PARTE 1 El polisacárido de Cistanche Deserticola inhibe la pérdida ósea inducida por OVX en ratones y la osteoclastogénesis inducida por RANKL

1. Introducción

La osteoporosis, una enfermedad caracterizada por una disminución de la masa ósea, microestructura anormal del tejido óseo, aumento de la fragilidad ósea y fracturas (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli y Ginaldi, 2006), afecta actualmente a más de 200 millones de personas en todo el mundo y presenta un problema médico y carga socioeconómica en la sociedad moderna (Strom et al., 2011). El tratamiento clínico de la osteoporosis se centra principalmente en la terapia de reemplazo hormonal, bisfosfonatos o denosumab. Estos métodos son efectivos pero presentan efectos secundarios a largo plazo, como el riesgo potencial de cáncer de mama y fracturas atípicas de fémur (Black, Bauer, Schwartz, Cummings y Rosen, 2012; Rachner, Khosla y Hof-Bauer, 2011). Por lo tanto, existe una necesidad urgente de explorar fármacos que no solo puedan inhibirosteoporosispero también poseen menos efectos secundarios indeseables.

Cistanche desertica(CD), un tónico y alimento medicinal ampliamente utilizado en China, conocido como "ginseng del desierto", es el tallo seco suculento con hoja de escamas deC. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) y tiene diversas y efectivasfarmacológicoactividades, como la regulación inmunológica, la anti-oxidación y la anti-osteoporosis(Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Estudios previos sobre los principios activos de la CD en el tratamiento de la osteoporosis se centraron principalmente enfeniletanoideglucósidos(Li, Jiang y Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao y Ma, 2017). Sin embargo, el CD también contiene otros componentes efectivos como iridoides, lignanos,polisacáridos(Wang, Zhang y Xie, 2012). La aplicación clínica de la medicina tradicional china (MTC) es principalmente la decocción con agua.polisacáridosson componentes solubles en agua y es muy probable que sean los principales componentes farmacodinámicos de la MTC. Se informó ampliamente que los polisacáridos extraídos de la MTC tienen un efecto anti-osteoporosisy algunos efectos secundarios indeseables, que se han utilizado generalmente en clínicas (p. ej., polisacáridos extraídos de Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai y Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang y Yan, 2018) y Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de queCistanche deserticapolisacárido(CDP) extraído de CD puede ser un fármaco potencialmente seguro para el tratamiento de la osteoporosis.

Por lo general, la resorción ósea y la formación ósea mantienen un equilibrio dinámico durante la remodelación ósea en coordinación con varios tipos de células, incluidos los osteoclastos, los osteoblastos, las células del revestimiento óseo y los osteocitos (Kular, Tickner, Chim y Xu, 2012). Una ruptura en este equilibrio puede resultar en una variedad de enfermedades metabólicas óseas, comoosteoporosis(Zhu et al., 2018) y osteosclerosis (Ihde et al., 2011). Los osteoclastos, como células con diferenciación terminal derivadas del linaje mononuclear/macrófago, son las únicas células con función de reabsorción ósea (Teitelbaum, 2000). Hay dos citocinas clave que participan en la diferenciación y maduración de los osteoclastos (Koga et al., 2004): el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el ligando activador del receptor del factor nuclear κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF media la diferenciación de células madre hematopoyéticas en progenitores de osteoclastos y promueve la diferenciación de osteoclastos al aumentar la expresión del receptor RANK (Takayanagi, 2007). La unión de RANKL y RANK en la superficie celular de los osteoclastos da como resultado lo siguiente: (1) reclutamiento de moléculas adaptadoras de señalización como el factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6); (2) activación de múltiples dianas aguas abajo, incluyendo NF-κB y proteína quinasas activadas por mitógenos (MAPK); y (3) regulación al alza de los niveles de expresión del factor nuclear de células T activadas, citoplasmático 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). La activación de estas vías de señalización regula directamente la expresión de los genes de los osteoclastos, incluida la fosfatasa ácida 5 (Acp5) [que codifica la fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAcP)], la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9) y la catepsina K (CTSK) (Boyle, Simonet , y Lacey, 2003). Por lo tanto, la inhibición de las vías de señalización relacionadas con la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL es un método terapéutico potencial para la osteoporosis.

