Parte 1: El actósido contrarresta los procesos catabólicos inducidos por la interleucina-1 -mediante la modulación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la vía de señalización celular NFκB
Mar 05, 2022
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HyangI Lim, 1 Do Kyung Kim, 1 Tae-Hyeon Kim, 1 Kyeong-Rok Kang
La osteoartritis (OA) es la enfermedad articular degenerativa más común con dolor articular crónico causado por la degeneración progresiva del cartílago articular en las articulaciones sinoviales.Acteósido, un glucósido de cafeoilfeniletanoide, tiene varias actividades biológicas, como efecto antimicrobiano, antiinflamatorio, anticancerígeno, antioxidante, citoprotector y neuroprotector. Además, la administración oral deacteósidoa una dosis alta no causa genotoxicidad. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es verificar los efectos anticatabólicos deacteósidocontra la artrosis y su vía de señalización anticatabólica.Acteósidono disminuyó la viabilidad de las células L929 de fibroblastos de ratón utilizadas como células normales y condrocitos primarios de rata.Acteósidocontrarrestó la pérdida de proteoglicanos inducida por IL-1 -en los condrocitos y el cartílago articular al suprimir la expresión y activación de una enzima que degrada el cartílago, como la metaloproteinasa de matriz- (MMP-) 13, MMP-1 y MMP{ {6}}. Además, el acteósido suprimió la expresión de mediadores inflamatorios como la óxido nítrico sintasa inducible, la ciclooxigenasa-2, el óxido nítrico y la prostaglandina E2 en los condrocitos primarios de rata tratados con IL-1. Posteriormente, la expresión de citocinas proinflamatorias disminuyó con el acteósido en los condrocitos primarios de rata tratados con IL-1. Además, el acteósido suprimió no solo la fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos en condrocitos primarios de rata tratados con IL-1, sino también la translocación de NFκB del citosol al núcleo a través de la supresión de su fosforilación. La administración oral de 5 y 10 mg/kg de acteósido atenuó la degeneración progresiva del cartílago articular en el modelo de ratón osteoartrítico generada por la desestabilización del menisco medial. Nuestros hallazgos indican queacteósidoes un prometedor agente anticatabólico potencial o suplemento para atenuar o prevenir la degeneración progresiva del cartílago articular.
1. Introducción
La osteoartritis (OA) es la enfermedad articular degenerativa más común con dolor articular crónico causado por la degeneración progresiva del cartílago articular en las articulaciones sinoviales [1]. Debido al aumento de la esperanza de vida, se estima que la prevalencia de OA con pérdida de movilidad y dolor articular crónico causado por la degeneración progresiva del cartílago articular en las articulaciones sinoviales es del 18 % y del 9,6 % en mujeres después de la menopausia y en hombres, respectivamente [2 ]. Aunque la prevalencia mundial de la OA aumenta anualmente, la etiología fisiopatológica de la OA aún se desconoce. Puede ser causado por factores de riesgo muy complejos y multifactoriales, como el envejecimiento, el género, la herencia genética, la lesión articular traumática y la carga articular mecánica severa. Además, se desconocen las relaciones neuropatológicas entre la degeneración progresiva del cartílago articular y el desarrollo de dolor articular crónico [3]. Por lo tanto, el objetivo del tratamiento clínico de los pacientes con OA es el mantenimiento de la movilidad corporal y la función articular mecánica a través del alivio del dolor articular crónico, utilizando enfoques farmacológicos y no farmacológicos y cirugía de reemplazo articular. La demanda por el desarrollo de intervenciones o suplementos efectivos, con seguridad biológica a largo plazo, para prevenir o atenuar la OA para mantener la calidad de vida a través del mantenimiento de la función articular mecánica en la población anciana está aumentando.
Como se muestra en la Figura 1, el acteósido (n.º CAS 61276-17-3; C29H36O15) es un glucósido de cafeoilfeniletanoide aislado de varias hierbas como los cloruros de Verbascum [4], Buddleja globosa [5] y Plantago australis [6]. Acteoside tiene varias actividades biológicas como antimicrobiano [5], antiinflamatorio [7], anticancerígeno [8], antioxidante [9], citoprotector [9] y efecto neuroprotector [10]. Además, la administración oral de acteósido en dosis altas no provoca genotoxicidad [11].
Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el acteósido con seguridad biológica antiinflamatoria tiene efectos anticatabólicos asociados con la protección del cartílago articular contra la degeneración progresiva del cartílago articular a través de la supresión de factores catabólicos como las citoquinas proinflamatorias, los mediadores inflamatorios y las enzimas que degradan el cartílago en las articulaciones sinoviales. . Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar los efectos anticatabólicos inducidos por acteoside y su vía de señalización celular tanto in vitro, utilizando condrocitos primarios aislados del cartílago articular de la articulación de la rodilla de rata, como in vivo, utilizando un modelo animal de OA generado por cirugía. desestabilización del menisco medial en la articulación de la rodilla de ratones.
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2. Métodos
2.1. Cultivo de células. Se aislaron condrocitos primarios de rata del cartílago articular de rodillas de rata (5-día de edad; Sprague-Dawley), de acuerdo con el protocolo (CIA-CUC2019-A0027) aprobado por el Instituto Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Chosun, Gwangju, República de Corea. Los condrocitos primarios de rata aislados se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, EE. UU.), antibióticos (50 ug/ml de penicilina y 50 ug/ml de estreptomicina) y 50 ug/ml de ácido ascórbico. La línea celular L-929 de fibroblastos de ratón normal se adquirió de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). De acuerdo con las instrucciones proporcionadas por la ATCC, las células L-929 se cultivaron en el medio esencial mínimo de Eagle, que contenía 10 por ciento de FBS, y se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 grados con 5 por ciento de CO2.
2.2. Ensayo de viabilidad celular. El ensayo de sal de dimetiltiazolildifeniltetrazolio (MTT) se realizó para evaluar la viabilidad de células de la línea celular de fibroblastos de ratón L929 utilizadas como células normales y condrocitos primarios de rata tratados con acteósido. Brevemente, se cultivaron células L929 y condrocitos primarios de rata a una densidad celular de 8 × 105 células/ml en placas de cultivo durante 24 h y luego se trataron con acteósido 2,5, 5, 10, 25, 50 y 100 μM durante 24 h. Después del tratamiento con solución de MTT, tanto las células L929 como los condrocitos se cultivaron adicionalmente durante 4 horas. Después de la incubación, los cristales de MTT formados se suspendieron completamente en sulfóxido de dimetilo y se midió la absorbancia a 570 nm utilizando un espectrómetro (espectrofotómetro de microplaca Epoch, BioTek®, Winooski, VT, EE. UU.) para evaluar la viabilidad celular.
2.3. Ensayo de células vivas/muertas. La supervivencia celular se realizó con el kit de ensayo Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EE. UU.), que está compuesto de calceína verde-AM para marcar células vivas (con fluorescencia verde) y homodímero de etidio-1 para marcar células muertas. células (con fluorescencia roja). Brevemente, tanto las células L929 como los condrocitos primarios de rata se cultivaron a una densidad celular de 8 × 105 células/mL en portaobjetos de cámara (sistema Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) durante 24 horas y luego se trataron con Acteósido 50 y 100 μM durante 24 h. Después del cultivo, se realizó un ensayo de supervivencia celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A partir de entonces, se tomaron imágenes de las células teñidas usando un microscopio de fluorescencia (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).
2.4. Ensayo de azul de dimetilmetileno (DMMB). El ensayo DMMB se realizó para evaluar la alteración del contenido de proteoglicanos en condrocitos primarios de rata tratados con acteósido durante 21 días en presencia o ausencia de IL-1. Para mantener las características de los condrocitos primarios de rata durante 21 días, se suspendieron condrocitos primarios de rata (2 x 106 células) en 1 ml de alginato al 1,2 por ciento y luego se encapsularon goteando la suspensión de células/alginato en una solución de CaCl2 105 mM. Los condrocitos primarios de rata encapsulados en alginato se cultivaron durante 24 h en DMEM/F12 (que contenía 10 % de FBS, 50 U/mL de penicilina, 50 ug/mL de estreptomicina y 50 ug/mL de ácido ascórbico) y luego se adaptaron durante 24 h en DMEM/F12 que contenía 1 % de mini-insulina-transferrina-selenio (mini-ITS) y ácido ascórbico 50ug/mL. Posteriormente, los condrocitos se trataron con acteósido 50 o 100 μM en presencia o ausencia de 1 ng/mL de IL-1 durante 21 días. El día 21, se recolectaron los condrocitos primarios de rata para evaluar el contenido de proteoglicanos utilizando el ensayo DMMB, como se describió anteriormente [12]. Además, para cuantificar el contenido de proteoglicanos por célula y evaluar la proliferación de condrocitos primarios de rata, se midió el número de células mediante un ensayo de ADN utilizando PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), según las instrucciones del fabricante.
