Parte 1 La enfermedad renal crónica y el envejecimiento disminuyen diferencialmente el material óseo y la microarquitectura en ratones C57Bl/6

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La enfermedad renal crónica y el envejecimiento disminuyen diferencialmente el material óseo y la microarquitectura en ratones C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Colorado, Boulder, CO

2Departamento de Cirugía Ortopédica, Universidad de California, San Francisco, CA

3Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Utah, Salt Lake City, UT

4Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC

5Departamento de Ingeniería Biomédica, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Fuente de luz avanzada, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA

7Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad de Cornell, Ithaca, NY

8Departamento de Bioingeniería, Universidad de Colorado, Denver, CO

9Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Colorado, Denver, CO

10Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Georgetown, Washington DC

11Departamento de Ortopedia, Facultad de Medicina de la Universidad de Colorado, Aurora, CO *Universidad de California Berkeley – Programa de Posgrado en Bioingeniería de la Universidad de California en San Francisco, San Francisco, CA

# División de Investigación, Hospital for Special Surgery, Nueva York, NY

Cistanche puede ayudar con la enfermedad renal

Resumen

La enfermedad renal crónica (ERC) es una enfermedad común del envejecimiento y aumenta el riesgo de fractura solo en personas de edad avanzada. El envejecimiento y la ERC deterioran de manera diferente el recambio óseo y la mineralización. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la pérdida de calidad ósea sería mayor con la combinación de edad avanzada y ERC. Evaluamos hueso de ratones macho C57Bl/6 adultos jóvenes (6 meses), de mediana edad (18 meses) y viejos (24 meses) tres meses después de la nefrectomía 5/6, para inducir la ERC o los procedimientos simulados. La ERC exacerbó las pérdidas de microarquitectura cortical y trabecular asociadas con el envejecimiento. El envejecimiento y la ERC dieron como resultado cortezas más delgadas y porosas y menos trabéculas y más delgadas. La calidad del material óseo también se redujo con la ERC, y estos cambios en el material óseo fueron distintos de los debidos a la edad. El envejecimiento redujo la resistencia y el módulo de flexión de todo el hueso, el módulo de nanoindentación a escala micrométrica y la tensión de tejido y colágeno a escala nanométrica (dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)). Por el contrario, la ERC redujo el trabajo hasta la fractura y la variación en el módulo y la composición del tejido óseo (espectroscopia Raman) y aumentó el porcentaje de tensión de colágeno. El aumento de la carga de tensión del colágeno se asoció con la pérdida de dureza en la ERC. Además, las lagunas de osteocitos se hicieron más pequeñas, más escasas y más desordenadas con la edad para los ratones Sham, aunque estos cambios relacionados con la edad no se observaron claramente en la ERC. Sin embargo, para la ERC, las lagunas más grandes se correlacionaron positivamente con niveles elevados de fosfato sérico, lo que sugiere que los osteocitos desempeñan un papel en la homeostasis mineral sistémica. Este trabajo demuestra que la ERC reduce la calidad ósea, incluida la microarquitectura y las propiedades del material óseo, y que la ERC agrava la pérdida de calidad ósea con la edad. Estos hallazgos pueden ayudar a reconciliar por qué la masa ósea no predice consistentemente la fractura en la población con ERC, así como por qué las personas mayores con ERC tienen un alto riesgo de fragilidad.

Palabras clave: ERC; envejecimiento; calidad ósea; fragilidad ósea; colágeno

1. Introducción

La enfermedad renal crónica (ERC) afecta aproximadamente al 23-36 por ciento de la población anciana y se asocia con un mayor riesgo de fracturas y mortalidad relacionada con las fracturas (1,2). Aunque la pérdida de masa ósea (medida por absorciometría de rayos X de energía dual) predice futuras fracturas en todas las etapas de la ERC, las personas mayores con baja masa ósea y ERC son más propensas a fracturarse en comparación con aquellas con baja masa ósea y riñones sanos. función (3). El riesgo de fracturas óseas generalmente aumenta con la ERC en comparación con los efectos del envejecimiento solo (4,5). Por ejemplo, en un estudio de tres años, las personas de 40 a 65 años con ERC de etapa moderada a terminal tuvieron un aumento de 1,7 a 5,1 veces en la prevalencia de fracturas en comparación con los controles de la misma edad, mientras que para las personas mayores de 65 años, la ERC continuó aumentando la incidencia. de fractura 1,8 – 4,3 veces los controles (4).