En este estudio, nuestro objetivo fue determinar los efectos del tratamiento con CDP en la ovariectomización inducida por (OVX).osteoporosismodelo de ratón in vivo y en la actividad de osteoclastos inducida por RANKL in vitro, con un enfoque en la expresión de genes específicos de osteoclastos y la activación de NFATc1 y las vías de señalización de NF-κB y MAPK. Nuestros hallazgos pueden proporcionar nuevos conocimientos sobre el potencial de CDP como un fármaco seguro y eficaz para el tratamiento de la osteoporosis.

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2. Materiales y métodos

2.1. Productos químicos y recogida de muestras.

El CD (n.º 180801) se adquirió de Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, China) y fue identificado por el profesor Haibo Huang de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad de Medicina China de Guangzhou, Guangzhou, China. Las tabletas de valerato de estradiol se adquirieron de Bayer (Leverkusen, Renania del Norte-Westfalia, Alemania). Medio esencial mínimo alfa-modificado

(-MEM) y suero bovino fetal (FBS) se obtuvieron de Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Penicilina/estreptomicina y el kit de tinción TRAcP se adquirieron de Solarbio (Beijing, China). Se adquirieron M-CSF de ratón recombinante y RANKL de ratón recombinante de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). Las placas recubiertas con hidroxiapatita se adquirieron de Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, EE. UU.). Los anticuerpos primarios para NFATc1 y CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU.); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK y P-JNK (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE. UU.); y -actina (CWBIO, Beijing, China) también se obtuvo. Los otros reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analítico y el agua fue purificada por el sistema de purificación de agua Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, EE. UU.).

2.2. extracción de CDP

El CD se molió hasta obtener un polvo fino y se mezcló con éter de petróleo tres veces para derrotarlo. El residuo sólido se recogió por filtración y luego se secó a temperatura ambiente. lospolisacáridosde las muestras pretratadas se extrajeron tres veces con agua durante 2 h, se concentraron, se precipitaron mediante la adición de etanol anhidro hasta una concentración final del 80 por ciento (v/v) y se almacenaron a 4 ◦C durante 24 h. Los precipitados se recogieron por centrifugación a 3000 rpm durante 20 min, se disolvieron en agua destilada y se purificaron (eliminación de proteínas libres) mediante el método Sevag (Zhao et al., 2019). el recuperadopolisacáridosfueron dializados, secados y almacenados hasta su uso posterior. Además, los resultados de la composición química mostraron que los contenidos totales de azúcar, ácido urónico, sulfato y proteína de CDP fueron 67.63 0.98 por ciento, 21.05 0.49 por ciento, 1.{{7 }}.24 por ciento y 8.81 0.36 por ciento.

La composición de monosacáridos y el análisis infrarrojo de transformada de Fourier de CDP se muestran en las figuras complementarias 1 y 2.

2.3. Modelo de ratón con osteoporosis inducida por OVX

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Medicina China de Guangzhou (aprobado SYXK 2019-0202). Treinta 6-ratones hembra C57BL/6 de una semana de edad fueron suministrados por el Experiment Animal Center de la Universidad de Medicina China de Guangzhou. Después de la aclimatación durante 1 semana, a un grupo de ratones se le realizó una operación simulada (grupo Sham), mientras que los ratones restantes se sometieron a una operación de ovariectomía (grupo OVX). Después de la cirugía, se permitió que los ratones se recuperaran durante 1-semanas. Luego, los ratones modelados con éxito se dividieron aleatoriamente en 5 grupos, con 6 ratones por grupo:

(1) Grupo simulado: tratado con agua destilada, (2) Grupo OVX: tratado con agua destilada, (3) Grupo OVX E2 (E2): tratado con 0tabletas de valerato de estradiol de 0,13 mg/kg, (4 ) Grupo de dosis baja de OVX CDP (CDP-L): tratado con 300 mg/kg de CDP, (5) Grupo de dosis alta de OVX CDP (CDP-H): tratado con 600 mg/kg de CDP. Se administró agua destilada, E2 o CDP por sonda una vez al día. Todos los ratones se sacrificaron después del período de tratamiento de 12- semanas (Fig. 1A). Se recogieron y pesaron los úteros y se recogieron las tibias izquierdas para exámenes posteriores. Se recolectaron muestras de sangre entera y se centrifugaron a 5000 rpm para

15 min a 4 ◦C. Los sobrenadantes de suero fueron aspirados y almacenados a

—80 ◦C hasta nuevo análisis.

2.4. Análisis de microtomografía computarizada (micro-CT) e histomorfometría ósea

Las tibias izquierdas se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento durante 48 horas y posteriormente se colocaron en tubos de centrífuga que contenían solución salina normal. Las muestras fijadas se escanearon con el instrumento micro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Bélgica) utilizando los siguientes ajustes: voltaje, 80 kV; corriente de fuente, 100 μA; Al, filtro de 0,5 mm; píxel

tamaño, 9,76 μm; y paso de rotación, 0.6◦. Varios parámetros de la

hueso trabecular, incluida la densidad mineral ósea (DMO), la fracción de volumen óseo (BV/TV), la superficie ósea por volumen total (BS/TV), el número trabecular (Tb. N) y el espacio trabecular (Tb. Sp) se midieron utilizando Software CT-Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Las imágenes tridimensionales se generaron usando el software CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

Después del análisis por micro-CT, las tibias izquierdas se descalcificaron en una solución de EDTA al 14 por ciento y se incluyeron en parafina para su corte. Las muestras se cortaron en secciones de 5 µm usando un micrótomo antes de los experimentos de tinción con hematoxilina y eosina (H&E) y TRAcP. Las secciones teñidas se examinaron y documentaron con el microscopio Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokio, Japón).

Cistanchepuede mejorar la densidad ósea y aliviar la osteoporosis

2.5. Análisis de suero

Las concentraciones de calcio (Ca) y fósforo (P) se determinaron de acuerdo con las instrucciones del kit diseñado por el Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China). Los niveles de TRAcP-5b y RANKL en el suero se analizaron utilizando el kit TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, China) y el kit RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, China), respectivamente.

2.6. Ensayo de osteoclastogénesis in vitro

Se aislaron BMM de la tibia y el fémur de ratones hembra C57BL/6 de 6-semanas de edad. Las células aisladas se cultivaron en medio -MEM que contenía 25 ng/ml de M-CSF, 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de penicilina/estreptomicina. Al llegar a la confluencia, las BMM (1 104 células/pocillo) se sembraron en 96-placas de pocillos y se trataron con CDP en presencia de 50 ng/mL de RANKL. El medio y CDP fueron reemplazados cada 2 días. Después de 7 días, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 por ciento y se tiñeron para determinar la presencia de TRAcP. El número de osteoclastos, definido como células positivas para TRAcP con tres o más núcleos, se contó y documentó utilizando un microscopio óptico.

2.7. Ensayo de proliferación celular

Los BMM (1 × 104 células/pocillo) se sembraron en una placa de 96-pocillos y se incubaron durante la noche. A continuación, las células se trataron con diferentes concentraciones de CDP (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 y 40 µg/mL) durante 48 h. La confluencia celular se detectó y analizó utilizando IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, EE. UU.), un sistema dinámico de imágenes de células vivas en tiempo real y a largo plazo.