2.5. Cultivo de órganos ex vivo de tejidos de cartílago articular de rata. Se aislaron tejidos de cartílago articular de las articulaciones de la rodilla de ratas Sprague-Dawley de 5-días de edad y luego se cultivaron en DMEM/F12 complementado con 10 por ciento de FBS. A continuación, el cartílago articular
Las muestras se trataron con acteósido 100 μM en elpresencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 7 días. Al final del período de cultivo, las muestras se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4 por ciento durante 72 horas para el análisis histológico.
2.6. Análisis histológico. Se realizó un análisis histológico con safranina-O y tinción verde rápida para verificar la pérdida de proteoglicanos en el cartílago articular tratado con acteósido 100 μM en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 7 días. Brevemente, las muestras de cartílago articular fijo se descalcificaron en ácido etilendiaminotetraacético y luego se incluyeron en parafina. A partir de entonces, los bloques de parafina preparados que contenían cartílago articular se cortaron en serie hasta un grosor de 5 μm y se colocaron en portaobjetos. Posteriormente se realizó safranina-O y tinción verde rápida para evaluar la pérdida de proteoglicanos en la sustancia fundamental del cartílago articular. Además, se realizó tinción con hematoxilina y eosina para observar la morfología general del cartílago articular.
2.7. Transferencia occidental. Se realizó transferencia Western para investigar la expresión de factores catabólicos, incluidos MMP-13, MMP-1, MMP-3, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa-2 (COX -2) y la alteración de moléculas de señalización celular como las proteínas quinasas activadas por mitógenos y el factor nuclear kappa B (NFκB). Brevemente, los condrocitos primarios de rata se trataron con acteósido 50 o 100 μM en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 24 horas. A partir de entonces, los condrocitos primarios de rata se recolectaron mediante centrifugación y se lisaron utilizando tampón de lisis (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, para verificar la translocación nuclear de NFκB, se trataron condrocitos primarios de rata con 50 o 100 μM de acteósido en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 24 h. Posteriormente, las fracciones citosólicas y nucleares se extrajeron utilizando los reactivos de extracción nuclear y citoplasmática NE-PER™ (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína total extraída de condrocitos primarios de rata se determinó utilizando un kit de ensayo de proteína de ácido bicinconínico (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Además, se recogió el medio acondicionado para detectar los niveles de enzimas que degradan el cartílago secretadas por los condrocitos. Se sometieron a electroforesis cantidades iguales de proteína y medio acondicionado en electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y luego se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. A partir de entonces, se realizó una transferencia Western utilizando anticuerpos primarios dirigidos contra MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfoERK1/2, total-ERK1 /2, fosfo38, p38 total, fósforo JNK, total JNK, fosfoNFκB, total NFκB, actina y lamina B. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante y luego fotografiadas por un dispositivo Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalén, Israel).