microarquitectura del hueso trabecular (10, 13), mientras que otros no informan cambios en comparación con el control (9). Aunque estos estudios varían en cuanto a la especie y la cepa de los roedores, el método de inducción de la ERC y los resultados medidos, estos trabajos anteriores proporcionan pruebas sustanciales de que la ERC altera la calidad ósea.

Quedan varias preguntas clave sobre cómo la ERC disminuye la calidad del hueso, hasta qué punto la disminución de la calidad del hueso se debe a defectos en la fase mineral frente a la orgánica, y cómo los cambios en la calidad del hueso influyen en la pérdida de dureza del tejido óseo. En particular, aunque algunos estudios han identificado cambios en los enlaces cruzados del colágeno y la madurez del tejido (es decir, el tiempo transcurrido desde la formación del hueso) en la ERC, se desconoce si las interacciones a nanoescala de las fibras de colágeno durante la carga mecánica se ven alteradas por la ERC y si estos cambios en la nanomecánica influyen en todo. -dureza ósea (11, 12). En términos más generales, aún no se ha informado una evaluación de los cambios en la calidad y la mecánica del hueso en respuesta a la ERC desde escalas de longitud nanométrica a ósea completa.

El papel del osteocito en la influencia de la calidad del hueso en la ERC y el envejecimiento también es incierto. Estas células se comportan de manera anormal al elevar sustancialmente la expresión de FGF23 al principio de la progresión de la ERC (7, 14). El osteocito es esencial para mantener la calidad del material óseo y para regular la resistencia a la fractura ósea (15–17). La salud de los osteocitos se indica, en parte, a través de la morfología lacunar. Las morfologías lacunares de los osteocitos se alteran cuando el osteocito participa en la homeostasis mineral, como en la lactancia (18, 19) y la hipofosfatemia ligada al cromosoma X (20). Las geometrías lacunares también pueden volverse más pequeñas, más dispersas y más desordenadas con el envejecimiento y el desuso (21–23). Los cambios en la morfología lacunar de los osteocitos con ERC tienen el potencial de afectar las tensiones del tejido óseo, la integridad estructural y la mecanosensibilidad de los osteocitos (24). Todavía no se sabe si la ERC afecta las morfologías lacunares de los osteocitos y si tal relación puede cambiar con el envejecimiento.

Aunque las poblaciones con ERC más comunes incluyen adultos mayores, aún no se han explorado los efectos combinados del envejecimiento y la ERC en la calidad ósea. Trabajos previos han establecido que el envejecimiento disminuye el módulo, la resistencia y el trabajo de fractura de todo el hueso por flexión (25), la tenacidad a la fractura (26), la microarquitectura del hueso cortical y trabecular (27–29), y aumenta el contenido mineral y la madurez (30, 31). Estos cambios en el hueso con el envejecimiento son confusos y ocurren en múltiples escalas de longitud, con la mecánica de todo el hueso influenciada por cambios en el material del tejido óseo, así como en la estructura. Los cambios relacionados con la edad en el material óseo y el volumen óseo están en parte influenciados por una menor renovación del tejido óseo (es decir, mayor madurez del tejido) y un balance negativo en la unidad multicelular ósea, respectivamente (30,32). Dichos cambios relacionados con la edad contrastan con el recambio óseo anormal y la mineralización que a menudo ocurre con la ERC. La pérdida de microarquitectura está relacionada con un balance negativo, que es esperable con el envejecimiento y puede ocurrir en la ERC (9, 10, 13). Sin embargo, la madurez del tejido aumenta con el envejecimiento y disminuye en el contexto de la ERC de alta rotación. Existen brechas sustanciales en la comprensión de la base de la fragilidad ósea en la ERC, así como de cómo el envejecimiento y la ERC, cuando se combinan, reducen la calidad ósea y la resistencia a las fracturas. Esclarecer los efectos combinados del envejecimiento y la ERC en la calidad ósea llenaría estos vacíos de conocimiento.

