Parte 1: Mapeo de la interacción epigenómica y transcriptómica durante la formación y recuperación de la memoria en el conjunto de engramas del hipocampo

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Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila-Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Instituto Picower para el Aprendizaje yMemoria, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos.

2Departamento de Ciencias Cerebrales y Cognitivas, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, EE. UU.

3Laboratorio de Ciencias de la Computación e Inteligencia Artificial, Instituto Tecnológico de Massachusetts, Cambridge, Massachusetts, EE. UU.

4División de Medicina Neonatal, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, EE. UU.

5Broad Institute de Harvard y MIT, Cambridge, Massachusetts, EE. UU.

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Resumen

El epigenoma y la arquitectura genómica tridimensional (3D) están emergiendo como factores clave en la regulación dinámica de diferentes programas transcripcionales necesarios para las funciones neuronales. Aquí utilizamos un sistema de etiquetado dependiente de la actividad en ratones para determinar el estado epigenético, la arquitectura del genoma 3D y el panorama transcripcional de las células de engrama durante la vida útil dememoriaformación y recuerdo. Nuestros hallazgos revelan quememoriala codificación conduce a un evento de cebado epigenético, marcado por una mayor accesibilidad de los potenciadores sin los cambios transcripcionales correspondientes.Memoriala consolidación posteriormente da como resultado la reorganización espacial de grandes segmentos de cromatina y las interacciones promotor-potenciador. Finalmente, con la reactivación, las neuronas del engrama utilizan un subconjunto de interacciones denovolong-range, donde los potenciadores cebados se pusieron en contacto con sus respectivos promotores para regular al alza los genes implicados en la traducción local de proteínas en los compartimentos sinápticos. Colectivamente, nuestro trabajo aclara la transcripción integral y los Usuarios pueden ver, imprimir, copiar y descargar texto y extraer datos del contenido de dichos documentos, para investigación académica, sujeto siempre a las Condiciones de uso completas: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Correspondencia a: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Contribuciones de autor:

AM y L.-HT conceptualizaron y diseñaron el proyecto. AM y AZ realizaron experimentos de comportamiento, ISH, inmunotinción y análisis MARIS. CA realizó inyección de virus e inmunotinciones. AM y HSM realizaron experimentos ATAC-seq. AM y AZ realizaron experimentos nucleares de RNA-seq. AM, HSM y VD realizaron experimentos pc-Hi-C y Hi-C. AM, HSM, VD, RMR y JDV realizaron análisis ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD y FG realizaron análisis de RNA-seq nuclear. AM, VD, HSM y RMR realizaron análisis pc-Hi-C y Hi-C. Todos los autores ayudaron a interpretar los datos. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK y LHT escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores. LHT proporcionó las herramientas y supervisó el proyecto.

Conflicto de intereses:

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

el paisaje epigenómico a lo largo de la vida dememoriaformación y recuerdo en el conjunto de engramas del hipocampo.

La formación y preservación de la memoria a largo plazo depende de la expresión génica coordinada y la síntesis de proteínas sinápticas1. Estos procesos moleculares actúan dentro de una población específica de neuronas, denominadas células de engrama2–4. Los enfoques recientes que utilizan la expresión dependiente de la actividad de los reporteros proporcionaron un marco para explorar el conjunto de engramas5-8, pero los mecanismos moleculares que gobiernanmemoriael almacenamiento y la recuperación siguen siendo poco conocidos. Específicamente, las modificaciones epigenéticas y la arquitectura genómica 3D están emergiendo como un factor clave en la regulación dinámica de la expresión génica9–17, y hay una apreciación creciente de su importancia en la función, el desarrollo y la enfermedad neuronal14, 16, 18

