Parte 1 Efectos preventivos de los glucósidos de feniletanol de Cistanche tubulosa en la fibrosis hepática inducida por albúmina de suero bovino en ratas

Contacto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Correo electrónico:audrey.hu@wecistanche.com

Resumen

Fondo:Cistanche tubulosa es una medicina herbal china tradicional que se usa ampliamente para regular la inmunidad.Feniletanol glucósidos de cistanche(CPhGs) de esta planta son los materiales principalmente eficaces. El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos preventivos y terapéuticos de las CPhG sobre la fibrosis hepática inducida por BSA en ratas y los mecanismos moleculares relacionados que involucran a las células estrelladas hepáticas. Biejiarangan (BJRG), otra medicina tradicional china a base de hierbas, se utilizó como control positivo. Métodos: En experimentos in vivo, 75 ratas SD se dividieron aleatoriamente en 6 grupos: normal (tratada con agua destilada), modelo (tratada con BSA), droga positiva (tratada con BSA más BJRG 60{{29} } mg/kg/día) y grupos tratados con BSA más CPhG (125, 250 y 500 mg/kg/día). Los índices de hígado y bazo, niveles séricos de aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT), ácido hexadecenoico (HA), laminina (LN), procolágeno tipo III (PCIII), colágeno tipo IV (IV-C), hidroxiprolina ( Hyp) y el factor de crecimiento transformante 1 (TGF- 1) se midieron en hígados de rata. Los grados histopatológicos de fibrosis hepática se evaluaron para cada grupo usando tinción tricrómica de Masson y H&E. La expresión de TGF- 1, colágeno I (Col-I) y colágeno III (Col-III) se determinó mediante un método de tinción inmunohistoquímica. Estos efectos se evaluaron adicionalmente in vitro mediante la determinación de los niveles de expresión de NF-κB p65 y Col-I mediante análisis de PCR en tiempo real cuantitativos. La expresión de la proteína Col-I también se examinó mediante transferencia Western. Resultados: Todos los grupos de dosis (125, 250 y 500 mg/kg/día) de CPhG redujeron significativamente el índice de hígado y bazo, disminuyeron los niveles séricos de ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C, contenido de TGF- 1 (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" y="" p="">< 0,01)="" y="" contenido="" de="" hyp.="" los="" cphg="" también="" aliviaron="" notablemente="" la="" hinchazón="" de="" las="" células="" hepáticas="" y="" previnieron="" eficazmente="" la="" necrosis="" de="" los="" hepatocitos="" y="" la="" infiltración="" de="" células="" inflamatorias.="" los="" resultados="" inmunohistoquímicos="" mostraron="" que="" las="" cphg="" redujeron="" significativamente="" la="" expresión="" de="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" y="" p="">< 0,01),="" col-i="" y="" col-iii.="" los="" efectos="" in="" vitro="" de="" las="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" y="" 25="" ug/ml)="" en="" hsc-t6="" mostraron="" que="" las="" cphg="" redujeron="" significativamente="" la="" expresión="" de="" arnm="" de="" nf-κb="" p65="" y="" col-i,="" y="" las="" cphg="" también="" redujeron="" la="" expresión="" de="" la="" proteína="" col-i.="" conclusiones:="" los="" cphg="" tienen="" un="" efecto="" antifibrosis="" hepático="" significativo="" y="" pueden="" usarse="" como="" agentes="" hepatoprotectores="" para="" el="" tratamiento="" de="" la="" fibrosis="">

Palabras clave: Fibrosis hepática, Cistanche tubulosa, Glicósido de feniletanol, Chemokine BSA, Prevención y terapia.