El propósito de este estudio fue investigar las influencias combinadas del envejecimiento y la ERC en la calidad del hueso, desde escalas nanométricas hasta escalas de longitud de hueso completo, en un modelo quirúrgico de ERC en ratones envejecidos. Presumimos que la ERC y el envejecimiento reducen la calidad del hueso, pero que estos dos factores influirían de manera diferencial y negativa en las propiedades del material del tejido óseo. Además, planteamos la hipótesis de que los efectos combinados de la vejez y la ERC son más perjudiciales para la calidad ósea. Para evaluar estas hipótesis, evaluamos la calidad ósea, incluida la microarquitectura cortical y trabecular y las propiedades del material óseo cortical, en adultos jóvenes a través de ratones viejos con ERC inducida por nefrectomía 5/6 (5/6 Nx) o cirugías simuladas.

Sobre la cistanche

2. Métodos

2.1 Modelo animal y preparación de muestras

Se obtuvieron ratones macho C57Bl/6 de una colonia del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento a las edades de 3, 15 y 21 meses. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de 12-h de luz / 12-h de oscuridad, se alojaron individualmente en jaulas de policarbonato con ropa de cama estándar, se alimentaron con comida Harlan Teklad 2920X y se les permitió acceso libre al agua. Para cada una de las tres edades, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos CKD o Sham. El grupo de CKD se sometió a una nefrectomía en dos tiempos. Estos procedimientos fueron descritos previamente (33). Brevemente, se accedió al riñón izquierdo a través de una incisión en la línea media, se desencapsuló para evitar el daño del uréter y las suprarrenales y luego se extrajo. Una semana después, se decapsuló el riñón derecho y se resecaron parcialmente los polos superior e inferior para lograr una reducción de 2/3 del volumen renal. El grupo de control recibió procedimientos simulados (es decir, incisión en la línea media sin dañar los riñones) dentro del mismo período de tiempo. Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,5 por ciento durante los procedimientos. Se administró una dosis postoperatoria de buprenorfina (0,5 mg/kg) después de estos procedimientos y antes de la recuperación, así como cada 12 horas durante los siguientes dos días. Los ratones fueron sacrificados después de tres meses mediante CO2 y dislocación cervical. Al final del estudio, los ratones tenían 6 (adulto joven; Sham: n=6, CKD: n=7), 18 (mediana edad; Sham: n=8; CKD: n { {25}}), y 24 (edad; Sham: n=8; CKD: n=8) meses de edad. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Colorado en Denver.

El fémur, la tibia, el húmero, el radio y el cúbito izquierdos se reservaron para los análisis de calidad ósea. La tibia izquierda se conservó en etanol al 70 por ciento a 4 grados C. Todos los demás huesos se envolvieron con una gasa humedecida con fosfato y se almacenaron a -20 grados C hasta su análisis.

2.2 Química del suero y la orina

Se realizaron análisis de bioquímica sérica en sangre y orina recolectadas al final del estudio. La urea en suero y orina, así como las concentraciones de fosfato, calcio y PTH en suero, se midieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioAssays Systems e Immunotropics, respectivamente).

