Parte 1: Efectos del extracto acuoso de Cistanche Tubulosa en la microbiota intestinal de ratones con trastornos intestinales

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Los trastornos de la microbiota intestinal están asociados con muchas enfermedades. *e extracto acuoso deCistanche tubulosa (CT), una fórmula herbaria china tradicional, se ha informado que juega un papel enprotegiendo el intestino humano. Sin embargo, se sabe poco sobre sus efectos sobre la microbiota intestinal. *El presente estudio se llevó a cabo para determinar si el extracto acuoso de CT puede modular el microbioma intestinal en ratones con trastornos intestinales. Encontramos que los dañadosmorfología intestinalresultantes del tratamiento con cefixima podrían rescatarse utilizando el extracto acuoso de CT. *La comparación de la diversidad microbiana entre los ratones tratados con el extracto de CT y los ratones de control también indicó que el trastorno en la comunidad de microbiomas de los grupos modelo podría restaurarse mediante el tratamiento con concentraciones altas y medias del extracto acuoso. El tratamiento con cefixima condujo a una disminución significativa de las bacterias del ácido láctico; sin embargo, la suplementación del extracto acuoso de CT recuperó el crecimiento de estas bacterias ácido lácticas. Además, el extracto acuoso de CT pudo moderar los cambios drásticos en las vías metabólicas del microbioma intestinal inducidos por la cefixima. *Estos hallazgos brindaron una idea de los efectos beneficiosos del extracto acuoso de CT en la microbiota intestinal y también proporcionaron una referencia importante para el desarrollo de fármacos relacionados en el futuro.

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Introducción

han demostrado que C.polisacáridos deserticolainducir la melanogénesis enmelanocitos, reducen el estrés oxidativo[15], alivian la disfunción cognitiva al regular los procesos antioxidantes y antiinflamatorios en ratas [16], protegen las células PC12 contra las lesiones inducidas por OGD/RP [17], mejoran la absorción de equinacósido in vivo y afectan la microbiota intestinal [ 18]. Los probióticos son microorganismos vivos no patógenos que tienen beneficios para la salud y confieren equilibrio microbiano en el tracto gastrointestinal cuando se administran en cantidades adecuadas [19]. *Pueden mejorar las respuestas inmunitarias celulares no específicas caracterizadas por la activación de macrófagos, células asesinas naturales (NK) y linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno y la liberación de varias citoquinas en una forma específica de cepa y dependiente de la dosis [20]. Las cepas probióticas mejoran las propiedades del epitelio intestinal a través de la modulación de TJ, y se ha demostrado que cepas probióticas específicas regulan la expresión de mucina, lo que influye en las propiedades de la capa mucosa y regula indirectamente el sistema inmunitario intestinal [21]. Las cepas de bacterias del ácido láctico (LAB) y Bifidobacterium son los principales probióticos que se han utilizado en muchos campos [22-26]. *Sus beneficios para la salud son numerosos, siendo su capacidad antioxidante un factor importante en sus funciones relacionadas con la salud[27]. Los probióticos pueden quelar iones metálicos para evitar que catalicen la oxidación [28, 29]; también pueden aumentar la expresión de enzimas antioxidantes [30, 31], producir varios metabolitos con actividad antioxidante [32, 33], mediar en las vías de señalización antioxidantes [34–36] y regular las enzimas que producen especies reactivas de oxígeno (ROS) y la respuesta de los intestinos. microorganismos al estrés oxidativo[37]. Un estudio reciente demostró que los polisacáridos de CD podrían estimular el crecimiento de algunas bacterias del ácido láctico, lo que podría beneficiar la salud humana [38]. Sin embargo, el contenido de polisacáridos en CD es diferente al de CT [7, 39], y esta diferencia puede conducir a efectos diferentes en los microorganismos intestinales. Además, aunque los polisacáridos de CD pueden reducir el estrés oxidativo al activar la vía NRF2/HO-1 [15], los efectos de polisacáridos individuales pueden diferir del efecto general de múltiples composiciones en CT. Por lo tanto, es necesario definir con precisión los efectos de los extractos acuosos de CT sobre los microorganismos intestinales. Además, los ventiladores también pueden resistir el estrés oxidativo [40] y suprimir las respuestas inflamatorias mediadas por lipolysaccha ride mediante la activación de la vía Keap1/Nrf2/HO-1 [41]. *antes, determinar el efecto del extracto acuoso de CT es de gran valor. Además, los efectos de ciertos componentes del extracto acuoso de CD sobre el estrés oxidativo y la flora intestinal sugieren que la resistencia al estrés oxidativo podría estar correlacionada con cambios en la flora intestinal. Con el fin de llenar los vacíos en el conocimiento sobre los temas mencionados anteriormente, investigamos los efectos del extracto acuoso en la microbiota intestinal de ratones con trastornos de la flora intestinal. *Estos resultados proporcionarán información valiosa sobre los posibles mecanismos a través de los cuales cambia la flora intestinal y confiere resistencia intestinal al estrés oxidativo.

