PARTE 1 El equinacósido inhibe la liberación de glutamato al suprimir la entrada de Ca2 dependiente del voltaje y la proteína quinasa C en terminales nerviosas cerebrales de rata
Mar 07, 2022
Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 y Su Jane Wang 3,*
1 Departamento de Anestesiología, Far-Eastern Memorial Hospital, Pan-Chiao District, New Taipei City 22060, Taiwán; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)
2 Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad Yuan Ze, Taoyuan 32003, Taiwán
3 Escuela de Medicina, Universidad Católica Fu Jen, No. 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taiwán.
Resumen:El sistema glutamatérgico puede estar involucrado en los efectos de las terapias neuroprotectoras. Echinacoside, un glucósido feniletanoide extraído de la hierba medicinal chinaHerba Cistanche,Tiene efectos neuroprotectores. Este estudio investigó los efectos del equinacósido en la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en terminales nerviosas cerebrocorticales de rata (sinaptosomas). Ca inhibido por equinacósido2 más-dependiente, pero no Ca2 másLiberación de glutamato inducida por 4-aminopiridina independiente de una manera dependiente de la concentración. El echinacósido también redujo el aumento de Ca libre citoplasmático provocado por 4-aminopiridina2 másconcentración pero no alteró el potencial de membrana sinaptosómica. El efecto inhibitorio del equinacósido sobre la 4-liberación de glutamato provocada por aminopiridina fue impedido por la cu-conotoxina MVIIC, un bloqueador de amplio espectro de los canales Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) , pero fue insensible al Ca intracelular2 másinhibidores de liberación dantroleno y 7-cloro-5-(2-clorofenilo)-1,5-dihidro-4,1-benzodiazepina{{ 8}}(3H)-uno (CGP37157). Además, el equinacósido disminuyó la fosforilación de la proteína quinasa C inducida por 4-aminopiridina, y los inhibidores de la proteína quinasa C abolieron el efecto del equinacósido sobre la liberación de glutamato. De acuerdo con estos resultados, sugerimos que el efecto inhibitorio del equinacósido sobre la liberación evocada de glutamato está asociado con una reducción del Ca dependiente de voltaje.2 másentrada y posterior supresión de la actividad de la proteína quinasa C.
Palabras clave:equinacósido; liberación de glutamato; terminales nerviosas cerebrocorticales; Ca dependiente del voltaje2más canales; proteína quinasa C de la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la oclusión de la arteria cerebral media[9-12]. Sin embargo, el mecanismo a través del cual el equinacósido induce la neuroprotección no se comprende completamente.
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equinacósidoen cistanche tienen muchas funciones
1. Introducción
equinacósidoes un importante glucósido feniletanoide presente enHerba Cistanche, una conocida medicina tradicional china utilizada para tratar el olvido, la impotencia y el estreñimiento crónico [1].equinacósidoPosee diversas bioactividades como la antioxidación, la antiinflamación, el cáncer, la hepatoprotección y la modulación inmunitaria [2–4]. Notablemente,echinacósidotiene efectos neuroprotectores; por ejemplo, puede proteger contra el estrés oxidativo o la neurotoxicidad inducida por neurotoxinas en neuronas corticales primarias de rata, células SH-SY5Y de neuroblastoma humano y células de feocromocitoma (PC12) [5–8]. Es más,echinacósidoatenúa el daño cerebral y mejora la función cognitiva en modelos animales de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y oclusión de la arteria cerebral media [9-12]. Sin embargo, el mecanismo a través del cualechinacósidoinduce la neuroprotección no se entiende completamente.
La neuroprotección es un proceso complejo de preservación de la estructura y función neuronal ante agresiones tóxicas. La reducción de la excitotoxicidad del glutamato se considera un mecanismo potencial involucrado en la neuroprotección cerebral. El glutamato, un neurotransmisor de aminoácidos excitatorios, tiene un papel crucial en varias funciones cerebrales [13]. Sin embargo, la sobreactivación de los receptores de glutamato bajo altas concentraciones de glutamato causa una sobrecarga de Ca2+ intracelular, disfunción mitocondrial, producción de radicales libres y muerte neuronal [14,15]. Este proceso patológico está implicado en numerosos trastornos cerebrales, como la isquemia cerebral, la lesión cerebral traumática, la epilepsia y las enfermedades neurodegenerativas [16,17]. Por lo tanto, los inhibidores que bloquean la transmisión glutamatérgica fisiopatológica se consideran fármacos neuroprotectores potenciales. Ejemplos notables de estos son los antagonistas de los receptores de glutamato [18,19]; sin embargo, los ensayos clínicos de estos fármacos han fracasado debido a la menor eficacia y los efectos secundarios no deseados o incluso citotóxicos [20,21]. Además del bloqueo directo del receptor de glutamato, la inhibición de la liberación de glutamato puede ser una estrategia eficaz para la neuroprotección. Varios neuroprotectores (p. ej., memantina y riluzol) pueden reducir la liberación de glutamato en tejidos cerebrales de rata [22–24].