2.3 microCT

Se evaluó la microarquitectura del hueso cortical del fémur del eje medio y el hueso trabecular de la tibia proximal mediante microCT para todos los ratones del estudio (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Suiza). Los fémures se descongelaron durante la noche a 4 grados C antes de escanearlos. El escaneo se realizó con un tamaño de vóxel de 10 µm, siguiendo los métodos de adquisición y análisis descritos anteriormente (10). Los parámetros corticales incluyeron volumen óseo/volumen total (BV/TV), área ósea/área total (BA/TA), porosidad cortical (Ct. Po), espesor cortical (Ct. Th), densidad mineral total (TMD), un momento de inercia sobre el eje medial-lateral (IML), la distancia entre el centroide y la superficie del hueso en la dirección anterior-posterior (C), y el momento polar de inercia (pMOI) (34). Los parámetros trabeculares incluyeron número trabecular (Tb.N), espaciado trabecular (Tb.Sp), grosor trabecular (Tb.Th), volumen óseo (BV), volumen total (TV), volumen óseo/volumen total (BV/TV), densidad mineral ósea volumétrica (vBMD) y densidad de conectividad (Conn.D). Después de microCT, los fémures se envolvieron nuevamente en una gasa humedecida con fosfato y se almacenaron a -20 grados C para la posterior caracterización mecánica de todo el hueso.

2.4 Propiedades mecánicas y materiales del hueso entero

Después de microCT, los fémures izquierdos se doblaron en tres puntos (Sistema de prueba de materiales Insight II, celda de carga de 250 N, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Los fémures se extrajeron de una gasa humedecida con solución salina tamponada con fosfato y se probaron hasta el fallo utilizando una velocidad de deflexión de 5 mm/min en un yunque personalizado con una extensión de 8 mm. Las curvas de carga-desplazamiento se analizaron para determinar las propiedades mecánicas, incluida la rigidez, la carga máxima, el desplazamiento a la carga máxima, la energía a la carga máxima, la carga a la fluencia, el desplazamiento a la fluencia, la energía a la fluencia, el desplazamiento posterior a la fluencia, la carga a la fractura, el desplazamiento a la fractura, y energía en la fractura. El punto de fluencia se definió como la intersección de una línea secante dibujada con una reducción del 10 por ciento en la pendiente de la rigidez tangente inicial y la curva de carga-desplazamiento. Usando IML y C de µCT, estimamos las propiedades del material, incluido el módulo de flexión, la tensión de fluencia, la tensión máxima y la tenacidad a partir de los datos de flexión de tres puntos utilizando ecuaciones de flexión de haz estándar aplicadas al fémur de ratón (35).

2.5 Análisis de elementos finitos de la rigidez de la tibia proximal

Para investigar el comportamiento mecánico del hueso, se utilizó un modelo computacional de elementos finitos (FE) para simular la compresión axial de la tibia proximal en cada modelo. Se eligió la tibia proximal porque la tibia es una estructura de carga en ratones y es un sitio común de análisis de las propiedades óseas mediante microCT. Los datos de imagen de MicroCT de la tibia proximal (hueso cortical y trabecular) se exportaron como cortes de imagen DICOM de 16-bit para una mayor segmentación y construcción de modelos de elementos finitos específicos del sujeto. Los datos de imágenes DICOM se importaron a Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Lovaina, Bélgica) para el procesamiento y la segmentación de imágenes a fin de crear un modelo FE correspondiente para la misma región proximal de la tibia del hueso analizado con microCT. El tejido óseo se separó de otros tejidos en la imagen usando un umbral de segmentación de 313 mg/cm3 (36,37). Una vez segmentada la región ósea, se exportó la malla FE específica del sujeto, que contenía los compartimentos cortical y trabecular. El modelo FE utilizó una malla FE hexaédrica con un tamaño de elemento isotrópico de 10 µm.

Las mallas FE exportadas de Mimics se importaron a ABAQUS CAE 6.9 para la asignación de propiedades de materiales, la aplicación de condiciones de contorno y la simulación de carga mecánica axial. Se especificó que las propiedades del material del hueso fueran homogéneas, isotrópicas y elásticas lineales (módulo de Young, E= 10 GPa y relación de Poisson, v= 0.3). Para simular la compresión axial, se aplicó una condición límite fija a los nodos en la superficie inferior del hueso, y se aplicó un desplazamiento hacia abajo de 5 μm (0,5 por ciento de la altura del segmento óseo) a los nodos en la superficie superior del hueso. La rigidez estructural ósea se calculó como la fuerza de reacción (N) sobre el desplazamiento aplicado.