2. Materiales y métodos

se administraron diariamente a las 12:00 h, y otras sustancias se administraron diariamente a las 15:00 h. Durante los experimentos, los grupos C, D, E y F se mantuvieron en el estado modelo de trastornos intestinales. *Las heces se recolectaron cada siete días en una mesa operable estéril y se almacenaron a -20 grados .2.4. Observación Histopatológica del Colon de Ratón. Al final del experimento, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y el contenido de su colon se recogió en una mesa operable estéril y se almacenó a -80 grados; al mismo tiempo, las muestras de tejido colónico se fijaron en formalina neutra al 10 por ciento.* Las muestras se deshidrataron usando una concentración de gradiente de etanol, se hialinizaron con xileno, se incluyeron en parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Los cambios morfológicos en la mucosa colónica se observaron y compararon usando un microscopio óptico. Se midió la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas en el colon, y se calculó la relación entre la longitud de las vellosidades y la profundidad de las criptas (valor V/C) (51).2.5. Extracción de ADN y construcción de bibliotecas. El ADN se extrajo de las heces utilizando el EZNA ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ADN se determinó con un fluorómetro (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, EE. UU.). Se diseñaron cebadores emparejados en la región V3-V4 del ADNr 16s para amplificar la región y producir fragmentos de ADN de 466 pb. *El cebador directo era 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), y el cebador inverso era 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Cada volumen de PCR era de 25 μL, que contenía 2,5 μL de tampón de PCR 10 ×, 2 μL de dNTP, 1 μL de cada cebador y 20–30 ng de ADN molde. *es, los adaptadores indexados se adjuntaron al final de los amplicones para generar bibliotecas de secuenciación. *las bibliotecas se validaron con un fluorómetro QuantiFluor™ y se cuantificaron a 10 nmol.2.6. Secuenciación del gen 16s rRNA y análisis de la comunidad microbiana. *Se utilizó la plataforma Illumina (Illumina MiSeq) para obtener datos de extremos emparejados de 2 × 250 pb. Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se obtuvieron utilizando el software Uparse a través de un agrupamiento estándar con un 97 por ciento de similitud. * Se utilizó el algoritmo de asignación bayesiana ingenuo del clasificador RDP para alinear las OTU con la versión 13.5 de la base de datos Greengene y realizar la anotación de especies. *La diversidad alfa de la microbiota intestinal se calculó mediante los índices de Shannon y Simpson, y las diferencias entre grupos se analizaron mediante el análisis discriminante lineal Tamaño del efecto (LEfSe). * La diversidad beta se analizó mediante el análisis de coordenadas principales (PCoA) de las diferencias de Brady-Curtis. Se utilizó PICRUSt2 para estimar la capacidad metabólica microbiana del microbioma intestinal [42].2.7. Análisis de datos estadísticos. SPSS 20 se utilizó para ANOVA unidireccional y los datos experimentales se expresaron como X ± S; X indica el valor promedio y S indica la desviación estándar.

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3. Resultados

3.1. 8 Efecto del extracto acuoso de CT en la morfología del colon.* Los compuestos representativos (equinacósido y acetónido) y sus concentraciones del extracto de CT se validaron mediante HPLC (Figura S1). Para determinar el efecto del extracto acuoso en el intestino, investigamos la longitud de las vellosidades del colon y la profundidad de los recesos después del tratamiento con el extracto acuoso. * Las vellosidades del colon en los grupos de dosis normal y alta (A, B y D) eran más largas y en forma de dedo, mientras que las vellosidades del colon en el modelo y los grupos de dosis baja (C y F) eran cortas y las puntas de los las vellosidades del colon estaban rotas (Figura 1). En consecuencia, el extracto acuoso de CT en dosis altas aumentó significativamente la longitud de las vellosidades del colon y redujo la profundidad del receso en ratones con trastornos intestinales en comparación con los ratones del grupo modelo (P < 0.01).="" en="" contraste,="" la="" profundidad="" del="" receso="" no="" fue="" significativamente="" diferente="" entre="" el="" grupo="" de="" dosis="" alta="" y="" el="" grupo="" normal="" (p=""> 0.05) (Tabla S1). *Estos resultados indicaron que la alta dosis del extracto acuoso de CT puede mejorar la morfología dentro del colon de ratones con trastornos intestinales.3.2. 8e Efecto del extracto acuoso de CT sobre la diversidad de la microbiota intestinal. Realizamos la secuenciación del gen 16s rRNA para investigar la posible causa de los cambios morfológicos dentro del colon e investigar los cambios en la microbiota intestinal después del tratamiento con el extracto acuoso de CT. Se obtuvo un promedio de 100 553 etiquetas efectivas, con un rango de 77 734 a 125 144, a partir de los datos sin procesar (Tabla S2). *los ciervos se agruparon en 4932 OTU (Tabla S3). Luego analizamos la diversidad de la microbiota intestinal basándonos en Theseus. *e Los índices de Shannon y Simpson no mostraron diferencias entre el grupo A (normal con el extracto acuoso CT) y el grupo B (normal sin el extracto acuoso CT) (Figura 2(a)). *Se indica que en los ratones sin tratamiento con cefixima, el extracto acuoso de CT podría no haber tenido efectos beneficiosos o perjudiciales adicionales sobre la diversidad de la microbiota intestinal. Sin embargo, la diversidad en el grupo modelo (C) mostró una tendencia decreciente en comparación con la de los grupos normales. * Los ratones tratados con extractos acuosos de CT en dosis altas y medias mostraron signos de recuperación de la diversidad, mientras que tal fenómeno no se observó en los ratones tratados con el extracto acuoso de CT en dosis bajas (Figura 2 (a)). Mientras tanto, el PCoA reveló que los grupos normales (A y B) y los grupos con trastornos intestinales a los que se les administró extractos acuosos en dosis alta (D) y dosis media (E) tendieron a tener distancias entre muestras más cortas que las del grupo modelo y las del grupo bajo. -dosis del grupo de suplemento de extracto acuoso (F) (Figura 2(b)). *los resultados indicaron que el extracto acuoso de CT podría ayudar a mejorar la diversidad de la microbiota intestinal en ratones con trastornos intestinales.

