PARTE 1 Revelando el impacto del medio ambiente en la salsa Cistanche: de la regionalización ecológica global a las características de la comunidad microbiana del suelo

RESUMEN:Comprender la relación regulatoria entre el medio ambiente y laSalsa Cistanche, aquí integramos los métodos de macro y micro dimensiones. Desde una perspectiva macro, el modelo MaxEnt indicó que los países a lo largo de la Iniciativa de la Franja y la Ruta, como China, Egipto y Libia, eran particularmente adecuados para el crecimiento deC salsadesde la antigüedad (Último Máximo Glacial y Holoceno medio) hasta el futuro (2050 y 2070). La prueba de Jackknife reveló que la precipitación es un factor ecológico importante que afecta la distribución de C. salsa. Desde una perspectiva macro, los datos de secuenciación de amplicón de 16S rRNA mostraron que las comunidades microbianas del suelo de tres ecotipos (desierto-estepa, pastizal y grava-desierto) eran significativamente diferentes (p <0.001). el="" análisis="" del="" microbioma="" central="" demostró="" que="" los="" géneros="" bacterianos="" arthrobacter,="" sphingomonas="" y="" bacillus="" eran="" taxones="" centrales="" enriquecidos="">C salsa. LEfSe y random forest se usaron para excavar Gillisia (estepa del desierto), Flavisolibacter (pastizales) y Variibacter(desierto de grava) como biomarcadores que pueden distinguir entre las comunidades microbianas de los tres ecotipos. El perfil de predicción mostró que la función metabólica de la comunidad microbiana se enriqueció en las rutas metabólicas y el procesamiento de información ambiental. Los análisis de correlación revelaron que la altitud, la precipitación del trimestre más cálido (bio18), el rango diurno medio (bio2) y la temperatura media del trimestre más cálido (bio10) eran factores ecológicos importantes que afectan la composición de las comunidades microbianas del suelo. Este trabajo proporcionó nuevos conocimientos sobre la relación regulatoria entre la distribución adecuada deC salsa, comunidades microbianas del suelo e impulsores ecológicos. Además, profundizó la comprensión de la interacción entre las plantas del desierto y los factores ecológicos en ambientes áridos.

PALABRAS CLAVE:Salsa Cistanche, MaxEnt, secuenciación de amplicón 16S rRNA, comunidad microbiana del suelo, impacto ambiental.

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Para obtener más información, póngase en contacto:Joanna.jia@wecistanche.com

1. INTRODUCCIÓN

El valor económico de las plantas medicinales ha aumentado rápidamente en los últimos años con el desarrollo y la utilización mundial de plantas naturales. El tallo carnoso deSalsa Cistanchees un órgano vegetal comestible y medicinal que se utiliza comúnmente como tónico renal, afrodisíaco, tratamiento antienvejecimiento y antioxidante, laxante intestinal, tratamiento protector del hígado y tratamiento antirradiación. Los estudios fitoquímicos modernos sobre C. salsa han dado como resultado la identificación y el aislamiento de cantidades considerables de compuestos bioactivos, como varios glucósidos feniletanoides, iridoides, alditoles y lignina, que tienen importantes valores medicinales y comestibles.1 Con el rápido desarrollo del mercado de medicamentos y alimentos saludables, la demanda deC salsaha aumentado considerablemente y va acompañada de la sobreexplotación y el saqueo de los recursos silvestres. Por lo tanto, la introducción y el cultivo artificial a gran escala deC salsase han convertido en una medida importante para proteger los recursos silvestres y frenar la desertificación ecológica. Sin embargo, la investigación sobre el cultivo artificial deC salsasigue siendo limitado.