Fondo

La fibrosis hepática es una respuesta de cicatrización de heridas a una lesión hepática grave que se produce en la patogenia de la hepatitis crónica inducida por diversos factores. Estos factores son la infección viral, el abuso de alcohol, la colestasis y las enfermedades metabólicas y autoinmunes [1–3]. La acumulación progresiva de matriz extracelular (ECM) y la disminución de la remodelación alteran la arquitectura normal del hígado, lo que resulta en fibrosis hepática [4]. La fibrosis hepática es crítica en la enfermedad hepática crónica y, a menudo, se convierte en cirrosis irreversible y carcinogénesis. En la actualidad, no existen métodos ni fármacos eficaces para el tratamiento de la fibrosis hepática. Por lo tanto, es urgente encontrar un fármaco contra la fibrosis hepática que atenúe la progresión de la lesión hepática a fibrosis y cáncer.Cistanche tubulosaW (de la familia Orobanchaceae) es una planta parásita que se cultiva ampliamente en la región sur de Xinjiang en China [5]. Las personas generalmente lo usan para vigorizar los riñones, nutrir la sangre, relajar el intestino y retrasar la senescencia. Está oficialmente incluido en la Farmacopea China [6]. C. tubulosa contiene una variedad de componentes activos. Éstos incluyenFeniletanol glucósidos de cistanche(CPhG), iridoides y polisacáridos. Como uno de los muchos componentes activos enC. tubulosa, los CPhG han mostrado efectos antioxidantes, antifatiga, neuroprotectores y antiinflamatorios convincentes tanto en estudios in vivo como in vitro [7]. En los últimos años, se ha informado que CPhGs(Feniletanol glucósidos de cistanche) tienen efectos hepatoprotectores. Los posibles mecanismos subyacentes a estos efectos son la eliminación de radicales libres, la protección de las membranas hepáticas, la inmunorregulación, la inhibición de la apoptosis, la inhibición de la expresión de HBsAg y HBeAg, y la inhibición de la replicación del ADN del VHB y otros [8-11]. Sin embargo, pocos estudios en la literatura abordan el efecto anti-fibrosis hepática de los gráficos. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo investigar el efecto de fibrosis antihepática de los GPhC mediante el uso de un modelo de fibrosis hepática inducida por albúmina de suero bovino (BSA) en ratas. Se investigaron mecanismos moleculares relacionados en células HSC-T6.

Métodos

Sustancias químicas y reactivos

Se adquirió un kit de hidroxiprolina (hidrólisis alcalina) (Lote: 20140616) del Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (China). Se adquirieron kits de ELISA sándwich de TGF- 1 de rata (Lote: 238240615) de Lianke Biotech Co., Ltd. (China). El anticuerpo anti-colágeno I de conejo (lote: 140619), el anticuerpo anti-colágeno III de conejo (lote: 980788 W) y el anticuerpo anti-TGF- 1 de conejo (lote: 140619) fueron proporcionados por Beijing Biolysis Biotechnology Co., LTD (China). Incluye suero de oveja normal (fluido de trabajo) (Lote: WP141214), PV-6000 (Lote: WK141225) y kit DAB (Lote: K136621D) adquiridos de Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (China) . La detección de anticuerpos primarios se realizó utilizando 2. Solución de anticuerpos (Alk-Phos. Conjugated, Anti-rabbit) y 2. Solución de anticuerpos (Alk-Phos. Conjugated, Anti-mouse) (lote: 272387) adquiridos de Invitrogen Company (EE. UU. ). La albúmina de suero bovino (BSA) (Lote: SLBG8239V) se adquirió de Sigma (EE. UU.). Antes de su uso, se preparó BSA a 18 g/l en solución salina normal, se eliminaron las bacterias por filtración y se almacenó BSA a 4 grados. Se mezcló adyuvante incompleto de Freund que contenía 1 g de lípidos de pelo de oveja (Lote: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (China)) con 2 g de parafina líquida (Lote: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd. (China), esterilizado en un autoclave de vapor y almacenado a 4 grados. El fármaco positivo BJRG se obtuvo como tabletas Biejiarangan de Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (China). Las existencias de fármaco BJRG se prepararon disolviendo Comprimidos de BJRG en agua destilada a una concentración de 600 mg/kg.

Materiales vegetales

C. tubulosa(familia Orobanchaceae) se compró en la región Minfeng de Xinjiang de China. El material fue autenticado por el investigador Jun Zhao, Laboratorio Clave de Medicina Uigur, Instituto de Materia Médica de Xinjiang. Los especímenes de prueba se depositaron en el Instituto de Materia Médica de Xinjiang.

Preparación de CPhG(Feniletanol glucósidos de cistanche)

Rizomas secos y rebanados deC. tubulosa(6,0 kg) se extrajeron consecutivamente a reflujo tres veces con 70 por ciento de etanol, y el disolvente se eliminó para producir el extracto de etanol. Los extractos de etanol se purificaron usando resina AB-8 para obtener los glucósidos de feniletanol (CPhG). Las soluciones madre de CPhG utilizadas para diferentes grupos de dosis en estudios con animales (500 mg/kg, 250 mg/kg y 125 mg/kg, respectivamente) se disolvieron en carboximetilcelulosa al 0,5 por ciento (5 g/l) (sal de sodio).

