus perfiles fenólicos y potenciales antioxidantes y antidiabéticos in vitro. Dado que la decocción o infusión es la forma común en las medicinas tradicionales, el uso de extractos acuosos para la evaluación de la actividad en estudios experimentales es particularmente importante. Por otro lado, los componentes hidrofílicos del extracto acuoso están sujetos a una serie de transformaciones metabólicas en el sistema gastrointestinal una vez ingeridos. Por lo tanto, para una correcta evaluación de la actividad de las formulaciones tradicionales, también deben investigarse las actividades de los metabolitos biodisponibles.

Este es el primer estudio que examina las consecuencias del método de simulación de digestión humana in vitro en especies turcas de Cistus. Además, en este estudio se estudió por primera vez el potencial de inhibición de las especies de Cistus turco sobre los AGE. Además, se asignaron flavonoides marcadores a salidrosido, hiperósido y quercitrina, y se monitorearon las alteraciones en sus concentraciones en el procedimiento de digestión in vitro. Si bien los contenidos fenólicos y las actividades antidiabética y antioxidante de los extractos se vieron afectados negativamente por los procedimientos de digestión gastrointestinal, aún exhibieron una bioactividad significativa. De acuerdo con los resultados, el extracto de C. salviifolius fue detectado como la planta más potente en términos de contenido fenólico y actividades antioxidantes y antidiabéticas. En conclusión, las partes aéreas de especies turcas de Cistus tienen un contenido fenólico rico y actividades antioxidantes y antidiabéticas potenciales. Si bien se empleó el método de simulación de digestión in vitro para evaluar la biodisponibilidad, es posible que no imite completamente las vías metabólicas que ocurren en el organismo. Por lo tanto, se requieren más estudios clínicos e in vivo para evaluar en detalle la biodisponibilidad de los compuestos fenólicos y su contribución a los efectos farmacológicos informados.

Contribuciones de autor:Conceptualización, YI, EC, EY; metodología, YI, SA, IK, EC análisis formal, YI, IK.-C., SA; investigación, YI, IK.-C, SA; recursos, YI, IK.SA, EC y EY; curación de datos, YI, IK-C., SA; redacción—YI, redacción—revisión y edición, YI, EC, EY; visualización, YI; supervisión, EC y EY Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Fondos:Esta investigación no recibió financiación externa. Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No corresponde. Declaración de consentimiento informado: No aplicable.

Declaración de disponibilidad de datos:Los datos presentados en este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

Conflictos de interés:Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Disponibilidad de muestras:Las muestras de los compuestos no están disponibles de los autores.

Este artículo está extraído de Molecules 2021, 26, 5322. https://doi.org/10.3390/molecules26175322 https://www.mdpi.com/journal/molecules