El ambiente tiene un impacto masivo en el crecimiento y desarrollo de C. salsa.2 Las plantas crecen en diferentes ambientes, formando diferentes ecotipos que exhiben cambios significativos en los ingredientes inactivos y la expresión génica.3,4 A nivel macro, la investigación ha encontrado que la temperatura, la luz, la precipitación y los tipos de suelo tienen un efecto sobre el crecimiento de las plantas y sus ingredientes activos.5,6 El estudio de la interacción entre el medio ambiente y las plantas y la caracterización integral de diferentes ecotipos de plantas son beneficiosos para la selección y el cultivo de plantas de alta calidad. -variedades de calidad.7 Desde una perspectiva macro, las plantas pueden tener un impacto considerable en los organismos del suelo incluso si tienen poco o ningún contacto directo con el sistema del suelo a través de sus raíces.8,9 Sin embargo, la investigación actual sobre la relación entre las plantas y el ambiente, incluidos los factores climáticos y la comunidad microbiana del suelo, aún no está claro.

El modelo de distribución de especies (SDM, por sus siglas en inglés) es un modelo estadístico que se estableció utilizando datos de distribución de especies existentes y variables ambientales para inferir las necesidades ecológicas de las especies y proyectar sus áreas de distribución potencial,10,11 explorar áreas de crecimiento adecuadas combinando factores climáticos y de suelo, determinar el entorno adecuado para las plantas medicinales y proteger y cultivar científicamente plantas en peligro de extinción.12,13 Los SDM, como MaxEnt y biomod2, han respondido con éxito a las predicciones de las tendencias de distribución impuestas a las plantas ecológicas y en peligro de extinción durante el cambio climático.14,15

Se ha llevado a cabo la secuenciación de amplicón de ARNr 16S de muestras de suelo de la rizosfera vegetal para explorar la diversidad de comunidades microbianas, proporcionando nuevos conocimientos sobre la relación entre las plantas y las comunidades microbianas del suelo.16,17

En este estudio, exploramos la relación entre el medio ambiente yC salsade las dimensiones macro y micro. Realizamos lo siguiente. (1) Utilizamos el modelo MaxEnt para predecir las áreas de crecimiento global adecuadas deC salsadesde la antigüedad hasta el futuro (cinco periodos: Último Máximo Glacial [LGM], Holoceno medio [MH], presente, 2050 y 2070) y calculó las áreas adecuadas de diferentes niveles y la tasa de contribución y rango de variables bioclimáticas que afectan el distribución deC salsa.(2) En combinación con el trabajo de campo, recolectamos muestras de suelo de tres ecotipos (desierto-estepa, pradera y grava-desierto) de la mejor zona de cultivo (Tacheng y Xinjiang) de

C salsa. Realizamos la secuenciación de amplicón 16S rRNA para explorar las características de las comunidades microbianas del suelo. También comparamos las diferencias en los microbiomas del suelo en los tres ecotipos y determinamos los microbiomas centrales y los biomarcadores que podrían distinguir entre los tres ecotipos. (3) Realizamos análisis de correlación y análisis redundantes sobre la base de la abundancia de microbiomas, biomarcadores y variables bioclimáticas centrales para explorar la relación regulatoria entreC salsay el medio ambiente

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2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Modelado de Nichos Ecológicos.

En esta investigación, se utilizaron cinco recursos para buscar los sitios actuales deC salsaen todo el mundo: (1) GBIF; (3) Infraestructura Nacional de Información de Especímenes (4) literatura publicada; y (5) trabajo de campo. Los datos de muestra sin latitud y longitud se basaron en una consulta de latitud y longitud de un mapa en línea. El método de análisis de búfer se usó para corregir y filtrar los puntos de distribución obtenidos para eliminar el efecto de la simulación de sobreajuste causada por una gran correlación espacial. La resolución espacial de las variables bioclimáticas fue de 2,5 arc-min (alrededor de 4,5 km2), y la distancia de amortiguamiento se fijó en 3 km. Solo se retuvo un punto de distribución cuando la distancia entre los puntos de distribución era inferior a 3 km. Después de eliminar los puntos duplicados, se recopilaron y usaron para el análisis 76 ocurrencias, todas del área de producción genuina de C. salsa (Figura 1a, Archivo complementario 1).