Teniendo en cuenta el papel del glutamato en la excitotoxicidad y el perfil neuroprotector deechinacósido, el presente estudio utilizó terminales nerviosas aisladas (sinaptosomas) purificadas de la corteza cerebral de rata para investigar el efecto deechinacósidosobre la liberación de glutamato y más mecanismos potenciales explorados. La preparación de la terminal nerviosa aislada es un modelo bien establecido para estudiar la regulación presináptica de la liberación de neurotransmisores por fármacos en ausencia de efectos postsinápticos [25]. Mediante el uso de este modelo, evaluamos el efecto deechinacósidosobre la liberación de glutamato, el potencial de membrana, el flujo presináptico de Ca2 plus y la actividad de la proteína quinasa C. De acuerdo con nuestra revisión de la literatura, este es el primer informe que documenta el mecanismo a través del cualechinacósidoinhibe la liberación de glutamato endógeno a nivel presináptico.
Echinacoside puede anti-oxidación
2. Resultados
2.1. equinacósidoInhibe la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina de las terminales nerviosas cerebrocorticales de rata mediante la reducción de la exocitosis vesicular
La Figura 1 ilustra el efecto dependiente de la concentración deechinacósidoen {{0}}liberación de glutamato provocada por aminopiridina de sinaptosomas cerebrocorticales de rata purificados. En sinaptosomas incubados con CaCl2 1 mM, 4-aminopiridina 1 mM provocó una liberación de glutamato de 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, que se redujo en 1, 5, 10, 30 y 50 µMechinacósidoa 6.5 ˘ 0.2, 5.8 ˘ 0.3, 4.8 ˘ {{10}}.2, 4.1 ˘ 0.1, o 2.3 ˘ 0.4 nmol/mg/5 min, respectivamente (F(5,24)=67.1, p=0.000). El valor IC50 paraechinacósidoLa inhibición mediada por 4-aminopiridina provocada por la liberación de glutamato, derivada de una curva de dosis-respuesta, fue de 24 µM. Además, la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina 1 mM en una solución extracelular libre de Ca2+ que contiene 300 µM de etilenglicol bis(-aminoetil éter)-N,N,N1,N{{ 13}}ácido tetraacético (EGTA) fue 2.1 ˘ 0.2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310.65, p=0.000), y este Ca2 el componente más independiente de la liberación de glutamato provocada por aminopiridina 4-no se vio afectado por 20 µMechinacósido(1,8 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,58; Figura 1). En los sinaptosomas tratados con 0,1 µM de bafifilomicina A1, un inhibidor del transportador vesicular [26], la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina se redujo significativamente (2,2 ˘ 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249.518, p=0.000). En presencia de bafifilomicina A1, el equinacósido 20 µM no logró inhibir significativamente la liberación de glutamato (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; Figura 1). Por el contrario, 10 µM de DL-treo-beta-bencil-oxiaspartato (DL-TBOA, un inhibidor de la recaptación de glutamato) [27], aumentó la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina a 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=´11.31, p=0.000). Incluso en presencia de DL-TBOA, 20 µMechinacósidoinhibió significativamente la liberación de glutamato provocada por {{0}}aminopiridina (7.7 ˘ 0.2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.{{ 12}}; Figura 1)
2.2. equinacósidoReduce el Ca citosólico2másConcentración pero no altera el sinaptosoma
Potencial de membrana
La despolarización del sinaptosoma causada por el aumento de Ca de 4-aminopiridina 1 mM2más concentración(p= 0.000; Tabla 1). La aplicación de 20 |vMechinacósidono afectó significativamente baral Ca2más concentración (t(8) = 0.06, p= 0.95), pero redujo significativamente el 4-aumento inducido por aminopiridina iia Ca2más concentración (t(10) = 6.16, p =0.000). Además, la 4-aminopiridina 1 mM aumentó en yoduro de 3',3',3'-dipropiltiadicarbocianina [DiSC3(5)] fluorescencia (p= 0.000). la adición o(El equinacósido 20 fdM no alteró el potencial de membrana en reposo (t(8)=0.976,p= 0.36) o cambiar significativamente el 4-aumento de DiSC mediado por aminopiridina3(5) fluorescencia (t(8) = —0.014, p= 0.99; Tabla 1).