2.6 Dispersión de rayos X de ángulo pequeño

La deformación de las fibrillas de colágeno durante la prueba de tensión uniaxial de cúbitos y radios combinados se midió usando dispersión de rayos X de ángulo pequeño de sincrotrón (SAXS) en la línea de luz 7.3.3 en Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Los huesos se aseguraron con pegamento y papel de lija entre abrazaderas en sus extremos distal y proximal. Las pruebas de tracción in situ se realizaron con una plataforma de prueba de tracción TST350 (Linkam Scientific Inc.) en muestras hidratadas a una velocidad de desplazamiento de 2,5 µm/s. Durante la prueba, la diáfisis ósea se expuso a rayos X de 10 keV durante 0,1 s cada 5 s. La radiación total se limitó a 30 kGy para mitigar los efectos de la exposición sobre el rendimiento mecánico (39). El espaciado d de colágeno, representativo de las regiones de brecha repetidas dentro de la superestructura de colágeno, aparece como un pico de difracción de Bragg prominente en el patrón SAXS. La deformación específica del colágeno a lo largo de la prueba de tracción se midió mediante el seguimiento del cambio en las posiciones de los picos de Bragg con cantidades crecientes de carga. Utilizando un programa personalizado de LabVIEW, este cambio progresivo en el patrón de dispersión se convirtió en tensión de fibrillas de colágeno al normalizar el espacio d con cargas cero, como se discutió anteriormente (40). La tensión del tejido se calculó a partir de las fuerzas registradas en la etapa de prueba dividida por las medidas del área de la sección transversal de los huesos probados. Las áreas transversales sumadas del cúbito y el radio se midieron desde el punto medio de la longitud cubital utilizando imágenes reflectantes de campo claro (Leica DM, objetivo 20x) y se cuantificaron con ImageJ (41). Las cepas de tejido óseo completo se obtuvieron con un paquete personalizado de MATLAB de correlación de imágenes digitales (DIC) que rastreó y midió las distancias entre una cuadrícula de puntos superpuestos en la muestra de hueso durante la prueba. Las cepas DIC obtenidas se combinaron con tensiones a nivel de tejido para generar curvas estándar de tensión-deformación. El módulo de elasticidad lineal se extrajo de estas curvas, así como el límite elástico y la deformación elástica definidos por el límite elástico compensado del 0,2 por ciento. La tensión del tejido se comparó en el tiempo con las cepas de colágeno de SAXS en el límite elástico y la tensión máxima para producir comparaciones de los componentes que soportan la tensión con el hueso durante la deformación.

Se realizó un análisis controlado del compuesto de cúbito/radio durante la prueba de tracción comparando la tensión a nivel de tejido de las imágenes de la cámara digital con las tensiones calculadas a partir de los patrones de dispersión de rayos X. Los videos digitales fueron revisados ​​de forma independiente por dos observadores entrenados para fractura y deslizamiento de tejido (p. ej., deslizamiento entre el cúbito y el radio). Luego, estos eventos se compararon en el tiempo con las curvas de deformación y todos los datos de tensión-deformación se truncaron a la primera fractura. Solo se consideraron en el análisis los datos hasta la primera fractura. Se excluyeron los especímenes si había un deslizamiento entre las mordazas de tracción y los huesos, o si había un deslizamiento entre el radio antes de la primera fractura. Las muestras también se excluyeron si había poca correspondencia entre el tejido y las curvas de tensión SAXS, lo que indica que el punto del haz se centró en el cúbito pero la mayor parte de la tensión se transfirió al radio.