2.8. Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Los condrocitos primarios de rata se trataron con acteósido 50 o 100 μM en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 24 horas. A partir de entonces, se aisló el ARN total de los condrocitos primarios de rata utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN total se midió con un NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU.). Para sintetizar ADNc, se transcribió inversamente 1 ug de ARN utilizando un sistema de PCR de transcripción inversa ThermoScript (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La qPCR de cDNA se realizó usando 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seúl, República de Corea) y cebadores específicos en un TaKaRa PCR Thermal Cycler Device (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japón). Posteriormente, los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa para determinar los niveles de expresión de los genes diana. Se usó gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control endógeno. Además, para qRT-PCR, se amplificó el ADNc utilizando un sistema de PCR en tiempo real Eco™ (illumine Inc., San Diego, CA, EE. UU.). -Se usó actina como control endógeno. Las secuencias de los cebadores utilizados en qPCR y qRT-PCR se resumen en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
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3. Resultados
3.1. El acteósido no afecta la viabilidad de las células L929 ni de los condrocitos primarios de rata. La línea celular de fibroblastos de ratón L929 utilizada como células normales se trató con acteósido 2,5, 5, 10, 25, 50 y 100 µM durante 24 horas. Posteriormente, se realizó el ensayo MTT para evaluar la citotoxicidad del acteósido en células L929. Como se muestra en la Figura 2(a), se determinó que las viabilidades relativas de las células L929 eran 94:8 ± 8 %, 93:6 ± 7 %, 100 ± 5 %, 103:9 ± 5 %, 126:1 ± 8 % y 122:7±4 por ciento a 2,5, 5, 10, 25, 50 y 100 µM de acteósido, respectivamente, en comparación con el control (100:02±3 por ciento). Además, para verificar la citotoxicidad del acteósido en condrocitos primarios de rata, se realizó el ensayo MTT como se muestra en la Figura 2(b). Las viabilidades de los condrocitos primarios de rata tratados con 2,5, 5, 10, 25, 50 y 100 μM de acteósido se determinaron como 114 ± 4 %, 117:8 ± 6 %, 123:9 ± 5 %, 132:6 ± 4 %, 153:1± 7 por ciento y 142:1±6 por ciento, respectivamente, en comparación con el control (100:4±5 por ciento). Además, para confirmar el efecto del acteósido sobre la viabilidad tanto de las células L929 como de los condrocitos primarios de rata, se realizó un ensayo Cell Live/Dead como se muestra en la Figura 2(c). El número de células muertas teñidas como fluorescencia roja no aumentó tanto para las células L929 como para los condrocitos primarios de rata tratados con 50 y 100 µM de acteósido durante 24 horas. Estos datos demostraron consistentemente que la dosis definida de acteósido no afectó la viabilidad de las células L929 y los condrocitos primarios de rata. Por lo tanto, se usaron acteósido 50 μM y acteósido 100 μM, que son dosis no tóxicas tanto en células L929 como en condrocitos primarios de rata, para verificar sus efectos anticatabólicos en estudios in vitro con condrocitos primarios de rata.
3.2. El acteósido contrarresta la pérdida de proteoglicanos inducida por IL-1 -en condrocitos primarios de rata. Se trataron condrocitos primarios de rata incrustados en perlas de alginato con acteósido 50 y 100 μM en presencia o ausencia de 1 ng/ml de IL- 1 durante 21 días. Posteriormente, se realizó un ensayo de DMMB para evaluar la alteración en el contenido de proteoglicanos como se muestra en la Figura 3(a). Los contenidos relativos de proteoglicanos se determinaron como 88:3±18:1 por ciento y 86:8±16:3 por ciento en los condrocitos primarios de rata tratados con 50 y 100 μM de acteósido, respectivamente, en comparación con el control (103:8± 32:3 por ciento). Aunque los contenidos relativos de proteoglicanos disminuyeron con el acteósido, estos resultados no fueron significativos. Sin embargo, el contenido relativo de proteoglicanos disminuyó significativamente en un 37:1± 14:7 por ciento en los condrocitos primarios de rata tratados con 1 ng/ml de IL-1, pero el ateoósido 50 y 100 μM redujo significativamente el contenido de proteoglicanos en un 57 ± 12:4. por ciento y 64 ± 14,5 por ciento, respectivamente, en presencia de 1 ng/ml de IL-1. Posteriormente, para verificar si el acteósido suprime la pérdida de proteoglicanos inducida por IL-1 -, se trató el cartílago articular diseccionado de las articulaciones de la rodilla de rata con 100 μM de acteósido en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 7 días. A partir de entonces, se realizaron evaluaciones histológicas utilizando tinción H&E y safranina-O y tinción verde rápida como se muestra en la Figura 3 (b). La alteración morfológica no se observó con la tinción H&E; sin embargo, la safranina-O y la tinción verde rápida revelaron que el proteoglicano teñido como el color rojo no se alteró en los cartílagos articulares tratados con acteósido 100 μM en comparación con el control. Sin embargo, se indujo una pérdida severa de proteoglicanos con 10 ng/ml de LIL-1 en el cartílago articular, y el ateoósido 100 μM suprimió significativamente la pérdida de proteoglicanos en el cartílago articular tratado con 10 ng/ml de IL- 1. En conjunto, estos datos muestran consistentemente que el acteósido tiene un efecto anticatabólico que retarda la degeneración del cartílago articular al contrarrestar la pérdida de proteoglicanos inducida por IL-1 -.