Cuantificación de CPhG(Feniletanol glucósidos de cistanche)

Los contenidos de dos componentes (equinacósido y acteósido) en las CPhG se determinaron mediante HPLC utilizando un método informado previamente (Zhang et al. 2004) [12]. La HPLC se realizó utilizando un HPLC Shimadzu LC-10A equipado con un detector UV. La columna de HPLC era una columna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 µm). La fase móvil isocrática consistía en metanol-acetonitrilo -1 por ciento de ácido acético (15:10:75, v/v/v). La elución fue de 40 min y el caudal se mantuvo a 0,6 ml/min. La temperatura de la columna se mantuvo constante a 30 grados. La detección UV fue a 334 nm.

Animales y línea celular HSC-T6

[Grado SPF] Se compraron ratas Sprague-Dawley (SD) macho adultas sanas (180-220 g) del Centro Animal de la Universidad Médica de Xinjiang, número de licencia: SCXK (nuevo) 2011-0004. Las ratas fueron alimentadas con pienso libre de patógenos específicos (SPF). Todos los procedimientos relacionados con los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Xinjiang. Las ratas se alojaron en jaulas en condiciones ambientales controladas (25 grados y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h) y tuvieron libre acceso a alimento estándar para ratas en gránulos y agua del grifo. Las ratas se aclimataron antes del tratamiento. Se obtuvo una línea celular estrellada hepática de rata inmortalizada, HSC-T6, de Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, China). Las células HSC-T6 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (con alto contenido de glucosa) (DMEM, Beijing, China) suplementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (Gibco, América del Sur), 100 UI/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina (Beijing , China) en una incubadora humidificada a 37 grados con 5 por ciento de CO2.

Daño hepático inducido por BSA y tratamientos

Setenta y cinco ratas SD se dividieron aleatoriamente en seis grupos: normal (tratada con agua destilada), modelo (tratada con BSA), droga positiva (tratada con BSA más BJRG 600 mg/kg/día) y tratada con BSA más CPhG(Feniletanol glucósidos de cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/día) grupos. Los grupos tratados con BSA más CPhG (125, 250, 500 mg/ kg/día) tenían 13 ratas en cada grupo, y el otro grupo tenía 12 ratas en cada grupo. El modelo de lesión hepática inducida por BSA se divide en sensibilización primaria seguida de un ataque inmunológico) [13]. A excepción del grupo normal, a los demás grupos se les administraron inyecciones subcutáneas múltiples con 0,5 ml (9 mg/ml) de adyuvante incompleto de BSA Freund los días 1, 15, 22, 29 y 36 para la sensibilización primaria. Siete días después de la quinta inyección, se extrajo sangre a través del plexo venoso de la retina de rata y se analizó en busca de anticuerpos contra la albúmina sérica. El anticuerpo BSA en suero de rata se detectó mediante un método de doble difusión en agar. La inyección de ataque se realizó administrando 0,4 ml de BSA en solución salina normal a través de la vena caudal en ratas positivas para anticuerpos BSA dos veces por semana durante diez veces. Las concentraciones y tiempos de las inyecciones fueron 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 y 10.00 g/L en el día 46, día 50, día 53, día 57, día 60, día 64, día 67, día 71, día 74 y día 78, respectivamente. En el grupo normal, se usó solución salina normal para inyecciones inmunológicas primarias (sensibilización) y secundarias (ataque) en lugar de BSA, y otras condiciones fueron las mismas que las del grupo modelo. Al grupo normal se le administró agua destilada por vía oral a una dosis de 10 ml/kg/día. Al grupo modelo se le administró por vía oral 10 ml/kg/día de solución de CMC-Na al 0,5 por ciento. Al grupo de fármaco positivo se le administró por vía oral 600 mg/kg/día de BJRG. Los CPhG tratados con BSA más (125,

250 y 500 mg/kg/día) a los grupos se les administró por vía oral 125, 250 y 500 mg/kg/día de CPhG(Feniletanol glucósidos de cistanche), respectivamente. La dosificación diaria en ratas continuó durante dos semanas después de la última inyección. Después del período experimental, las ratas se mantuvieron en ayunas durante 12 h antes de 10 por ciento de hidrato de cloral y luego se sacrificaron inmediatamente. Se recogieron muestras de suero de cada rata y se usaron inmediatamente. Se recogieron hígados con dos fines: (1) conservación en nitrógeno líquido para kits Hyp y (2) fijación en formaldehído al 10 por ciento para exámenes histológicos e inmunohistoquímicos. La duración total de los estudios con animales fue de 93 días.