Utilizamos las 19 variables bioclimáticas de WorldClim como predictores ambientales. Los datos de las variables bioclimáticas presentes de este estudio se recolectaron de los datos de monitoreo de la base de datos WorldClim versión 1.418 durante 1960−1990 con una resolución de 2.5 arc-min. Las variables bioclimáticas antiguas (LGM y MH) y futuras (futuro 2050 y futuro 2070) disponibles en la versión 1.4 de WorldClim a una resolución de 2,5 arc-min se emplearon como predictores de los modelos de distribución de especies. Para evitar la multicolinealidad, realizamos un análisis de correlación en puntos de fondo y eliminamos una de las variables en cada par con un Pearson

valor de correlación > 0.819 (Figura S1). Las ocho variables bioclimáticas finalmente incluidas en los modelos fueron la amplitud diurna media (bio2), la temperatura media del trimestre más húmedo (bio8), la temperatura media del trimestre más seco (bio9), la temperatura media del trimestre más cálido (bio10) , la precipitación anual (bio12), la precipitación del trimestre más seco (bio17), la precipitación del trimestre más cálido (bio18) y la precipitación del trimestre más frío (bio19).

Utilizamos el modelo de entropía máxima del paquete de software de código abierto (MaxEnt v.3.4.0),20 que se puede descargar para construir un modelo de distribución de especies paraC salsa. Se usaron los siguientes parámetros en la configuración básica: semilla aleatoria y un porcentaje de prueba aleatorio de 25 y 10 repeticiones. Al establecer el porcentaje de prueba aleatoria en 25 por ciento, seleccionamos aleatoriamente el 75 por ciento de los puntos de distribución para el conjunto de entrenamiento. Al establecer el número de réplicas en 10, ejecutamos el modelo 10 veces con la misma configuración y promediamos el resultado de todas las ejecuciones para obtener el resultado final. El área bajo la curva del operador de recepción (AUC) se utilizó para evaluar la bondad de ajuste del modelo, y el modelo con el valor de AUC más alto se consideró como el de mejor desempeño. Se utilizó el procedimiento jackknife para evaluar la importancia de las variables. Se utilizaron curvas de respuesta para obtener el rango de variables bioclimáticas.

Se utilizó ArcGIS para analizar las variables bioclimáticas que afectan la distribución de C. salsa y para clasificar y calcular el área apta para la producción.

2.2. Recolección y Descripción de Muestras de Suelo. C salsa

se distribuye naturalmente en los tres ecotipos de desierto de grava, pastizal y estepa desértica. En abril de 2017, recolectamos muestras de suelo y tallos carnosos que representan los principales ecotipos de C. salsa en Tacheng, Xinjiang, China (Figura 1b, Tabla 1). Se recolectaron muestras del desierto de grava de Hejiaoke, condado de Toli (HJ1, HJ2 y HJ3). Se recolectaron muestras de pastizales del condado de Yumin (YM1, YM2, YM3 y YM4). Se recolectaron muestras de estepa desértica de Jiang Alhan (JA1, JA2, JA3, JA4, JA5 y JA6). Las muestras de suelo que recolectamos son todas del suelo en la superficie de C. salsa y su sitio parásito huésped. especímenes de comprobante con

los números de comprobante de 20170510079-DT a 20170510091-DT se depositaron en el herbario del Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales de la Academia China de Ciencias Médicas en Beijing, China. Después de limpiarlos, los tejidos de tallos suculentos se cortaron en trozos pequeños, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y luego se almacenaron a -80 grados hasta su posterior procesamiento. Los núcleos de suelo se tomaron a una profundidad de 20 cm utilizando

un taladro cilíndrico de acero inoxidable con un diámetro de 5 cm y luego almacenado a -20 grados en un refrigerador portátil. Después de ser transportadas al laboratorio, las muestras de suelo se pasaron a través de un tamiz de 2 mm para eliminar tejidos vegetales, raíces, rocas y otros desechos y luego se almacenaron a -20 grados en un refrigerador antes de realizar más experimentos.