Cistancheechinacósidopuede tratar la enfermedad renal
2.3. CO reducido2 másLa entrada a través de los canales Cav2.2 (tipo N) y Cav2.1 (tipo P/Q) puede estar asociada con la inhibición de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina porequinacósido
Figura 2 muestra que 2 cu-conotoxina MVIIC, un N-y Ca tipo P/Q2más bloqueador de canales,
reducción de {{0}}liberación de glutamato provocada por aminopiridina de 7.4 土 0.2 a 2.0 土 0.1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). En presencia de cu-conotoxina MVIIC, el efecto del equinacósido 20 pM sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina no fue significativo (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantroleno (10 ^M), un inhibidor del Ca intracelular2además de liberar Crom del retículo endoplásmico [28], reducir la liberación de glutamato provocada por aminopiridina 4- (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Sin embargo, en presencia de dantroleno, 20 pJMechinacósidoaún podría inhibir significativamente la liberación de glutamato (3.3 土 0.2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Se observaron resultados similares usando 7-cloro-5-(2-clorofenia)-1,5-dihidro-4,1-benzotiazepina 100 pM -2(3H)-ona (CGP37157), un bloqueador permeable a la membrana del Na mitocondrialmás/California2más intercambio. En las cinco preparaciones sinaptosómicas examinadas, 20 pMechinacósidocombinado con 100 pM CGP37157 redujo la liberación de glutamato evocada por 4-aminopiridina en un 48,3 por ciento 土 5,2 por ciento (F(2,13) = 136.79,p= 7.000), similar a la inhibición del equinacósido solo (46,2 % 土 2,3 %;p = 0.89;
2.4. equinacósidoInhibe 4-Evocado por aminopiridina (liberación de glutamato mediante señalización a través de la proteína quinasa C
Como se ilustra en la Figura 3, 10 grados jlM 2-[1-(3-dimetilaminopropil)indol-3-il]-3-(indol-3-il) maleimida (GF109203X), un inhibidor general de la proteína quinasa C [29], reducción de la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (F(2,13) = 19.46, p=0 .000). En los sinaptosomas tratados con GF109203X, el equinacósido 20 pM redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en solo un 5,5 % 土 1,8 % (p=0 0,89), menos que el equinacósido solo (42,4 % 土 2,3 por ciento ;p=f.000). Se obtuvieron resultados similares con 5,6,7,13-tetrahidro-13-metil-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pirrolo[3 ,4-c]carbazol-12-propanonitrilo (Go6976), un selectivo para las isoformas de la proteína quinasa C dependiente de Ca2 plus (a, |3I, |3II, y) [29]. En presencia de 3 p. m. Go6976, 20 p. m.echinacósidoredujo la liberación de glutamato en un 11,9 % 土 2,9 % (p=0 0,59), lo que significa una reducción significativa en comparación con la del equinacósido solo (42,4 % 土 2,3 %; p=0.000); Figura 3). Por el contrario, 3 pM de rottlerin, un inhibidor de la proteína quinasa C6 independiente de Ca2 plus [30], no alteró significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (1 mM) (p=0.45). Sin embargo, en presencia de rottlerin, el echinacósido 20 pM causó una inhibición promedio del 37,1 % ± 5,6 % de la liberación (F(2,13) = 19.72, p=0.{{33 }}), similar a la del echinacósido solo (p=0.41; Figura 3). Además, el inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógeno 2-(2-amino-3-metoxifenil)-4H-1-benzopirano-4-ona) (PD98059 ) (50 pM) y el inhibidor de la proteína quinasa A N-[2-(p-bromocinamilamino)etil]-5-isoquinolinasulfonamida (H89) (100 pM) redujo la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (pág=0.000). Incluso en presencia de PD98059 o H89, 20 pMechinacósidoredujo efectivamente la liberación (F(2,13) = 52.3, p=0.000; Figura 3).
La Figura 4 muestra que la 4-aminopiridina 11 mM aumentó la fosforilación de la proteína quinasa C en los sinaptosomas (t(4) = —6.871, p= 0.002). Cuando los sinaptosomas se pretrataron con equinacósido 20 pM durante 10 minutos antes de agregar 4-aminopiridina, 4-aminopiridina indujo la fosforilación de la proteína quinasa C disminuyó considerablemente (F(2a6) = 29.202, p = 0.00 1).
equinacósidoencistanchepuede impulsar elsistema inmunitario
2.5. equinacósido-La inhibición mediada por la liberación de glutamato no implica un ácido gamma-aminobutírico tipo A (GAB3AA) Receptor
En la Figura 5, el efecto del equinacósido sobre la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina en ausencia o presencia de SR95531 (un antagonista del GABAAreceptor) fue comparado. Además, SR95531 100 pM no alteró significativamente la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (1 mM). En el
Sinaptosomas tratados con SR95531-, la aplicación de equinacósido 20 pM dio como resultado una inhibición del 43 por ciento en la liberación de glutamato provocada por 4-aminopiridina (F(2,12)=42.63,p= 0.000), que no fue significativamente diferente de la inhibición producida por el equinacósido solo (40 por ciento;p= 0.000). Se obtuvo un resultado similar con otro antagonista del receptor GABAa, bicuculina (50 pM). La liberación medida en presencia de bicuculina y