3.3. Acteoside tiene un efecto anticatabólico que suprime la expresión y activación de MMP en condrocitos primarios de rata tratados con IL-1. Para investigar si el efecto anticatabólico inducido por el acteósido está asociado con la supresión de la expresión y activación de MMP, se trataron condrocitos primarios de rata con 50 y 100 μM de acteósido en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 24 horas. Posteriormente, se investigaron las alteraciones en las MMP. Como se muestra en la Figura 4(a), aunque la expresión de enzimas que degradan el cartílago como MMP-13, MMP-1 y MMP-3 aumentó significativamente en los medios acondicionados de ratas primarias. condrocitos tratados con 10 ng/mL de IL-1 , se redujo con acteósido de forma dependiente de la dosis. Además, los resultados de qPCR (Figura 4(b)) y qRT-PCR (Figura 4(c)) revelaron que IL-1 aumentó significativamente los niveles de ARNm de MMP como MMP-13, MMP{ {22}} y MMP-3 en los condrocitos primarios de rata. Sin embargo, disminuyeron de forma dependiente de la dosis en los condrocitos primarios de rata.tratados con acteósido 50 y 100 μM. Además, el acteósido 50 y 100 μM suprimió eficazmente la activación de las MMP en los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/ml de IL-1 (Figura 4(d)). En conjunto, estos datos indican consistentemente que el acteósido tiene un efecto anticatabólico que suprime la expresión y activación de las enzimas que degradan el cartílago.
3.4. Acteoside suprime la expresión y producción de mediadores inflamatorios catabólicos inducidos por IL1 - y citocinas proinflamatorias en condrocitos primarios de rata. Para determinar si el acteósido tiene un efecto preventivo contra la OA, se trataron condrocitos primarios de rata con 50 y 100 μM de acteósido en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1 durante 24 horas. Posteriormente, se investigaron las alteraciones en los mediadores inflamatorios, factores catabólicos representativos como iNOS, COX-2 y PGE2. Los niveles de ARNm de iNOS, COX-2 y PTGS-2 aumentaron significativamente por IL-1 en los condrocitos primarios de rata.
Sin embargo, disminuyeron de forma dependiente de la dosis en los condrocitos primarios de rata tratados con acteósido (Figura 5(a)). Además, el acteósido no solo suprimió la expresión de iNOS y COX-2 en los condrocitos primarios de rata tratados con IL-1 (Figura 5(b)), sino que también disminuyó significativamente la producción relativa de NO y PGE2, como se muestra. en las Figuras 5(c) y 5(d), respectivamente. Estos datos sugieren que el acteósido suprime la expresión de citoquinas proinflamatorias inducidas por mediadores inflamatorios que actúan como factores catabólicos para inducir la degeneración progresiva del cartílago articular. Por lo tanto, para investigar la alteración de la expresión de las citocinas proinflamatorias por el acteósido 50 μM en los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/mL de IL- 1, se realizó una matriz de citocinas como se muestra en la Figura 6. El acteósido suprimió la expresión de neutrófilos inducidos por citocinas. quimioatrayente- (CINC-) 2, CINC-3, factor neurotrófico ciliar (CNTF), fractalquina (CX3CL1), IL-1 , IL- 1 , leptina, proteína quimioatrayente de monocitos{{22} } (MCP-1), proteína inflamatoria de macrófagos- (MIP-) 3 , y -nerviofactor de crecimiento (NGF) en los condrocitos primarios de rata tratados con IL-1 en comparación con IL-1 sola. Tomados en conjunto, estos datos sugieren consistentemente que el acteósido previene la degeneración progresiva del cartílago articular a través de la supresión de mediadores inflamatorios y citocinas proinflamatorias contra los efectos catabólicos inducidos por IL-1 - en condrocitos primarios de rata.