2.3. Extracción de ADN y Secuenciación de ARNr 16S.

El ADN del suelo se extrajo utilizando un kit de aislamiento de ADN PowerSoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) de acuerdo con el manual. La pureza y la calidad del ADN genómico se comprobaron en geles de agarosa 0,8 por ciento. La región hipervariable V3-4 del gen bacteriano 16S rRNA se amplificó con los cebadores 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) y 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT).21 Para cada muestra de suelo, se agregó una secuencia de código de barras de 10- dígitos a la secuencia de 5 ′ final de los cebadores directo e inverso (Allwegene Co., Beijing). La PCR se realizó en un Mastercycler Gradient (Eppendorf, Alemania) utilizando volúmenes de reacción de 25 μL que contenían 12,5 μL de KAPA 2G Robust HotStart ReadyMix, 1 μL de cebador de reenvío (5 μM), 1 μL de cebador inverso (5 μM), 5 μL de ADN (la cantidad total de plantilla es de 30 ng) y 5,5 μL de H2O. Los parámetros de ciclado fueron los siguientes: 95 grados por 5 min, seguidos de 28 ciclos de 95 grados por 45 s, 55 grados por 50 s y 72 grados por 45 s, con una extensión final a 72 grados por 10 min. Se agruparon tres productos de PCR por muestra para mitigar los sesgos de PCR a nivel de reacción. Los productos de PCR se purificaron usando un kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN, Alemania) y luego se cuantificaron usando PCR en tiempo real. La secuenciación profunda se realizó en una plataforma MiSeq de Allwegene Co. (Beijing). Después de la ejecución, el análisis de imágenes, la llamada de bases y la estimación de errores se realizaron con Illumina Analysis Pipeline, versión 2.6.

2.4. Análisis de datos de secuenciación de amplicón de ARNr 16S.

Todos los datos de secuenciación se enviaron al NCBI Short Archive (SRA) bajo el envío SRA SUB7456002. Primero se seleccionaron los datos sin procesar y se eliminaron las secuencias sobre la base de las siguientes consideraciones: secuencias de menos de 200 pb con puntaje de baja calidad (menor o igual a 20) y que contenían bases ambiguas o que no coincidían con las secuencias de los cebadores y las etiquetas de código de barras. Las lecturas cualificadas se separaron mediante secuencias de códigos de barras específicas de la muestra y se recortaron con Illumina Analysis Pipeline, versión 2.6. Luego, los conjuntos de datos se analizaron utilizando QIIME. Las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con un nivel de similitud del 97 por ciento 22 para generar curvas de rarefacción y calcular índices de riqueza y diversidad. Se utilizó la herramienta Ribosomal Database Project Classifier para clasificar todas las secuencias en diferentes grupos taxonómicos, en los que el umbral de confianza se establece en 0,7.23 Los análisis de agrupamiento se realizaron sobre la base de la información de OTU de cada muestra utilizando R 3.6.1 para examinar la similitud entre diferentes muestras.24 La matriz de distancias UniFrac entre las comunidades microbianas de cada muestra se calculó utilizando el coeficiente de Tayc y se representó como un método de grupo de pares no ponderado con un árbol de agrupación de media aritmética, que describe la disimilitud (1- similitud) entre muestras múltiples.25 También se generó un archivo de árbol en formato Newick a través de este análisis. Se aplicó la diversidad alfa para analizar la complejidad de la diversidad de especies para una muestra utilizando cuatro índices, a saber, Chao1, especies observadas y Shannon y Fisher.