Índices de hígado y bazo

El hígado y el bazo fueron disecados por laparotomía y lavados con solución salina normal de 4 grados. Después de absorber el exceso de agua con papel de filtro, se pesaron el hígado y el bazo para calcular los índices correspondientes: Peso relativo del órgano=masa del órgano (g)/masa corporal individual (g) × 100 por ciento [14].

Experimentos celulares

Las células HSC-T6 se sembraron en una placa de 96-pocillos. Inicialmente, las células se cultivaron con DMEM que contenía 10 por ciento de FBS durante 48 h. Luego, el medio se reemplazó con DMEM sin FBS para privar a las células durante 12 h. A continuación, las células se cultivaron con DMEM que contenía 5,0 ng/ml de TGF- 1 (sin FBS) durante 24 h. Finalmente, diferentes concentraciones de CPhGs(Feniletanol glucósidos de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml y 25 ug/ml), acteósido (6 ug/ml, 3 ug/ml y 1,5 ug/ml) y equinacósido (500 ug/ml, 250 ug/ml y 125 ug/ml) se realizaron en placa en pocillos por cuadruplicado y se incubaron durante 48 h.

Análisis PCR en tiempo real

El nivel de expresión de ARNm de NF-κB, p65 y colágeno I se determinó mediante PCR en tiempo real. Para determinar las expresiones de ARNm en células HSC-T6, las células (4 × 105 células) se sembraron en placas de seis pocillos con 3 ml de DMEM con 10 por ciento de FBS y se incubaron durante la noche a 37 grados y 5 por ciento de CO2, después de lo cual los medios de cultivo celular se cambiaron a DMEM sin suero. A continuación, CPhG(Feniletanol glucósidos de cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml y 25 ug/ml), acteósido (6 ug/ml, 3 ug/ml y 1,5 ug/ml) y echinacósido (500 ug/ml , 250 ug/ml y 125 ug/ml) a los pocillos. Después de 48 h de incubación con CPhG o composiciones monoméricas, se extrajo el ARN total con el reactivo TRIzol (Invitrogen, EE. UU.) y se agitó vigorosamente con cloroformo durante 15 s. Después de permanecer a temperatura ambiente durante 3 minutos, el lisado se centrifugó a 12,000 × g durante 15 minutos a 4 grados. El ARN en la fase acuosa se precipitó con isopropanol y la fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga. El ARN se precipitó mediante la adición de etanol al 0,75 por ciento, después de lo cual se centrifugó el tubo de microcentrífuga a 12,000 × g a 4 grados durante no más de 5 min. Se eliminó el sobrenadante y se secó el ARN a temperatura ambiente durante 5-10 min. Conjuntos específicos de cebadores (Sangon, Shanghái, China) que se usaron para la amplificación de -actina de rata [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1] y NF Los genes -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] se diseñaron utilizando Batch Primer 3. Los cebadores directo (fw) e inverso (rv) fueron los siguientes: Colágeno I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actina (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Los resultados se normalizaron al ARNm del gen de limpieza -actina como control interno y se presentan como niveles relativos de ARNm. Las reacciones se realizaron con 8 μL de iQ SYBR Green Supermix, 1 μL de un par de cebadores 10 pM, 8,5 μL de agua destilada y 2,5 μL de ADNc. Cada reacción en cadena de la polimerasa se realizó en las siguientes condiciones: 95 grados durante 3 min, luego 40 ciclos de 10 s a 95 grados, 30 s a 55 grados y 10 s a 55 grados - 95 grados para la extensión, seguido de una sola medición de fluorescencia . Los resultados finales se describieron con los valores relativos (2-ΔΔCt). El cálculo y el análisis se realizaron con el sistema de detección de PCR en tiempo real iQ5.