En este caso, utilizamos el modelo de ratón de recombinación dirigida en poblaciones activas (TRAP)5,6, en el que las neuronas activadas que expresan el gen de la proteína asociada al citoesqueleto regulado por actividad (Arc) se etiquetan permanentemente de manera inducible. neuronas activadas durantememoriala codificación, consolidación y recuperación se clasificaron y sometieron a secuenciación de ARN nuclear (nRNA-seq), ensayo de cromatina accesible por transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq) y captura de conformación cromosómica (Hi-C). Nuestros datos demuestran quememoriala codificación conduce a un aumento en la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma, sin cambios esperados en la expresión génica. Además, demostramos que la fase tardía de la consolidación de la memoria se asoció con la reubicación de grandes segmentos de cromatina (subcompartimentos) de entornos inactivos a permisivos, y la reorganización del paisaje de interacción promotor-potenciador. Finalmente, la reactivación de las neuronas durantememoriael recuerdo está asociado con las interacciones denovopromotor-potenciador, utilizando un gran subconjunto de los potenciadores que se prepararon durantememoriacodificación Estas interacciones promotor-potenciador están asociadas con un cambio sólido en la expresión de genes implicados en la síntesis local de proteínas y la morfogénesis sináptica.

Resultados

Identificación temporal y espacial de células de engrama activadas y reactivadas

El seguimiento de la actividad neuronal a lo largo del tiempo ha sido uno de los principales desafíos al estudiar células de engramas, ya que los marcadores de actividad neuronal, conocidos como genes tempranos inmediatos (IEG), vuelven a la línea de base poco después de la inducción1,2. Para superar esta limitación, aprovechamos el modelo TRAP5,6, que requiere dos transgenes, uno que expresa CreERT2 de un promotor Arc dependiente de la actividad y otro que permite la expresión del reportero de proteína fluorescente amarilla (eYFP), en un Cre- manera dependiente. La administración de tamoxifeno (TAM) a los ratones TRAP da como resultado una marca permanente de eYFP en las neuronas Arc activadas. Sin TAM, CreERT2 se retiene en el citoplasma y eYFP no se expresa (Datos extendidos Fig. 1a). Los ratones TRAP se sometieron al paradigma clásico de condicionamiento del miedo contextual (CFC) pavloviano (Fig. 1a), un método comúnmente empleado para estudiar recuerdos aversivos19. Aproximadamente entre 1,5 y 2 horas después de la exposición a FS, se recogieron cerebros para identificar i) la proteína de unión a ARN fox-1 homólogo 3 (Rbfox3), también conocida como NeuN plus y eYFP plus, neuronas etiquetadas que se activaron durante la exposición inicial (Activated -temprano), que se puede distinguir de ii) NeuN más /eYFP- neuronas en estado basal no activadas (Basal) (Fig. 1a). Después de cinco días, en ausencia de recuperación, recolectamos iii) NeuN más /eYFP más neuronas que fueron etiquetadas el día del entrenamiento, lo que denota a largo plazomemoriaconsolidación (Activado-tarde). en un

cohorte diferente, los ratones se volvieron a exponer al estímulo condicionado y la expresión de la proteína ARC endógena posterior se analizó 1,5 a 2 horas después de la nueva exposición. Esto permitió la identificación de iv) neuronas doblemente positivas NeuN plus /eYFP plus / Endogenous Arc plus engrama que se activaron durante el entrenamiento y se reactivaron durantememoriarecordar (Reactivado). En particular, aunque la recombinación de ADN puede no ocurrir completamente 1,5 a 2 h después de la FS, observamos una alta co-localización (promedio del 84 por ciento) entre la proteína Arc endógena y el reportero Arc: eYFP (Datos extendidos Fig. 1b), que también fue en consonancia con informes anteriores20.

Para confirmarmemoriacodificación y recuperación durante CFC, el comportamiento de congelación se registró durante el entrenamiento y la reexposición a señales que inducen miedo (Datos extendidos Fig. 1c). En consonancia con las publicaciones anteriores6,20, nuestros datos mostraron un aumento significativo en el número de neuronas eYFP plus (activadas temprana y tardíamente) en el hipocampo, en comparación con los ratones que no recibieron CFC en su jaula de origen (F (2, 70)=240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

La formación de la memoria se asocia con una mayor accesibilidad a la cromatina, predominantemente en los potenciadores.