índices de diversidad. Estos índices se calcularon utilizando el software QIIME (Boulder, CO, EE. UU.) en Python (v.1.8.0) (La Jolla, CA, EE. UU.).26 Se utilizó el análisis de diversidad beta para evaluar las diferencias en las muestras en términos de complejidad de las especies. La diversidad beta se calculó usando el análisis de coordenadas principales (PCoA) y el análisis de conglomerados en QIIME.27 El análisis de varianza molecular (AMOVA) se realizó usando madre.28 La prueba de Kruskal-Wallis se usó para calcular la diferencia de OTU entre grupos (valor p<0.05), and="" heat="" maps="" were="" drawn="" using="" pheatmap="" (r="" package).="" core="" microbiome="" analysis="" was="" adopted="" from="" the="" core="" function="" in="" the="" r="" package="" microbiome="" (sample="" prevalence="20%," relative="" abundance="0.01%)" by="" microbiomeanalyst29="" (https://www.="">

Se utilizaron métodos de análisis discriminante lineal (LDA) y bosque aleatorio (RF) en el sitio web MicrobiomeAnalyst para determinar los biomarcadores del microbioma. Primero se realizó una prueba de rango de suma de Kruskal-Wallis factorial no paramétrica para identificar características con abundancia diferencial significativa considerando el factor experimental o la clase de interés. A continuación, se realizó LDA (el umbral se establece en 2) para calcular el tamaño del efecto de cada característica diferencialmente abundante. Las características se consideraron significativas sobre la base de su valor p ajustado. El valor de corte ajustado predeterminado fue 0.05. El análisis de RF se realizó utilizando el paquete randomForest5. Este método utiliza un conjunto de árboles de clasificación, cada uno de los cuales crece a través de una selección aleatoria de características de una muestra de arranque en cada rama.

Tax4Fun (paquete R, http://tax4fun.gobics.de/) se utilizó para predecir los perfiles funcionales microbianos de los microbiomas en las muestras de suelo. La tabla OTU Biom del microbioma del suelo se utilizó como archivo de entrada para la imputación del metagenoma de las muestras de suelo de C. salsa. Luego, las abundancias de clases de genes pronosticadas se analizaron en el nivel 3 del grupo KEGG Orthology (KO). Los resultados de Tax4Fun se analizaron en Doby (paquete R).

2.5.Análisis de correlación de comunidades microbianas clave y factores bioclimáticos.

Utilizamos ArcGIS para extraer numéricamente los factores bioclimáticos clave de los 13 puntos de muestreo del suelo. El análisis de redundancia de géneros clave de las comunidades microbianas (cinco biomarcadores, cinco microbiomas centrales) y factores bioclimáticos se realizó utilizando

Software Canoco 5. La conversión de datos Log2 se realizó uniformemente antes del análisis. Se calcularon los coeficientes de correlación de Spearman para la abundancia de cinco biomarcadores, cinco microbiomas centrales y la integración de datos de factores bioclimáticos mediante la aplicación de SPSS. Los resultados del análisis de correlación se extrajeron mediante pheatmap (paquete R).

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3. RESULTADOS

Predicción del Cambio de Distribución Global de C. salsa en los Diferentes Periodos. El ROC calculado mostró

que el valor AUC fue {{0}}.977 (Figura S2), lo que indica que el modelo coincidía bien con los datos.30 Resultados de la simulación de idoneidad del hábitat para cinco períodos (LGM, MH, presente, 2050 y 2070 ) se ilustraron en la Figura 2 y la Tabla 2. La idoneidad de C. para el cultivo de salsa se dividió en cinco categorías sobre la base de umbrales estadísticos: inadecuado (clase 5: 0-20 por ciento), marginal (clase 4: 20-50 por ciento), regular (clase 3: 50−75 por ciento), bueno (clase 2: 75−