2.7 Evaluación de sitios coincidentes de la composición y el módulo del tejido óseo a microescala

Después de la flexión de tres puntos, los fémures se deshidrataron histológicamente en una serie graduada de etanol, se aclararon en acetona y se incluyeron en PMMA. Los huesos incrustados se seccionaron en la diáfisis femoral media utilizando una sierra de diamante de baja velocidad (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Las muestras se trituraron con papel de carburo de silicio húmedo (60{{1{0}} y grano 1200) y luego se pulieron con pastas de alúmina (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) y ropa fina de rayón (South Bay Technologies, San Clemente, CA) hasta un acabado final de 0,05 µm. Las muestras se sonicaron entre cada paso de pulido.

La espectroscopia Raman se realizó en mapas que abarcaban el grosor cortical con un sistema personalizado: un sistema de microscopía confocal inVia de Renishaw (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Reino Unido) que usaba luz láser de longitud de onda de 785 nm que se enrutaba a través de cables de fibra óptica a un 5{ {4}}objetivo x (NA 0,75) montado en una platina Z de nanoindentador (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Para cada ubicación, se recolectaron 10 acumulaciones de 10-segundos de exposición. Filas de tres muescas separadas 15 µm se extendían cada 10 µm a través del grosor cortical.

La línea base fluorescente se sustrajo con un ajuste polinómico de orden 11 y los rayos cósmicos se eliminaron con el software Renishaw WIRE. Se restó un espectro de PMMA de referencia de cada punto utilizando un código MATLAB personalizado. Estos espectros corregidos luego se analizaron para prolina (855 cm-1), fosfato ν1 (961 cm-1) y carbonato ν1 (1071 cm-1). Luego se calcularon las proporciones de área para mineral: matriz (fosfato: prolina),

carbonato: fosfato y cristalinidad (inverso de la mitad del ancho a una altura máxima completa del pico de fosfato v1).

Luego se realizó la nanoindentación en ubicaciones que coincidían con los sitios evaluados con espectroscopia Raman. Una punta esférica de 5 µm indentó el hueso a 30 nm/s hasta que se obtuvo una profundidad máxima de 500 nm. Esta profundidad se mantuvo durante 120 s para permitir la disipación de la energía viscoelástica. El módulo reducido (Er) se calculó utilizando el análisis de Oliver-Pharr, considerando el primer 45 por ciento de la curva de descarga (42,43).