Para comprender mejor las fuerzas moleculares que gobiernan los diferentes programas transcripcionales, medimos los cambios en la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma a lo largo de diferentes fases dememoria. Los tejidos del hipocampo se agruparon y los núcleos aislados (Datos extendidos Fig. 2a, Tabla complementaria 1) se sometieron a la preparación de la biblioteca ATAC-seq. El análisis de regiones accesibles diferencialmente (DAR) (Diffbind, modo DESeq2) entre todas las poblaciones (Fig. 2a) reveló que la mayoría de los cambios en el estado de la cromatina ocurren durante la fase temprana de la formación de la memoria, donde 7, 862 regiones en todo el genoma ganan accesibilidad (Basal vs. Temprana, Tabla Suplementaria 2). En contraste, observamos cambios relativamente mínimos en el estado de la cromatina al pasar de Activado temprano a Activado tardío (582 DAR) y entre neuronas Activadas tarde y Reactivadas (725 DAR), con un 48 por ciento de superposición entre ellas (Datos extendidos Fig. 2b ). Sorprendentemente, identificamos un gran porcentaje (52 por ciento) de DAR obtenidos de forma estable que se volvieron más accesibles en Activado temprano y permanecieron accesibles tanto en las neuronas Activadas tarde como Reactivadas (Fig. 2b, c; Tabla complementaria 2). Curiosamente, mientras que los cambios tempranos (basal frente a temprano) y los DAR obtenidos de forma estable se enriquecieron para las regiones intergénicas, los cambios tardíos de cromatina (temprano frente a tardío y tardío frente a reactivado) se enriquecieron principalmente para los sitios promotores (Fig. 2d).

Se proporcionó información funcional al evaluar cómo los DAR están marcados por diferentes modificaciones de histonas. En primer lugar, utilizamos ChromHMM para establecer un modelo de estado de la cromatina a partir de dos estudios independientes que utilizaron tejido de hipocampo a granel antes y después del impacto en el pie 21,22. A continuación, realizamos un análisis de enriquecimiento de veces (observado sobre la distribución esperada) de los DAR para estos diferentes estados y revelamos que los cambios tempranos de cromatina y los DAR estables se enriquecieron para las marcas de potenciadores (Fig. 2e; Datos extendidos Fig. 2c, Tabla complementaria 3) .

Estos resultados están en línea con publicaciones previas, que muestran que estimular el cultivo neuronal primario induce una actividad potenciadora prolongada12,23. A continuación, analizamos la superposición de loci estables individuales con H3K4me1 y H3K27ac21. Estas dos marcas de histonas delimitan diferentes poblaciones de potenciadores, que pueden ser "preparados" (solo H3K4me1), "activos" (H3K4me1 y H3K27ac) o "latentes" (sin marcas)18. Los picos estables mostraron una distribución entre potenciadores cebados y activos (datos extendidos Fig. 2d), donde se predijo que el 47 por ciento de estos sitios estarían "latentes" (sin superposición entre DAR y marcas de histonas21 obtenidas 1 h después de FS). Para confirmar nuestro modelo, realizamos inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para marcadores de histonas H3K4me1 y H3K27ac, seguido de qPCR. Se eligieron cuatro sitios seleccionados de nuestro análisis de modelado de potenciador putativo (datos extendidos Fig. 2d; potenciador 1: preparado preparado, potenciador 2- activo previsto, potenciador 3 y 4: latente previsto). De acuerdo con nuestro modelo, identificamos dos loci 'latentes' en el estado basal (potenciadores 3 y 4) que se transformaron a un estado 'activo' durantememoriaformación (Fig. 2f). Además, se encontró que el potenciador putativo 1 estaba "preparado" en el estado basal y se volvió activo, donde hubo un aumento estable significativo en los marcadores H3K27ac durante la fase tardía y el recuerdo (Fig. 2f). Juntos, estos datos indican que el repertorio de potenciadores recientemente accesibles se amplió en las neuronas de engrama potenciadas, donde las regiones latentes o cebadas obtuvieron marcas H3K4me1 y H3K27ac y, por lo tanto, se convirtieron en potenciadores activos.