90 por ciento) y excelente (clase 1: 90−100 por ciento). Este artículo solo discutió las áreas de distribución adecuadas para las clases 1, 2 y 3. Las distribuciones potenciales actuales de C. salsa indicaron que esta especie estaba ampliamente distribuida en tres zonas climáticas: clima desértico templado, clima mediterráneo subtropical y desierto tropical. regiones climáticas. Todos los continentes, excepto la Antártida, contienen regiones que eran aptas para C. salsa. Estas regiones estaban distribuidas principalmente en el centro y oeste de Asia y el norte de África y estaban dispersas en el centro y oeste de América del Norte, el centro de América del Sur y el oeste de Oceanía. Las áreas adecuadas excelentes (clase 1) fueron las más ampliamente distribuidas en Egipto (76 750 km2), mientras que las áreas adecuadas buenas (clase 2) y regular (clase 3) fueron las más distribuidas en China (clase 2: {{ 13}} km2 y clase 3: 1 024 600 km2). Las áreas ecológicamente adecuadas en Asia se restringieron principalmente a China (clase 1: 45 775 km2), Jordania (clase 1: 16 075 km2), Israel (clase 1: 14 975 km2), Arabia Arabia (clase 1: 14 925 km2) e Irán (clase 1: 12 600 km2). Las áreas adecuadas de C. salsa en África se distribuyeron principalmente en Egipto, Libia (clase 1: 34 400 km2) y Túnez (clase 1: 275 km2). Las áreas aptas para C. salsa en América del Sur se distribuyeron principalmente en Chile (clase 1: 16 550 km2).

Desde una perspectiva espacial (Figura 2), la tendencia de cambio regional adecuada para los cinco períodos primero aumentó y luego disminuyó con el área más grande en 2050 (Figura 3a, Figura S3). Vimos una gran disminución en el área adecuada de C. salsa dentro del LGM en relación con los otros cuatro períodos. En comparación con el presente (4 358 775 km2), las áreas aptas disminuyeron en un 50 por ciento (2 160 975 km2) en el período LGM, en un 10 por ciento (MH: 3 910 350 km2) en el período MH, y en un 1 por ciento (4 328 800 km2) en el período 2070 y aumentó en un 2 por ciento (4 428 950 km2) en el período 2050. En particular, desde el presente hasta el futuro (de 1960 a 2080), el área excelente (clase 1) para C. salsa se fue reduciendo gradualmente (presente, 243 200 km2; 2050, 232 425 km2; 2070, { {29}} km2).

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3.2. Predicción de las Áreas de Distribución Adecuada de C. salsa en China y el Rango de Variables Bioclimáticas.

Las áreas adecuadas para el crecimiento de C. salsa en China se restringieron principalmente al noroeste de Xinjiang, el centro de Mongolia Interior, el norte de Shaanxi, el norte de Shanxi, el noreste de Qinghai, el norte de Gansu y la mayor parte de Ningxia (Figura 2b). Las áreas más adecuadas en China se distribuyeron principalmente en Xinjiang, de las cuales el área excelente (clase 1) cubría 23 650 km2, el área buena (clase

2) cubría 220 950 km2, y el área de feria (clase 3) cubría 189 975 km2. Entre las buenas áreas (clase 2), Xinjiang representó el 60,99 %, seguida de Mongolia Interior (86 300 km2) y Gansu (24 450 km2) con el 23,82 % y el 6,75 %, respectivamente (Figura 3b). Los resultados del modelo MaxEnt indicaron que Xinjiang era particularmente adecuado para el crecimiento de C. salsa. Sin embargo, diferentes hábitats, como desierto de grava, pastizales y estepa desértica, se encontraron en la misma área durante los viajes de campo. Por lo tanto, estábamos muy interesados ​​en las características de las comunidades microbianas del suelo y su relación con el medio ambiente en diferentes ecotipos de C. salsa en Tacheng, Xinjiang, China.

La importancia de cada variable bioclimática para la distribución de C. salsa se muestra en la Tabla 2. Todos los valores fueron medias de 10 corridas repetidas. Las tres principales variables bioclimáticas con mayor influencia en la distribución de C. salsa fueron la precipitación del trimestre más seco (bio17), la precipitación del trimestre más cálido (bio18) y la amplitud diurna media (bio2) con tasas de contribución relativas de 25,81 por ciento, 17,65 por ciento y 13,70 por ciento, respectivamente. Como lo indica la curva de respuesta obtenida por el modelo MaxEnt, el rango del biofactor podría calcularse cuando la probabilidad de predicción supere 0,5. Por ejemplo, el rango de bio17 fue de -135,30 a 11,34 mm, el de bio 18 fue de -206,60 a 4,40 mm y el de bio2 fue de 11,65 a 12,50 grados.