2.8 Cromatografía líquida de alta resolución

Se diseccionó el húmero de todo el tejido blando y se extrajo la médula ósea con agua. Humeri fueron C, y luego se centrifugaron para evaporar el exceso de HCl. Las muestras filtradas se diluyeron 1:5 en 10 por ciento de acetonitrilo y 0.05 por ciento de ácido heptafluorobutírico (HFBA), cargadas en un Gemini-NX C de fase inversa{{7} } (Phenomenex, Torrance, CA), y se analizaron los entrecruzamientos de hidroxilisilpiridinolina (HP), lisilpiridinolina (LP) y pentosidina de acuerdo con los métodos descritos por Bank et al(44). Los detalles del sistema HPLC (modelo 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) se describen detalladamente en Oren et al(45). La separación de los entrecruzamientos de colágeno implicó el siguiente protocolo: 15 min. del solvente que contiene 24 por ciento de metanol y 0.15 por ciento de HFBA, 10 min. del disolvente que contiene 40 por ciento de metanol y 0,05 por ciento de HFBA, y 10 min. del disolvente que contiene 75 por ciento de acetonitrilo y 0,1 por ciento de HFBA. La columna se equilibró en metanol al 24 por ciento y HFBA al 0,15 por ciento durante al menos 10 min. entre ejecuciones de muestra. Los picos de reticulación de colágeno se midieron con un detector de fluorescencia (FP1520, JASCO; Easton, ML). Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron 295 nm y 400 nm, respectivamente, para HP y LP. Se detectó pentosidina con excitación de 328 nm y emisión de 378 nm. Las curvas de calibración se generaron a partir de las intensidades medidas de cinco diluciones de un calibrador que contenía HP y LP purificadas (Quidel Corporation) y pentosidina (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Las concentraciones de entrecruzamiento luego se normalizaron a la concentración de colágeno. El colágeno se estimó a partir de la concentración de hidroxiprolina dentro de la muestra analizada para entrecruzamientos. Una alícuota de la muestra analizada para reticulaciones se diluyó 1:50 y se derivatizó con cloroformiato de 9-fluoronilmetilo (46). Se usaron las siguientes soluciones para el protocolo de aminoácidos (1) ácido cítrico 20 mM, cloruro de tetrametilamonio 5 mM y 0,01 por ciento de azida sódica, pH 2,85; (2) acetato de sodio 20 mM, cloruro de tetrametilamonio 5 mM y azida de sodio al 0,01 por ciento, pH 4,5, y (3) acetonitrilo al 100 por ciento. El perfil de elución en gradiente es el siguiente: de 0 a 11,5 min. un gradiente de 75 por ciento (1)/25 por ciento (3) a 60 por ciento (1)/40 por ciento (3), a los 13 min. cambiar a 64 por ciento (2) / 36 por ciento (1), de 13,1 a 18 min. un gradiente de 64 por ciento (2) / 36 por ciento (3) a 62 por ciento (2) / 38 por ciento (3), luego a los 18 min. un cambio a 25 por ciento (2)/75 por ciento (3) hasta el final de la serie a los 23 min. La columna se equilibró en 75 por ciento (1)/25 por ciento (3) durante al menos 10 min. entre ejecuciones de muestra. Los picos de aminoácidos se controlaron con una excitación de 254 nm y una emisión de 630 nm. Se generó una curva de calibración a partir de cinco diluciones de un patrón de aminoácidos preparado a partir de hidrolizado de colágeno (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). El colágeno tiene una concentración constante de hidroxiprolina, por lo que la concentración de hidroxiprolina se convirtió en una concentración de colágeno (285 mol de hidroxiprolina por mol de colágeno).

2.9 Medición de AGE fluorescentes

Los AGE fluorescentes en cada muestra se determinaron mediante un ensayo fluorométrico que compara la fluorescencia endógena a granel del tejido óseo con un estándar de quinina. Una alícuota del hueso hidrolizado resuspendido con el estándar interno para HPLC se diluyó con agua DI a una concentración de 1,6 ug de hueso/ml de solución. La fluorescencia del hidrolizado diluido y una solución madre de quinina diluida en serie (solución madre: 10 ug de quinina/ml de H2SO4 0,1 N) se midieron en una placa 96-pocillo (Producto n.º 3370, Corning) utilizando un lector de microplacas multimodo (Synergy H1, BioTek) a una excitación de 360 ​​nm y una emisión de 460 nm.

Los AGE fluorescentes a granel se normalizaron al contenido de colágeno del tejido óseo utilizando un ensayo colorimétrico de hidroxiprolina. Brevemente, el hidrolizado se diluyó adicionalmente para acumular μ/ed de solución madre de hidroxiprolina (200 μg de L-hidroxiprolina/ml de HCl 0,001 N). Se añadió cloramina-T al hidrolizado diluido para iniciar la reacción y las soluciones se incubaron durante 20 min. a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido perclórico 3,15 M y después de 5-min. período de incubación a temperatura ambiente, se añadió p-dimetilaminobenzaldehído. A continuación, la solución se incubó en un baño de agua a 60 grados durante 20 min, luego se enfrió en agua fría en la oscuridad a temperatura ambiente. La absorbancia de las muestras y los estándares se midió a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector de microplacas. Los AGE fluorescentes se informan en unidades de ng de fluorescencia de quinina/mg de colágeno.