Para comprender el papel funcional de las regiones promotoras y potenciadoras accesibles, realizamos un análisis de enriquecimiento de motivos (Tabla complementaria 4). Nuestros datos indican que la mayoría (70 por ciento) de los motivos en los promotores accesibles están igualmente enriquecidos y se identificaron en todas las fases dememoria(Datos ampliados Fig. 2e). Por el contrario, la mayoría de los sitios potenciadores mostraron distintos patrones de motivos de unión al factor de transcripción (TF) en diferentes fases de la memoria. Curiosamente, los motivos expresados ​​de manera ubicua del protooncogén Jun, la subunidad del factor de transcripción Ap-1 (es decir, Jun-Ap1) y la familia de TF del factor regulador X (Rfx), se enriquecieron significativamente solo después de la fase inicial de codificación (Datos extendidos Fig. 2e). Anteriormente se informó que el complejo Jun-Ap1 juega un papel central en la selección de potenciadores y podría actuar como un TF pionero para definir sitios potenciadores durante el desarrollo cerebral y la actividad neuronal12,24. Estos hallazgos son consistentes con nuestros datos que mostraron un alto porcentaje de loci latentes/cebados en el estado basal (Fig. 2f, Datos extendidos Fig. 2c, d). Por lo tanto, parece que la actividad neuronal podría desencadenar la unión de Jun-Ap1 a los potenciadores latentes, que luego recluta modificadores de cromatina que activan los potenciadores latentes. De manera similar, el enriquecimiento de los motivos del factor de transcripción Yin Yang 1 (Yy1) solo en los potenciadores de los estados temprano y tardío, sugiere que la organización promotor-potenciador es un proceso activo dememoriaformación, ya que recientemente se informó que Yy1 facilita la formación de estas interacciones de largo alcance25. Colectivamente, estos datos sugieren que la fase inicial dememoriaLa formación altera el panorama de accesibilidad de la cromatina en las neuronas activadas, con cambios estables de larga duración que ocurren predominantemente dentro de las regiones potenciadoras.

Cambios dinámicos en la arquitectura nuclear espacial y la accesibilidad de la cromatina durante la fase inicialmemoriaformación se corresponden con una mayor frecuencia de interacciones promotor-potenciador durantememoriarecuerdo

La arquitectura 3D nuclear está emergiendo como un factor clave en la regulación dinámica de la expresión génica, en muchas funciones neuronales26–28. Por lo tanto, estábamos interesados ​​en delinear los cambios precisos que ocurren en la organización espacial de la cromatina durantememoriaformación y consolidación. Producimos datos Hi-C de estado basal y eYFP más neuronas etiquetadas (tempranas y tardías, Tabla complementaria 5). La cromatina se segrega en dos compartimentos subnucleares espacialmente distintos, 'A' y 'B', correspondientes a la cromatina transcripcionalmente activa e inactiva, respectivamente15, 16,26. La evidencia preliminar sugiere que la actividad neuronal y la señalización extrínseca podrían inducir una reorganización de la arquitectura de la cromatina 3D14,27,28. Nuestro análisis del estado del compartimento15, 16,26 (Fig. 3a–c) reveló la reubicación de grandes segmentos de cromatina desde inactivo (B) al entorno permisivo (A) (y viceversa) durante la fase inicial y tardía dememoriaformación (212 segmentos cambiados de A a B, 127 de B a A, tamaño promedio de ~ 436 Kbp). Curiosamente, el 52 por ciento de las regiones en la fase temprana que cambiaron de B a A mantuvieron ese estado en la fase tardía (es decir, permanecieron en el estado A, Fig. 3b, c; Tabla complementaria 6). Además, casi todas estas regiones se superpusieron con los DAR obtenidos de nuestro análisis ATAC-seq, lo que confirma la transición del subcompartimento del entorno inactivo al permisivo (Fig. 3d). Estos datos indican que algunos loci experimentan un cambio de subcompartimento a través de diferentes fases de la memoria y, por lo tanto, podrían contribuir a cambios a largo plazo en las propiedades y funciones neuronales después de la activación inicial.

Si bien nuestros datos de Hi-C sugirieron una reorganización a gran escala, no quedó claro si esta reorientación permitió la interacción de nuevos repertorios de promotores y potenciadores y el ajuste de diferentes programas transcripcionales (Fig. 3e). Al utilizar la técnica Hi-C de captura de promotor (pc-HiC), estudiamos los cambios precisos que ocurren en las interacciones promotor-potenciadores durante el proceso dememoriaformación y recuerdo. Para este estudio, utilizamos "cebos" diseñados a medida dirigidos a ~5000 promotores29. De acuerdo con publicaciones previas29, detectamos ~ 19,000 (por grupo) interacciones significativas de promotores-potenciadores (67.5 por ciento) y promotores-promotores (46.2 por ciento) (Datos extendidos Fig. 3a, b).