3.3. Microbiomas del suelo de tres ecotipos de C. salsa que exhiben comunidades microbianas distintas y superpuestas.

La secuenciación del ARNr 16S dio como resultado 518 217 lecturas sin procesar, entre las cuales se examinaron 441 576 en cuanto a calidad y longitud. El conjunto de datos contenía 11 818−26 431 (media: 20 150) secuencias por muestra. Las lecturas de alta calidad se agruparon sobre la base de

>97 por ciento de identidad de secuencia en 2 788 OTU microbianas (Tabla 1).

La comunidad microbiana se clasificó en 34 filos y 321 géneros. A nivel de filo (Figura 4a), Actinobacteria (DS, 31.94 por ciento; GD; 46.42 por ciento; GL, 33.33 por ciento), Proteobacteria (DS,

23,25 por ciento; GD, 22,53 por ciento; GL, 24,68 por ciento) y Gemmatimonadetes (DS, 17,77 por ciento; GD, 8,02 por ciento; GL, 8,36 por ciento) fueron dominantes en los tres ecotipos. A nivel de género (Figura 4b), la estepa del desierto estuvo dominada por Euzebya (4,82 por ciento) y Arthrobacter (1,74 por ciento), mientras que los géneros más dominantes en la grava del desierto fueron Arthrobacter (8,35 por ciento) y Bacillus (4,95 por ciento). ). Bacillus (6,89 por ciento) y Arthrobacter (5,57 por ciento) fueron dominantes en los pastizales. Las 10 principales comunidades microbianas abundantes en la estepa del desierto se clasificaron en ocho filos (Figura 4c), las del desierto de grava se clasificaron en siete filos (Figura 4d) y las de los pastizales se clasificaron en 10 filos (Figura 4e). ).

Las mediciones de la diversidad dentro de la muestra (-diversity) revelaron un cambio de diversidad de pastizales a desiertos de grava y estepas desérticas (Figura 4f). La diversidad de las comunidades microbianas del suelo en cada muestra se evaluó en los índices de diversidad de especies observadas, Shannon, Chao 1 y Fisher. Los índices de Shannon, Chao 1, especies observadas y Fisher sugirieron que la -diversidad de las comunidades del suelo de los pastizales

fue superior a la de las otras dos comunidades de ecotipos. Los resultados de las curvas de rarefacción (Figura S5) fueron similares a los resultados anteriores, excepto para YM1 y HJ3. Los resultados de AMOVA (Tabla S3) mostraron que existen diferencias significativas (p < 0.01)="" entre="" los="" tres="" ecotipos.="" los="" resultados="" de="" los="" pcoa="" sin="" restricciones="" de="" gráficos="" 2d="" de="" distancia="" unifrac="" no="" ponderados="" (figura="" 4g)="" indicaron="" que="" las="" muestras="" de="" suelo="" de="" microbiomas="" bacterianos="" de="" diferentes="" ecotipos,="" excepto="" ym1="" y="" hj3,="" estaban="" bien="" agrupadas.="" el="" agrupamiento="" de="" árboles="" de="" diversidad="" de="" distancia="" de="" bray="" basado="" en="" los="" resultados="" del="" algoritmo="" de="" agrupamiento="" único="" (figura="" 4h)="" de="" las="" muestras="" de="" suelo="" de="" los="" tres="" ecotipos="" demostró="" que="" las="" muestras="" de="" pastizales,="" excepto="" ym2,="" estaban="" agrupadas="" estrechamente,="" las="" muestras="" de="" suelo="" de="" estepa="" desértica,="" excepto="" ja1,="" estaban="" agrupadas="" estrechamente,="" y="" las="" muestras="" de="" suelo="" del="" desierto="" de="" grava="" estaban="" muy="">