2.8. Ensayo de reabsorción de hidroxiapatita

Los BMM ({{0}} células/pocillo) se sembraron en una placa recubierta de hidroxiapatita, se trataron con CDP a las concentraciones indicadas (0, 5 y 10 µg/ml) y se cultivaron en -MEM completo. que contiene 25 ng/ml de M-CSF y 50 ng/ml de RANKL. Después de 7 días, las células se lavaron con una solución de lejía al 10 por ciento para eliminar los componentes celulares. Las imágenes de las áreas de reabsorción de hidroxiapatita se capturaron con IncuCyte ZOOM® y se analizaron con el software ImageJ (NIH, Bethesda, MD, EE. UU.) (Abramoff, Magelhaes y Ram, 2003).

2.9. Aislamiento de ARN y análisis de PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR)

Los BMM ({{0}} células/pocillo) se sembraron en una placa de 6-pocillos y se estimularon con RANKL y M-CSF en presencia de CDP a diferentes concentraciones (0, 5 y 10 µg/ml) durante 5 días. El ARN total se aisló de las células o del tejido óseo de los ratones utilizando el reactivo TRIzol (Sigma-Aldrich). El ADN complementario se sintetizó a partir de 2 µg de ARN total usando un kit de transcriptasa inversa (TransGen Biotech, Beijing, China). Las reacciones de RT-qPCR se prepararon con PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) y se detectaron con el sistema ABI 7500 (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Los parámetros de ciclado para PCR se establecieron de la siguiente manera: 95 ◦C por 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ◦C por 15 s y 60 ◦C por 30 s. Los cebadores específicos utilizados se muestran en la Tabla 1, y la cantidad de cada gen diana se normalizó a GAPDH (control interno).

2.10. Análisis de Western Blot

Los BMM ({{0}} células/pocillo) se sembraron en una placa de 6-pocillos. Para experimentos de corta duración, las células se preincubaron con las diferentes concentraciones de CDP (0, 5 y 10 µg/mL) durante 1 h y luego se trataron con 50 ng/mL de RANKL durante 30 min. . Durante un curso prolongado, las células se estimularon con 50 ng/ml de RANKL los días 3, 5 y 7 en presencia de CDP (0, 5 y 10 µg/ml). Las proteínas totales se extrajeron utilizando el tampón de lisis RIPA (CWBIO). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10 por ciento y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 por ciento a temperatura ambiente durante 2 h, se incubaron con

anticuerpos durante la noche a 4 ◦C, y luego con el correspondiente

anticuerpos durante 1,5 h. Las membranas se desarrollaron utilizando reactivos ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, EE. UU.) y las imágenes se tomaron utilizando el sistema de imágenes de quimioluminiscencia Tanon 5200 (Tanon Science and Technology, Shanghái, China).

Cistanchepuede mejorar la densidad ósea

2.11. Detección de translocación de NFATc1 mediante prueba de inmunofluorescencia

Los BMM se sembraron en {{0}}cubreobjetos de pocillos, se estimularon con RANKL y M-CSF y se trataron con 10 µg/mL de CDP durante 5 días. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 min, se lavaron tres veces con PBS y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % durante 10 min. Las células se mezclaron con suero de cabra al 10 por ciento (CWBIO) y se incubaron durante 2 h. Posteriormente, las células se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ◦C y luego con el anticuerpo secundario anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) en la oscuridad durante 1 h. Los cubreobjetos se lavaron con PBS, se montaron en Prolong Gold Antifade Reagent with 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar), y

inspeccionado utilizando Zeiss LSM 800 con microscopio confocal Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

2.12. análisis estadístico

Todos los datos experimentales se analizaron con el software estadístico SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, EE. UU.). Los datos de los estudios en animales y células se expresan como medias ± SEM y medias ± SD, respectivamente. Los resultados se obtienen mediante el análisis de varianza unidireccional o la prueba t de Student. Los valores de p < 0.05="" se="" consideraron="" estadísticamente="">

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