Análisis de Western Blot

Los niveles de expresión de la proteína Collagen I (Abcam, Cambridge, Reino Unido, Art No: ab34710) se determinaron mediante transferencia Western [con -actina (Lote: 60008-1-lg; Proteintech, China) como control de mantenimiento. Los extractos de células enteras se prepararon utilizando un tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Thermo Scientific, EE. UU.) con cóctel inhibidor de proteasa Halt al 1 por ciento (Thermo Scientific, EE. UU.) y cócteles inhibidores de fosfatasa Halt al 1 por ciento (Thermo Scientific, EE. UU.). La concentración de proteína se midió y cuantificó por el método de Bradford [18]. La proteína (10–50 ug) se separó en un gel SDS-PAGE al 10 % y se transfirió a membranas de PVDF (Millipore, EE. UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con BSA al 5 por ciento, y los anticuerpos primarios (anticuerpo anti-Colla gen I, dilución 1:200 o mAb de actina de ratón, dilución 1:5000) se incubaron a 4 grados durante la noche. El correspondiente Alk-Phos. Los anticuerpos secundarios conjugados se incubaron a temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces con solución salina 1 × Tris-HCl con Tween 20 al 0,1 por ciento, y las señales se escanearon y visualizaron mediante el sistema de imágenes GEL DOC XR (Bio-Rad). El análisis densitométrico se realizó en las proteínas de interés y se normalizó a -actina mediante el software GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -actina se utilizó como control interno.

análisis estadístico

Se aplicó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk y la prueba de homogeneidad de varianza de Levene para verificar la normalidad y You et al. DARU Revista de Ciencias Farmacéuticas (2015) 23:52 Página 4 de 13homogeneidad de la varianza. Se usó el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey para identificar diferencias estadísticas en datos no homogéneos, normalmente distribuidos. Se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para analizar datos no distribuidos normalmente u homogéneos. Los resultados se expresaron como media ± SD. La significancia se fijó en P < 0.05.="" todos="" los="" datos="" fueron="" analizados="" por="" el="" software="" spss="" 16.0="" (universidad="" médica="" de="">

Resultados

Determinación cuantitativa de CPhG

Los CPhG en C. tubulosa contienen dos glucósidos de alcohol feniletílico, equinacósido y acteósido, y su contenido en los CPhG se determinó mediante análisis HPLC (Fig. 1) en 42,71 ± 0,42 por ciento y 14,27 ± {{7 }}.18 por ciento, respectivamente.

Índices de hígado y bazo

Como se muestra en la Tabla 1, los índices de hígado y bazo del grupo modelo se elevaron significativamente [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" los="" índices="" de="" hígado="" y="" bazo="" del="" fármaco="" positivo="" bjrg="" y="" cphg="" en="" diferentes="" grupos="" de="" dosis="" se="" redujeron="" significativamente="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" phígado="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectivamente].="" los="" índices="" de="" hígado="" y="" bazo="" fueron="" más="" bajos="" que="" los="" del="" grupo="">

Efectos de las CPhG en las actividades de ALT, AST y marcadores de fibrosis hepática

En el presente estudio, los niveles séricos de las enzimas hepáticas AST y ALT aumentaron significativamente en el grupo modelo, lo que refleja el daño hepatocelular en ratas con fibrosis hepática inducida por BSA. Sin embargo, los experimentos.

mostró que el tratamiento con BJRG (600 mg/kg) y CPhG (125, 250 y 5{{10}}0 mg/kg) redujo significativamente la AST [PASADO < 0.0{{60}}1,="" pasado="">< 0.001,="" pasado="">< 0.001,="" pasado="">< 0.001="" ,="" respectivamente]="" y="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," respectivamente]="" niveles="" en="" ratas="" con="" fibrosis="" hepática="" .="" (tabla="" 2).="" los="" niveles="" de="" ha,="" ln,="" pc="" y="" iv-c="" en="" ratas="" modelo="" aumentaron="" significativamente="" [pha="">< 0.001,="" pln="">< 0.001,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0.001,="" respectivamente].="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo,="" los="" niveles="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," respectivamente],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectivamente],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivamente],="" y="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectivamente]="" en="" ratas="" se="" redujeron="" notablemente="" con="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" y="" cphg="" en="" diferentes="" grupos="" de="" dosis="" (125,="" 250="" y="" 500="" mg/kg)="" (tabla="" 3).="" el="" contenido="" de="" hyp="" y="" el="" contenido="" de="" colágeno="" tgf-="" 1="" también="" se="" detectó="" midiendo="" los="" niveles="" de="" hyp="" en="" tejido="" hepático.="" como="" se="" muestra="" en="" la="" tabla="" 4,="" la="" media="">el nivel en el grupo modelo fue significativamente más alto que el grupo normal, pero disminuyó notablemente en el grupo BJRG y en los diferentes grupos de dosis de CPhG. La concentración hepática de TGF{{0}} del grupo modelo en ratas aumentó significativamente [P < 0.001].="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo,="" los="" niveles="" de="" tgf-="" 1="" del="" fármaco="" positivo="" y="" los="" diferentes="" grupos="" de="" dosis="" de="" cphgs="" se="" redujeron="" notablemente="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respectivamente].="" los="" resultados="" se="" resumen="" en="" la="" tabla="">