3.4. Detección diferencial de microbiomas de tres ecotipos de C. salsa.

Los mapas de calor de las abundancias de diferentes géneros (Figura 5a) indicaron que la abundancia de género de las muestras de la estepa del desierto era diferente de la de las muestras de los otros dos ecotipos. Como se muestra en los resultados de

LEfSe (Figura 5c) y RF (Figura 5d), el minimapa de calor a la derecha indica la abundancia de las características microbianas en los tres ecotipos a nivel de género. Los géneros que pueden representar el ecotipo estepa desértica incluyen Gillisia, Illumatobacter, Salegentibacter, Marinimicrobium, etc. Variibacter es un género simbólico

nivel de género que puede representar el ecotipo del desierto de grava. Los biomarcadores en el ecotipo pastizal contienen Flavisolibacter y Agromyces. Después de combinar los resultados de los dos métodos, se seleccionaron 11 biomarcadores (Tabla S4). La Figura 5b muestra el mapa de calor de la abundancia de 11 biomarcadores.

3.5. Detección del microbioma central y predicción de la función metabólica de los tres ecotipos de C. salsa.

Se trazó un diagrama de Venn (Figura 5e) para las UTO obtenidas de todas las muestras de suelo y los resultados mostraron que los tres ecotipos compartían 1712 UTO. Se adoptó el método de persistencia de la función central en el microbioma del paquete R para identificar el microbioma central en los tres ecotipos de C. salsa. Este microbioma bacteriano central contenía seis OTU y correspondía al 19,64 por ciento del microbioma completo. Con la exclusión de géneros duplicados e indefinidos, estas OTU se clasificaron en seis géneros y sus abundancias se dibujaron en un mapa de calor (Figura 5f).

Los resultados de la predicción funcional (Figura 6, Archivo complementario 2) sugirieron que las vías de metabolismo funcional de los microbiomas del suelo en los tres ecotipos de C. salsa eran idénticas en carbohidratos y que los metabolismos de aminoácidos abundaban entre las vías metabólicas. El transporte de membrana y la transducción de señales también fueron abundantes en el procesamiento de información ambiental.

3.6.Análisis de correlación entre comunidades microbianas y variables bioclimáticas de tres ecotipos de C. salsa.

El análisis redundante del núcleo, la abundancia de microbiomas de biomarcadores y las variables bioclimáticas se realizó a nivel de género, y el nuevo análisis se realizó sobre la base de los efectos. La interpretación ajustada de la varianza fue del 32,5 por ciento. La precipitación del trimestre más cálido (bio18) explicó el 23,9 por ciento de las comunidades microbianas (p=0,07). La temperatura media del cuarto más cálido (bio10) y el rango diurno medio (bio2) se correlacionaron positivamente con Illumatobacter y negativamente con Bacillus (Figura 7a).

Se realizó un análisis de correlación para el núcleo, la abundancia de microbiomas biomarcadores y siete variables bioclimáticas. Los resultados de la red de correlación (Figura 7b) revelaron que Illumatobacter y Salegentibacter (biomarcadores en la estepa del desierto) estaban significativamente correlacionados positivamente con el rango diurno medio (bio2) y la temperatura media del trimestre más cálido (bio10) pero significativamente negativamente correlacionados con la altitud ( alt) y precipitación del trimestre más cálido (bio18). Por el contrario, Agromyces (biomarcador en el pastizal) se correlacionó positivamente con la altitud (alt) y la precipitación del trimestre más cálido (bio18), pero se correlacionó negativamente con la amplitud diurna media (bio2) y la temperatura media del trimestre más cálido (bio10). Además, Arthrobacter (microbioma central) se correlacionó significativamente negativamente con el rango diurno medio (bio2) y la temperatura media del trimestre más cálido (bio10). Rubrobacter se correlacionó de forma positiva y significativa con la precipitación anual (bio12).