3.3. Cambios en la composición de la microbiota intestinal tratada con el extracto acuoso de CT. *Los perfiles de composición de la microbiota se compararon entre diferentes grupos. A nivel de filo, la abundancia relativa de Proteobacteria en el grupo modelo fue mayor que en los otros grupos.

Figura 1: *e efecto del extracto acuoso de Cistanche tubulosa (CT) sobre la morfología del colon: A, un grupo normal al que se añadió una dosis media de extracto acuoso de Cistanche tubulosa (CT); B, grupo normal; C, grupo modelo; D, el grupo modelo con extracto acuoso de CT de dosis alta agregado; E, un grupo modelo con extracto acuoso de CT de dosis media agregado; F, un grupo modelo con extracto acuoso de CT de baja dosis añadido. (a) Grupo A. (b) Grupo B. (c) Grupo C. (d) Grupo D. (e) Grupo E. (f ) Grupo F.

(Figura 3(a)). * El aumento de Proteobacteria sugirió que la cefixima cambió el microbioma de los ratones modelo y que el extracto acuoso de CT podría beneficiar a la microbiota intestinal, ya que el aumento de la prevalencia de Proteobacteria es un marcador central de la flora intestinal alterada [43–45]. Además, a nivel de género, la abundancia relativa de Lactobacillus en el grupo modelo disminuyó en comparación con la de los grupos de dosis normal y alta; sin embargo, aumentó en comparación con el grupo de dosis media y baja (Figura 3 (b)). *estos resultados indicaron que la dosis alta de extracto acuoso podría promover el crecimiento de algunas bacterias del género Lactobacillus. La microbiota diferencial entre los grupos estudiados se determinó adicionalmente de acuerdo con el análisis LEfSe. *El análisis mostró que, después del tratamiento con cefixima, las abundancias relativas de Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales y Chloroflflexi aumentaron significativamente, mientras que las abundancias relativas de lactobacillus, Eubacterium_nodatum_group, Pseudono cardiales y el grupo Christensenellaceae_R-7_disminuyó significativamente en comparación con los del grupo normal (Figura 4(a)). Sorprendentemente, cuando el grupo modelo se complementó con la dosis alta de extracto acuoso de CT, las abundancias relativas de Muribaculaceae, Lactobacillus, Kin eosporiaceae, Eubacterium no datum group y Pedobacter aumentaron significativamente en comparación con las del grupo modelo. Mientras tanto, las abundancias relativas de Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostri dium_9 y Candidatus Stoquefifichus disminuyeron significativamente en comparación con las del grupo modelo (Figura 4(b))

Figura 2: Análisis de diversidad de microbiota intestinal de heces de ratones. (a) -Diversidad de comunidades bacterianas medida por el índice de Shannon (A) y el índice de Simpson (B); (b) el gráfico de análisis de coordenadas principal (PCoA) que visualiza los datos basados ​​en las diferencias de Bray-Curtis. A, grupo normal con extracto acuoso de Cistanche tubulosa (CT) de dosis media agregado; B, grupo normal; C, grupo modelo; D, grupo modelo con extracto acuoso de CT de alta dosis añadido; E, grupo modelo con extracto acuoso de CT de dosis media agregado; F, grupo modelo con extracto acuoso de CT de baja dosis añadido.