Dado que los promotores en el cerebro de los mamíferos podrían estar bajo el control de múltiples elementos reguladores14,30,31, analizamos la superposición entre todos los potenciadores que interactúan y sus respectivos promotores. Hemos encontrado que durante cadamemoriafase, los mismos promotores interactúan con mayor frecuencia con un subconjunto distinto de potenciadores (es decir, únicos, basales: 3243, temprano - 7602, tardíos - 7028, reactivados: 7244; Fig. 4a, b; datos extendidos Fig. 3c; Tabla complementaria 7). Este resultado es consistente con publicaciones previas que muestran que múltiples potenciadores que rodean varios genes (c-Fos y Arc) son cruciales para su activación y su frecuencia de interacción con sus respectivos promotores se altera en respuesta a varios agentes despolarizantes en neuronas cultivadas31. También identificamos un subconjunto más pequeño de interacciones en las que los promotores interactuaban con los mismos potenciadores en diferentesmemoriafases (es decir, común, ~ 31 por ciento de todas las interacciones; Tabla complementaria 7). Además, las neuronas reactivadas presentaron puntajes de interacción significativamente más fuertes (según los cálculos de Chicago, Fig. 4b; datos extendidos, Fig. 3d). Por lo tanto, aunque el número de interacciones únicas fue similar en los estados temprano, tardío y reactivado, las puntuaciones de interacción más fuertes indican que las interacciones promotor-potenciador específicas ocurren con mayor frecuencia durante la memoria.

recuerdo. Esta noción fue validada aún más por experimentos 3C, con cebadores diseñados para medir la frecuencia de interacción entre el potenciador seleccionado (E) y los promotores de genes (P) que codifican para la subunidad D del factor 3 de iniciación de la traducción eucariota (Eif3d) o el receptor de glutamato, ionotrópico, kainato 3 (Grik3) (Fig. 4c). Nuestros datos mostraron que las neuronas reactivadas tuvieron un aumento significativo en la frecuencia de interacción entre el promotor Eif3d y el potenciador seleccionado, en comparación con las otras poblaciones (Fig. 4c). En conjunto, estos datos indican que las interacciones promotor-potenciador ocurren con mayor frecuencia durantememoriarecuerdo.

Luego, preguntamos si las interacciones dinámicas de largo alcance identificadas a través de pc-HiC corresponden a regiones de cromatina que se vuelven más accesibles, según lo determinado a través de ATAC-seq. Esto confirmaría que la mayor accesibilidad tiene una consecuencia funcional al generar nuevas interacciones promotor-potenciador. Para lograr esto, comparamos la superposición entre los potenciadores que interactúan en cada población celular con los DAR (observados) o un conjunto aleatorio de loci genómicos accesibles (esperados). Nuestro análisis reveló una superposición significativa entre los DAR ganados en las neuronas activadas tempranamente y los DAR ganados de manera estable con los potenciadores que interactúan, en todas las poblaciones celulares (Todas las Ps < 0.0001,="" datos="" extendidos="" fig.="" 3e).="" por="" el="" contrario,="" los="" cambios="" en="" la="" accesibilidad="" de="" la="" cromatina="" que="" ocurrieron="" durante="" la="" última="" fase="">memoriala consolidación y la reactivación no se superpusieron significativamente con los potenciadores que interactúan (Datos extendidos Fig. 3e). Juntos, estos resultados indican que la ganancia de accesibilidad durante la codificación de la memoria es un evento de cebado y estos loci cebados participan en interacciones promotor-potenciador funcionales de novo durante las fases posteriores dememoriaformación. Este paisaje dinámico se ilustra mediante la visualización de las regiones genómicas alrededor del gen de la subunidad A del factor 5 de iniciación de la traducción eucariota (Eif5a) (Fig. 4d). Esta disección molecular temporal de la vida útil del engrama destaca cómo el cebado coordinado del estado epigenético de una célula durantememoriala codificación y la consolidación facilitan las interacciones de largo alcance durante la reactivación.