Examen histopatológico

Las observaciones de secciones de tejido hepático normal teñidas con H&E y tricrómico de Masson muestran lóbulos hepáticos y sinusoides hepáticos distintos. La estructura del tejido hepático en las ratas modelo estaba desordenada, y el tejido hepático y los sinusoides hepáticos fueron reemplazados por una gran cantidad de tejido conectivo. Sin embargo, se detectó una citoarquitectura más normal y menos tejido conectivo en el grupo de tratamiento que en el grupo modelo.

tinción H&E

En el grupo normal, se observó integridad estructural del lóbulo hepático sin áreas portales anormales ni sinusoides hepáticos. Los cordones hepáticos estaban dispuestos de forma ordenada, con el núcleo redondo y claro. Los núcleos están situados en el centro de la célula, con abundante citoplasma. Solo el área del portal tiene una pequeña cantidad de tejido fibroso (Fig. 2a). En el grupo modelo, la estructura lobulillar estaba severamente dañada. Las células hepáticas mostraron una degeneración acuosa leve, en su mayoría degeneración globular y/o degeneración grasa. También se observó la formación de infiltración de células inflamatorias, hiperplasia extensa de tejido fibroso, la formación de un gran número de tabiques fibrosos, lóbulos divididos y proliferación significativa de células hepáticas. Estas observaciones confirmaron el éxito del establecimiento del modelo animal de fibrosis hepática con lesión inmune en ratas (Fig. 2b). En comparación con el grupo modelo, hubo una reducción en la infiltración de células inflamatorias en los diferentes CPhG. También se observaron menos necrosis y degeneración grasa de las células hepáticas, así como un alivio de la fibrosis. Los CPhG mitigaron significativamente la patología de la fibrosis hepática inducida por BSA en ratas, aliviaron la hinchazón de las células hepáticas y previnieron de manera efectiva la necrosis de hepatocitos y la infiltración de células inflamatorias, lo que sugiere que los CPhG ejercen un efecto protector sobre la fibrosis hepática en ratas inducida por BSA. (Fig. 2c–f). Tinción tricrómica de Masson En el grupo normal, el tejido hepático era normal. El área del portal hepático mostró una pequeña cantidad de fibras de colágeno azules y el tejido hepático estaba estructurado normalmente (Fig. 3a). En comparación con el tejido hepático del grupo normal, el tejido fibroso proliferó en la valva central y se expandió hacia el parénquima hepático. Fibras de colágeno extendidas y unidas y

envolvía todo el lóbulo y rodeaba la vena central. Estos efectos, junto con la fibrosis de hepatocitos, el daño estructural lobulillar, la fibrosis periportal y la formación de pseudolóbulos (Fig. 3b) proporcionaron evidencia de que se estableció el modelo. En comparación con el grupo modelo, las fibras de colágeno en el grupo de control positivo del fármaco se extendieron levemente hacia afuera desde el área del portal periférico (Fig. 3c). En comparación con el grupo modelo, las fibras de colágeno en los diferentes grupos de dosis de CPhG se redujeron significativamente, se inhibió la proliferación de fibras y se redujo significativamente la proliferación de tejido fibroso dentro del parénquima hepático. Estos resultados sugirieron que las CPhG protegían a las ratas de la fibrosis hepática inducida por BSA (Fig. 3d-f).