2. 10 3 Geometrías lacunares de osteocitos D

La tibia izquierda se deshidrató histológicamente en una serie graduada de etanol y se tiñó con fucsina básica al 1 por ciento (47). Luego, las tibias se limpiaron con acetona y se incluyeron en poli (metil) metacrilato (PMMA). Las muestras incrustadas se seccionaron transversalmente 1 mm proximal a la unión de la tibia y el peroné con una sierra de baja velocidad (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Se preparó una sección rectificada a partir de la sección distal con un espesor objetivo de 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

Las imágenes de las secciones del suelo se realizaron en transmisión con un microscopio de escaneo láser confocal Zeiss LSM 710, con excitación de 555 nm, filtro de paso de banda de 568–1000 nm y objetivo de inmersión en aceite de 40x. La resolución en las direcciones x, y y z fue de 0,447 y 0,493 µm, respectivamente. Las pilas z verticales se obtuvieron a través del rango visible de las lagunas de osteocitos (50–100 µm de profundidad de imagen). ). Brevemente, cada imagen 2D dentro de una pila z se segmentó automáticamente para definir las lagunas, que luego se reconstruyeron en 3D. Con base en los elipsoides de mejor ajuste, las lagunas se analizaron en cuanto a volumen, área de superficie, centro de masa más cercano, esfericidad (proporción de radios lagunares más pequeños a más grandes, donde 1=esfera), amplitud theta (valor absoluto de la diferencia de la Vector 3D que describe la dirección del eje principal desde la dirección promedio de todas las lagunas), achatamiento (−1=perfectamente achatado, 1=perfectamente achatado) y densidad numérica lagunar (número de osteocitos/volumen de imagen).

2.11 Análisis de datos

Los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Para cada matriz de espectroscopia Raman y nanoindentación se promediaron de manera que cada hueso tuviera un valor para cada medida de microescala. De manera similar, se calculó una desviación estándar para cada matriz para estimar la variabilidad espacial del tejido óseo a microescala. Los efectos del envejecimiento y la ERC, así como su interacción, se probaron con ANOVA de dos vías para todos los parámetros. Las variables dependientes se transformaron si fue necesario para satisfacer los supuestos de normalidad residual y homocedasticidad. La significancia para los efectos principales se fijó a priori en p < 0.05.="" en="" el="" caso="" de="" una="" interacción="" significativa="" entre="" la="" edad="" y="" la="" erc,="" se="" realizaron="" pruebas="" post-hoc="" para="" probar="" el="" efecto="" de="" la="" erc="" dentro="" de="" cada="" edad.="" se="" controló="" un="" error="" familiar="" para="" estos="" análisis="" post-hoc="" utilizando="" el="" alfa="" ajustado="" por="" bonferroni,="" lo="" que="" resultó="" en="" un="" alfa="" crítico="" de="" 0.05="" 3="0.017." los="" resultados,="" donde="" las="" comparaciones="" de="" efectos="" simples="" tenían="" valores="" de="" p="" entre="" 0,017="" y="" 0,05,="" se="" interpretaron="" como="" no="">

Se realizó una regresión lineal para comprobar si las mediciones de la calidad ósea a escala nanométrica predicen la dureza mecánica del hueso completo. Debido a que las propiedades mecánicas de todo el hueso muestran una fuerte dependencia de la edad, esta regresión lineal incluyó la edad como una covariable. También se evaluaron las correlaciones de Spearman para las geometrías lacunares de los osteocitos y las medidas de la química del suero y la orina, y para la PTH y las medidas de la calidad ósea a microescala. La significancia para regresiones lineales y correlaciones se fijó en p < 0.05.="" minitab="" (v17)="" se="" utilizó="" para="" todos="" los="">

Los valores atípicos se identificaron a través de la prueba de Grubbs (nivel de significancia=0.05). Se excluyeron varios valores atípicos de los análisis de calcio sérico y urea. Se excluyó un valor atípico para 24-mes Sham y CKD para todos los análisis de microarquitectura cortical y trabecular, así como el análisis FEA. Se excluyó un valor atípico del grupo CKD de 24-meses para el análisis LP, y se excluyó un valor atípico del grupo Sham de 24-meses para la tenacidad, el trabajo hasta la fractura y el desplazamiento posterior a la fluencia. Se encontró un valor atípico separado de Sham de 24- meses para la desviación estándar del módulo de nanoindentación y la desviación estándar de la cristalinidad.