3.5. Acteoside suprime la fosforilación de MAPK y NFκB en condrocitos primarios de rata tratados con IL-1. Para investigar las vías de señalización celular asociadas con los efectos anticatabólicos inducidos por el acteósido contra la alteración de MAPK y NFκB por la citocina proinflamatoria IL-1, se trataron condrocitos primarios de rata con 50 y 100 μM de acteósido en presencia o ausencia de IL{{8 }} durante 24 horas. Posteriormente, la proteína total se extrajo y se sometió a electroforesis en el gel SDS-PAGE para realizar la transferencia Western. Como se muestra en la Figura 7, MAPK como ERK1/2, p38 y JNK se fosforilaron significativamente en los condrocitos primarios de rata tratados con IL-1, mientras que el ateoósido 50 y 100 μM no indujo significativamente la fosforilación de MAPK en comparación con el control en condrocitos primarios de rata. Sin embargo, 50 y 100 μM de acteósido suprimieron de forma dependiente de la dosis la fosforilación de MAPK inducida por IL-1 -en condrocitos primarios de rata. Además, la fosforilación de NFκB en los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/mL de IL-1 disminuyó gradualmente con el acteósido de forma dependiente de la dosis. Estos datos indican que las vías de señalización celular MAPK y NFκB están estrechamente relacionadas con los efectos anticatabólicos inducidos por acteoside contra IL-1 en condrocitos primarios de rata.
3.6. Acteoside suprime la translocación de NFκB del citosol al núcleo a través de la supresión de la fosforilación de NFκB inducida por IL-1 -en condrocitos primarios de rata. Para investigar si el acteósido suprime la translocación de NFκB desde el citosol al núcleo, se trataron condrocitos primarios de rata con 50 y 100 ug/ml de acteósido en presencia o ausencia de 10 ng/ml de IL-1. Como se muestra en la Figura 8(a), NFκB se translocó significativamente al núcleo desde el citosol de los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/ml de IL-1. Sin embargo, fue significativamente inhibido por el acteósido de una manera dependiente de la dosis. Además, aunque el nivel de NFκB aumentó en la fracción nuclear extraída de los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/ml de IL-1, el acteósido disminuyó en función de la dosis, como se muestra en la Figura 8(b). El nivel de NFκB disminuyó en la fracción citosólica extraída de los condrocitos primarios de rata tratados con 10 ng/mL de IL-1, pero el acteósido aumentó de forma dependiente de la dosis. Tomados en conjunto, estos datos indican consistentemente que los efectos anticatabólicos inducidos por acteoside contra IL-1 están involucrados en la supresión de la translocación del citosol al núcleo en la modulación de la vía de señalización de NFκB en condrocitos primarios de rata.
3.7. El acteósido atenúa la degeneración progresiva del cartílago articular en animales con artrosis de rodilla inducida por DMM quirúrgica. Para dilucidar los efectos anticatabólicos inducidos por el acteósido in vivo, a los animales inducidos por OA generados por el DMM quirúrgico realizado en la articulación de la rodilla de ratones BALB/c se les administró por vía oral 5 y 10mg/kg de acteósido resuelto en etanol al 5 por ciento. cada dos días durante 8 semanas. Posteriormente, las articulaciones de la rodilla se evaluaron histológicamente usando safranina-O y tinción verde rápida como se muestra en la Figura 9. La pérdida de proteoglicanos y la lesión de la superficie del cartílago articular aumentaron significativamente en la articulación de la rodilla diseccionada de animales con OA inducida por DMM. Sin embargo, la administración oral de acteósido suprimió la pérdida de proteoglicanos y menos lesión del cartílago articular en comparación con el vehículo solo. Además, el puntaje de calificación de Mankin aumentó significativamente en el grupo de animales OA (n =5, 3± 0:7) solo con vehículo en comparación con Naïve (n =5, 0 :67 ± 0:5). Sin embargo, la administración oral de 5 y 10mg/kg de acteósido en el grupo de animales OA (n =5) disminuyó la puntuación de clasificación de Mankin en 2±0:7 y 1:67 ± 0:5 , respectivamente, en comparación con el vehículo solamente. En conjunto, estos datos indican que la administración oral de acteósido atenúa la degeneración progresiva del cartílago articular en articulaciones sinoviales con condiciones catabólicas.
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