Tinción inmunohistoquímica

Es importante destacar que la expresión de colágeno tipo I y colágeno tipo III juega un papel esencial en el desarrollo de la fibrosis hepática, y su generación y depósito en el tejido hepático podría servir como un determinante importante de la eficacia contra la fibrosis hepática. Los resultados se resumen en la Tabla 5

Colágeno tipo I

El grupo normal expresó colágeno tipo I principalmente en los vasos sanguíneos y el área porta. El grupo modelo expresó altamente fibrosis vascular de colágeno tipo I en áreas portales. En el espacio de Disse, la tinción de colágeno tipo I se observó en forma de rayas o como una distribución parcheada. Tabiques fibrosos revestidos de colágeno para formar un pseudolóbulo. En estos experimentos, se formaron menos tabiques fibrosos para BJRJ (600 mg/kg) y diferentes grupos de dosis de CPhGs (125, 250 y 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023 y P Col I=0.044, respectivamente]. Los resultados semicuantitativos revelaron que la expresión de su colágeno tipo I fue significativamente menor en comparación con el grupo modelo (Fig. 4).

Colágeno tipo III

El colágeno tipo III se expresaba débilmente en el grupo normal, y las áreas periféricas que rodeaban las venas porta y hepática mostraban una pequeña cantidad de fibras amarillas finas en lugar de fibras continuas (Fig. 5a). En el grupo modelo, las fibras de colágeno exhibieron cordones anchos y gruesos, lo que indica una fuerte expresión, principalmente ubicados en las áreas portal y de tejido fibroso (Fig. 5b). Las fibras de colágeno de BJRJ (600 mg/kg) y diferentes grupos de dosis de CPhG (125, 250 y 500 mg/kg) eran filamentosas y se distribuían alrededor de las áreas de la vena central y del portal. En comparación con el grupo modelo, las fibras de colágeno se redujeron significativamente, la tinción era pálida y delgada y la tinción inmunohistoquímica fue débilmente positiva (Fig. 5c-f). Estos resultados semicuantitativos muestran que las células expresadas positivamente en los grupos de dosis positivas y diferentes [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 y P Col III=0.037, respectivamente] fueron diferentes de los del grupo modelo.

TGF- 1

Hubo poca expresión de TGIF{{0}} en células de hígado de rata normales. La expresión se limitó a un pequeño número de células intersticiales (Fig. 6a). En el grupo modelo, la expresión de TGF- 1 estaba ampliamente distribuida en el área portal, los espacios fibrosos, las células estrelladas hepáticas, las células inflamatorias, la pared sinusoidal y el citoplasma. Un área del portal en particular exhibió una expresión fuertemente positiva con tinción de color amarillo parduzco (Fig. 6b). Hubo una pequeña cantidad de expresión en el área portal y tabiques fibrosos de BJRJ (600 mg/kg) y diferentes grupos de dosis de CPhG (125, 250 y 500 mg/kg). La extensión de la tinción positiva en estos grupos se redujo significativamente en comparación con la del grupo modelo. Se redujo la tinción de las células intersticiales en los tabiques fibrosos y el citoplasma de las células inflamatorias (Fig. 6c-f). Los resultados semicuantitativos revelaron que BJRJ y diferentes grupos de dosis de CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0.001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" .004,="" respectivamente]="" fueron="" significativas="" en="" comparación="" con="" el="" grupo="" modelo.="" como="" se="" mencionó="" anteriormente="" en="" el="" artículo,="" tgf-="" 1="" es="" una="" citocina="" importante="" en="" la="" fisiopatología="" de="">

fibrosis, estimulando la producción de matriz extracelular [19]. Mostramos que el nivel de TGF- 1 aumentó en el grupo modelo de manera consistente con la gravedad de la fibrosis hepática. Los niveles de expresión de TGF- 1 en el hígado fueron consistentes con los niveles de TGF- 1 en suero. Esto indica que las CPhG pueden reducir significativamente la fibrosis hepática debido a la expresión de TGF- 1 al participar en la síntesis y degradación de la MEC. La expresión de colágeno tipo I, colágeno tipo III y TGF- 1 puede detectar el proceso patológico de fibrosis hepática. Sus niveles de expresión en los grupos de tratamiento se redujeron significativamente e ilustraron que las CPhG pueden mejorar la actividad de la colagenasa, manteniendo el equilibrio dinámico de la síntesis y degradación de la MEC hepática, retrasando y previniendo así la formación de fibrosis hepática.